Einzelzell-V(D)J- und CITE-Seq: Integration der Immunrepertoire-Profilierung und Multi-Omics auf Einzelzellauflösung

Ein einzelner Tropfen in einem 10x Chromium-Chip kann jetzt vier Schichten von Informationen aus einer Zelle erfassen: das vollständige Transkriptom, gepaarte TCR- oder BCR-Sequenzen, die Oberflächenproteinabundanz für Dutzende von Markern und die Antigenbindungs-Spezifität – alles indiziert mit demselben Zellbarcode. Diese Konvergenz von Modalitäten, ermöglicht durch die Integration von V(D)J-Sequenzierung und CITE-Seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing) in die 10x Genomics Single Cell Immune Profiling-Plattform, hat die Art und Weise, wie Immunologen die adaptive Immunität untersuchen, revolutioniert. Eine T-Zelle wird nicht mehr nur durch ihr Transkriptom definiert – sie wird durch den Klonotyp, den sie exprimiert, die Zytokinrezeptoren auf ihrer Oberfläche, die Transkriptionsfaktoren in ihrem Zellkern und, wenn BEAM (Barcode Enabled Antigen Mapping) hinzugefügt wird, den Peptid-MHC-Komplex, den sie erkennt, definiert. Dieser Leitfaden behandelt die V(D)J- und CITE-Seq-Workflows, von der Probenvorbereitung und dem Design des Panels bis hin zur Datenintegration und biologischen Interpretation.

Abbildung 1: V(D)J + CITE-Seq multimodaler Arbeitsablauf — Von der Einzelzell-Suspension zum Vier-Schichten-Datenoutput

V(D)J-Sequenzierung — Entschlüsselung des adaptiven Immunspektrums

Das adaptive Immunsystem speichert sein Gedächtnis in der DNA. Während der Entwicklung von Lymphozyten durchlaufen T- und B-Zellen die V(D)J-Rekombination — einen standortspezifischen somatischen Rekombinationsprozess, der variable (V), Diversitäts (D) und Verbindungs (J) Genabschnitte zu einem funktionalen Antigenrezeptor-Gen zusammenfügt. Die durch diesen Prozess erzeugte kombinatorische Vielfalt, verstärkt durch junctionale Diversifizierung (Nukleotiddeletion und N-Nukleotidaddition an Segmentübergängen), produziert ein theoretisches Repertoire von über 10^15 einzigartigen Rezeptoren, was die etwa 10^12 Lymphozyten im menschlichen Körper in den Schatten stellt. Die Einzelzell-V(D)J-Sequenzierung erfasst diese Vielfalt Zell für Zell und bewahrt die native Paarung der Rezeptorketten, die bei der Bulk-Repertoire-Sequenzierung unwiderruflich durcheinandergebracht wird.

Der 10x Genomics Chromium Single Cell Immune Profiling Workflow, der die Chemie 5' v2 oder v3 verwendet, reichert vollständige V(D)J-Transkripte über Zielanreicherungsprimer an, die an die konstanten Regionen von TCR- und BCR-Transkripten binden. Innerhalb jedes GEM (Gelperle in Emulsion) werden mRNA und V(D)J-Transkripte aus derselben Zelle von derselben Gelperle erfasst, die einen gemeinsamen 10x Zellbarcode teilen. Nach der reversen Transkription wird die V(D)J-Bibliothek durch PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch für die konstanten Regionen der TCR α/β oder BCR schweren/leichten Ketten sind, angereichert. Die resultierende Bibliothek liefert gepaarte, vollständige Rezeptorsequenzen — beide Ketten aus derselben Zelle, wobei die native α-β- oder schwere-leichte Paarung erhalten bleibt, die die Antigenspezifität bestimmt. Eine Sequenzierung mit 5.000 Lese-Paaren pro Zelle ist typischerweise ausreichend für eine zuverlässige Klonotypen-Zusammenstellung, obwohl eine tiefere Sequenzierung (10.000 bis 25.000 Reads pro Zelle) die Erkennung seltener Klonotypen und die Bestimmung somatischer Hypermutation in BCR-Sequenzen verbessert.

Die wichtigsten Kennzahlen, die aus einem Einzelzell-V(D)J-Datensatz einschließlich der Klonotypfrequenz (welcher Anteil der Zellen jeden einzigartigen Rezeptor exprimiert), klonaler Expansion (welche Klonotypen über dem naiven Basisniveau angereichert sind), Repertoire-Diversität (Shannon-Entropie oder umgekehrter Simpson-Index zur Messung der Gleichmäßigkeit der Klonotypverteilung) und somatischer Hypermutationslast (für BCRs die Anzahl der Nukleotid-Substitutionen im Verhältnis zur Keimbahn, die mit der Affinitätsreifung korreliert). Für T-Zellen ist die komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3) - der variabelste Teil des Rezeptors an der V(D)J-Grenze - der Hauptfaktor für die Antigen-Erkennung, und die Verteilung der CDR3-Längen sowie die Aminosäurezusammensetzung sind standardisierte Repertoire-Level-Metriken, die verwendet werden, um Immunzustände unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

Abbildung 2: TCR- und BCR-Klonotypenassemblierung — Paarige Kettenaufnahme, CDR3-Identifizierung und Nachweis der klonalen Expansion

CITE-Seq — Oberflächenproteomik trifft Transkriptomik

Transkriptionsprofile allein können die Identität von Immunzellen nicht vollständig aufklären. Eine CD8+ effector memory T-Zelle und eine CD8+ erschöpfte T-Zelle teilen sich transkriptionale Programme, unterscheiden sich jedoch in der Expression von Oberflächenproteinen auf funktionell entscheidende Weise — die Proteinlevel von PD-1, TIM-3 und LAG-3 definieren Erschöpfung besser als ihre Transkripte, die einer posttranskriptionalen Regulation unterliegen. CITE-Seq schließt diese Lücke, indem es oligonukleotidkonjugierte Antikörper verwendet — kommerzialisiert als TotalSeq von BioLegend — die anstelle eines Fluorophors einen DNA-Barkode tragen. Zellen werden mit einem Cocktail von TotalSeq-Antikörpern gefärbt, bevor sie in den 10x Chromium-Chip eingeschlossen werden. Innerhalb jedes GEM werden sowohl die polyadenylierten mRNA als auch die von Antikörpern abgeleiteten Tag (ADT)-Oligos erfasst und revers transkribiert, wodurch zwei unterschiedliche Bibliotheken aus denselben Einzelzellen erzeugt werden: eine Genexpressionsbibliothek (GEX) und eine ADT-Bibliothek.

Der praktische Vorteil besteht darin, dass die Oberflächenproteinentdeckung über ADTs nicht denselben technischen Einschränkungen unterliegt wie die transkriptbasierte Immunophenotypisierung. Niedrig exprimierte Transkripte wie die, die CD25 (IL2RA) oder CD127 (IL7R) kodieren, können nur eine Handvoll UMIs pro Zelle erzeugen — nahe der stochastischen Nachweisgrenze — während das entsprechende ADT-Signal von Oberflächenproteinen oft 10- bis 100-mal höher im Signal-Rausch-Verhältnis ist. Vorgeprüfte TotalSeq-Panels, die 30 bis 200 Marker abdecken, sind mittlerweile Standard, einschließlich des weit verbreiteten TotalSeq Human TBNK-Panels (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD16, CD19, CD45, CD56) und des TotalSeq Universal Cocktails. Für Projekte, die eine 10x Genomics-basiertes Einzelzell-ImmunprofilingDer Standardansatz besteht darin, ein TotalSeq-C-Panel (kompatibel mit 5'-Chemie) mit dem V(D)J-Anreicherungsworkflow zu kombinieren, was aus jeder Zelle drei Datenebenen — Transkriptom, Immunrepertoire und Oberflächenproteom — ergibt.

Cell Hashing ist eine ergänzende Anwendung der gleichen oligo-konjugierten Antikörpertechnologie. Durch das Färben jeder Probe mit einem einzigartigen Hashtag-Oligonukleotid (HTO)-Antikörper, der auf ubiquitär exprimierte Oberflächenmarker wie CD298 oder β2-Mikroglobulin abzielt, können mehrere Proben in einem einzigen 10x-Lane zusammengefasst und rechnerisch demultiplexiert werden. Aktuelle Protokolle unterstützen die Multiplexierung von bis zu 12 bis 14 mit Hashtag gekennzeichneten Proben in einem einzigen 10x-Lane mit ausgewogener Rückgewinnung, was die Kosten für die Bibliotheksvorbereitung pro Probe senkt und Batch-Effekte zwischen Proben, die im selben Lane durchgeführt werden, beseitigt – ein kritischer Aspekt für longitudinale Impfstoffstudien oder die Überwachung von Immuntherapien über mehrere Zeitpunkte hinweg. Für Studien zur immunologischen Profilierung mehrerer Proben, Einzelzell-Datenanalyse die HTO-Demultiplexierung mit der Klonotypenassemblierung und der ADT-Normalisierung integriert, um sicherzustellen, dass das Repertoire und das Oberflächenproteom jeder Zelle korrekt ihrem Ursprungsproben zugeordnet werden, bevor eine nachgelagerte biologische Interpretation erfolgt.

Abbildung 3: CITE-Seq Merkmals-Barcoding-Mechanismus — TotalSeq Antikörperfärbung, GEM-Erfassung und ADT-Bibliothekskonstruktion

BEAM — Hinzufügen von Antigenspezifität zum multimodalen Bild

Der bedeutendste jüngste Fortschritt in der Einzelzellen-Immunprofilierung ist BEAM (Barcode Enabled Antigen Mapping), das eine vierte Ebene — die Antigenspezifität — zu dem bestehenden V(D)J + GEX + ADT-Stack hinzufügt. BEAM verwendet mit Feature-Barcodes konjugierte Antigene: Für T-Zellen (BEAM-T) werden fluoreszenzmarkierte Peptid-MHC-Monomere, die mit dem interessierenden Peptid beladen sind, an DNA-barcodekonjugierte Dextramere gekoppelt; für B-Zellen (BEAM-Ab) wird das Antigenprotein direkt konjugiert. Antigenspezifische Zellen werden durch Fluss-Sortierung vor der Kapselung angereichert, und der BEAM-Barcode wird zusammen mit den V(D)J-, GEX- und ADT-Bibliotheken innerhalb desselben GEM erfasst.

Die Cell Ranger Multi-Pipeline, verfügbar ab Version 7.1 und verfeinert durch Version 8.0 im Jahr 2025, verarbeitet alle vier Bibliothekstypen gleichzeitig. Der Algorithmus zur Antigen-Spezifität verwendet ein Beta-Verteilungsmodell, um jeden Zell-Barcode zu bewerten: (1 − beta.cdf(0.925, Antigen_UMI + 1, Control_UMI + 3)) × 100, was eine Punktzahl von ungefähr 0 bis 100 ergibt, die antigenbindende Zellen von Hintergrundrauschen trennt. Die Punktzahl misst nicht die Bindungsaffinität – sie bewertet, ob der Rezeptor der Zelle über dem negativen Kontrollhintergrund mit dem Antigen assoziiert – aber in Kombination mit gepaarten TCR/BCR-Sequenzen verknüpft sie direkt einen Klonotyp mit seinem entsprechenden Antigen. Diese Fähigkeit ist besonders leistungsstark in der Immunonkologie, wo die Identifizierung der spezifischen TCR-Sequenzen, die ein Tumor-Neoantigen erkennen, die Entwicklung von gentechnisch veränderten TCR-T-Zelltherapien ermöglicht.

Die aktuellen Einschränkungen von BEAM sind erwähnenswert. Es ist inkompatibel mit der GEM-X v3 Chemie und erfordert den veralteten 5' v2 Assay. Die 16 verfügbaren BEAM-Konjugat-Barcodes schränken die multiplexierten Antigen-Panels ein. Und da antigen-spezifische Zellen durch Fluss-Sortierung angereichert werden müssen, müssen die Eingabezellzahl und die Sortierstrategie für jedes interessierende Antigen optimiert werden – ein praktischer Aspekt, der das experimentelle Design von Anfang an beeinflusst. Für Forscher, die eine Antigenspezifitätskartierung benötigen, ohne den vollständigen BEAM-Workflow intern aufzubauen, 10x Einzelzell-Immunprofilierungsdienste Die BEAM-Probenverarbeitung, die Fluss-Sortierungsanreicherung und die Antigenspezifitätsbewertung bieten eine durchgängige Pipeline von sortierten Zellen zu annotierten Klonotyp-Antigen-Paaren.

Analysetools für multimodales Immunprofiling

Das rechnerische Ökosystem für die integrierte V(D)J- und CITE-Seq-Analyse hat sich im Zeitraum 2025-2026 erheblich weiterentwickelt. Die Cell Ranger Multi-Pipeline ist der Ausgangspunkt und übernimmt die Ausrichtung (STAR für GEX, ein maßgeschneiderter Zusammenführungsalgorithmus für V(D)J), die Gruppierung von Klonotypen, die Bewertung der Antigenspezifität und die Erstellung von ADT-Zählmatrizen. Der Loupe V(D)J Browser v5.2 unterstützt die interaktive Erkundung von Klonotypen, die nach Antigenspezifitätsbewertungen gefärbt sind, die Visualisierung von Kettenpaarungen und die aggregierte Analyse über mehrere BEAM-Bibliotheken hinweg – was es ermöglicht, antigenspezifische Klonotypen über Zeitpunkte oder Gewebeabschnitte hinweg zu vergleichen, ohne eine Befehlszeile öffnen zu müssen.

Für die programmatische Analyse bietet das R-Paket scRepertoire ein Seurat-kompatibles Framework zur Visualisierung von Klonotypen, einschließlich der Verfolgung klonaler Expansion, der klonalen Überlappung zwischen Bedingungen und der Berechnung von Diversitätsmetriken. Das Paket unterstützt das direkte Laden von Cell Ranger V(D)J-Ausgaben und integriert sich über Barcode-Abgleich in das Standard-Seurat-Objekt – Klonotypdaten werden als Metadaten-Spalten gespeichert, und Funktionen wie clonalQuant, clonalDiversity und clonalOverlap erzeugen publikationsreife Visualisierungen mit minimalem Code. Das Python-Paket Dandelion (v0.5.7, Januar 2026) integriert BCR/TCR-Analysen mit Scanpy und unterstützt trajektoriebasierte Klonotypanalysen, die Aufforderung somatischer Hypermutation und die Rekonstruktion des Isotypwechsels aus BCR-Sequenzen. MiXCR v4.7 unterstützt die V(D)J-Zusammenstellung und Repertoireanalyse von 10x Chromium-Daten mit speziellen Voreinstellungen für die gepaarte Ketten-Immunprofilierung und deckt den gesamten Workflow – V(D)J-Zusammenstellung, ADT-Zählnormalisierung und gemeinsame Clusterbildung – mit einem einzigen Befehl in der Kommandozeile ab. Für Forscher, die Anforderungen haben maßgeschneiderte bioinformatische Unterstützung für ImmunprofilingDie Fähigkeit, Klonotyp-, Transkriptom- und Oberflächenproteindaten innerhalb eines einheitlichen Analyseframeworks zu integrieren, ist entscheidend, um biologische Bedeutungen aus den Rohzählmatrizen zu extrahieren.

Die Datenintegration über Modalitäten hinweg erfolgt typischerweise mithilfe der gewichteten nächstgelegenen Nachbarn (WNN) Analyse in Seurat v5, die zellspezifische Modalitätsgewichte aus den GEX- und ADT-Modalitäten lernt und ein gemeinsames Nachbarnetzwerk erstellt. Bei der V(D)J-Integration wird die Klonotypeninformation typischerweise als Metadaten überlagert – indem UMAP-Cluster nach Klonotypfrequenz eingefärbt, erweiterte Klonotypen hervorgehoben oder auf antigen-spezifische Zellen, die durch BEAM identifiziert wurden, eingegrenzt werden. Die entscheidende QC-Überlegung bei multimodalen Immunprofilierungen ist, dass jede Modalität ihre eigenen Ausfallmodi hat: V(D)J-Bibliotheken können eine Kette verlieren (was unpaarige Rezeptorsequenzen erzeugt), ADT-Bibliotheken können unter Umgebungsantikörpersignalen leiden, und BEAM-Bibliotheken können falsch-positive Antigenaufrufe aufgrund unspezifischer Dextramer-Bindung erzeugen. Die QC über Modalitäten hinweg – zum Beispiel die Bestätigung, dass eine als antigen-spezifisch identifizierte Zelle durch BEAM auch ein aktiviertes transkriptionales Muster und Oberflächenproteine zeigt, die mit einer kürzlichen TCR-Bindung übereinstimmen – erhöht das Vertrauen, dass die multimodale Annotation echte Biologie widerspiegelt und nicht ein technisches Artefakt.

Abbildung 4: Multimodale Immunprofilierungsanalyse-Pipeline — Von Cell Ranger multi zur integrierten Loupe/Seurat-Visualisierung

Anwendungen in der Immunologie und Arzneimittelentwicklung

Die stärkste Anwendung der kombinierten V(D)J- und CITE-Seq-Technologie liegt in der Immunonkologie, wo die Technologie gleichzeitig drei Fragen zu jeder T-Zelle in einem Tumor beantwortet: welchen Rezeptor sie exprimiert (Klonotyp), welche Proteine sich auf ihrer Oberfläche befinden (Phänotyp) und was sie erkennt (Antigenspezifität mit BEAM). Eine Studie aus dem Jahr 2025, die Tumorinfiltrierende Lymphozyten von Melanom-Patienten profilierte, identifizierte neoantigen-spezifische CD8+ T-Zell-Klonotypen, die auf Proteinebene PD-1, TIM-3, CD39 und CD103 koexprimierten – ein Oberflächenphänotyp, der mit tumorreagierenden, gewebeansässigen Gedächtniszellen übereinstimmt – und verfolgte ihre klonale Expansion nach der Checkpoint-Blockade. Ohne CITE-Seq hätte die gleiche Studie auf transkriptbasierte Schlussfolgerungen zur Proteinexpression angewiesen sein müssen, die nur mäßig (Spearman ρ ≈ 0,5-0,7) mit der tatsächlichen Oberflächenproteinmenge für wichtige Immun-Checkpoint-Moleküle korreliert. Die Integration dieser multimodalen immunprofilierenden Ansätze mit Einzelzell-ATAC-seq fügt die Profilierung der Chromatinzugänglichkeit hinzu, die eine regulatorische Dimension der gleichen Klonotypen ermöglicht – und verknüpft die TCR-Sequenz mit den Bindungsereignissen von Transkriptionsfaktoren, die Erschöpfungs- oder Effektorprogramme antreiben.

Die Impfstoffforschung ist das zweite wichtige Anwendungsgebiet. Längsschnittliche BCR-Repertoire-Profilierung mit gepaartem Oberflächenproteomik kann die antigen-spezifische Klonalausweitung von B-Zellen, Isotypwechsel und die Ansammlung somatischer Hypermutation nach der Immunisierung verfolgen. CITE-Seq-Oberflächenmarker — CD27, CD38, CD138, IgD — ermöglichen eine höhere Auflösung bei der Unterscheidung von Plasmazellen, Gedächtnis-B-Zellen und naiven B-Zellen als alleinige transkriptbasierte Clusterung und ermöglichen eine präzise Isolation von impfstoffantwortenden Populationen. In einem Studienentwurf zu einem SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoff reduzierte die Kombination von V(D)J und CITE-Seq mit Cell Hashing die Kosten pro Probe durch Multiplexing von 12 Zeitpunkten von drei Spendern über zwei 10x-Spuren, während interspurige Batch-Effekte ausgeschlossen wurden, die ansonsten den Vergleich von Zeitpunkten vor und nach der Auffrischung verfälscht hätten.

Forschung zu Autoimmunerkrankungen und die Entdeckung therapeutischer Antikörper stellen aufkommende Anwendungen dar. Bei systemischem Lupus erythematodes können gepaarte BCR-Sequenzierung und Oberflächenphänotypisierung autoreaktive B-Zell-Klonotypen basierend auf ihrer V-Gen-Nutzung und somatischen Hypermutationsmustern identifizieren und diese dann mit Oberflächenproteinsignaturen verknüpfen, die pathogene von Begleitpopulationen unterscheiden. Für die Entdeckung therapeutischer Antikörper ermöglicht die Kombination von BCR-Sequenzierung mit CITE-Seq das Screening von antigen-spezifischen B-Zellen — identifiziert durch BEAM-Ab — nach Oberflächenmarkern, die mit der Sekretion von hochaffinen Antikörpern assoziiert sind (CD27^hi, CD38^hi, CD138+), und priorisiert Klonotypen für rekombinante Expression und funktionale Validierung.

Eine aufkommende Erkenntnis in diesem Bereich ist, dass der primäre Engpass im multimodalen Immunprofiling sich von der Datengenerierung zur Datenintegration verschoben hat. Jede Modalität — Transkriptom, V(D)J, ADT und BEAM — weist unterschiedliche Rauschstrukturen und Batch-Effekte auf, die sich über die Modalitäten hinweg nicht angleichen. Wenn 12 bis 14 Cell-Hashed-Proben zusammengeführt und demultiplexiert werden, propagieren die HTO-Demultiplexierungsfehler in alle nachgelagerten Modalitäten, was bedeutet, dass eine falsch zugeordnete Zelle im Transkriptom auch in den Klonotyp- und Oberflächenprotein-Tabellen falsch zugeordnet ist. Werkzeuge wie Seurat v5 WNN und das Multi-Omics-Faktoranalyse (MOFA)-Framework unterstützen nun die gemeinsame Modellierung von drei oder mehr Modalitäten, indem sie latente Faktoren lernen, die koordinierte Variationen über Transkriptom, Oberflächenproteom und Klonotypraum erfassen. Insbesondere für BEAM-Daten bleibt die Integration von Antigenspezifitätsscores mit der gepaarten TCR-Sequenz und Oberflächenaktivierungsmarkern in eine einheitliche latente Darstellung ein aktives Entwicklungsfeld für Methoden, mit dem Potenzial, Rezeptorsequenz, Proteinphänotyp und Antigenziel in ein einzelnes prädiktives Modell der T-Zell-Funktion zu verknüpfen.

Für Forscher, die multimodale Immunstudien entwerfen, ist eine praktische Empfehlung, festzulegen, welche Modalitäten für den primären Endpunkt wesentlich sind und welche explorativ sind. Eine Studie, deren primäre Auswertung die klonale Expansion nach der Therapie ist, benötigt V(D)J + GEX; die Hinzunahme von CITE-Seq ermöglicht eine tiefere phänotypische Charakterisierung, erhöht jedoch die Kosten für die Zellsequenzierung um 20 bis 30 Prozent. Eine Studie, deren primäre Auswertung die quantitativen Bestimmung von Zelltypen basierend auf Oberflächenproteinen über verschiedene Bedingungen hinweg ist, benötigt CITE-Seq + GEX; die Hinzufügung von V(D)J ist nur dann wertvoll, wenn die biologische Fragestellung das Verfolgen von Klonotypen umfasst. BEAM sollte für Studien reserviert werden, in denen die Antigenspezifität die zentrale biologische Fragestellung ist, da es die Anforderungen an die Legacy 5' v2 Chemie, die individuelle BEAM-Konjugatvorbereitung und die Fluss-Sortierung zur Anreicherung hat. Die Probenvorbereitung für BEAM-Experimente sollte konservativ geplant werden: Antigen-spezifische Vorläuferfrequenzen liegen oft unter 0,1 Prozent in nicht expandierten T-Zell-Populationen, was bedeutet, dass 5 bis 10 Millionen Gesamtzellen benötigt werden könnten, um nach dem Sortieren einige hundert antigen-spezifische Zellen zurückzugewinnen – ein Aspekt, der sich direkt auf die Gewebeentnahme und die Probenverteilung auswirkt. Für einen umfassenderen Überblick darüber, wie Einzelzell- und räumliche Technologien in eine einheitliche experimentelle Strategie passen, siehe unseren Hub-Leitfaden zu Einzelzell- und räumliche Biologiedienstleistungen.

Abbildung 5: Anwendungen von V(D)J und CITE-Seq — Immuno-Onkologie, Impfstoffforschung und Entdeckung therapeutischer Antikörper

Häufig gestellte Fragen

Was ist der Unterschied zwischen 5'- und 3'-Einzelzellchemie für die Immunprofilierung?

Die 5'-Chemie erfasst Transkripte vom 5'-Ende und umfasst V(D)J-Anreicherungsprimer, die auf die konstanten Regionen von TCR- und BCR-Transkripten abzielen, was sie zur erforderlichen Chemie für das Immunrepertoire-Profiling macht. Die 3'-Chemie erfasst vom Poly(A)-Schwanz und unterstützt keine V(D)J-Anreicherung, bietet jedoch eine höhere transkriptomische Sensitivität für die Genexpressionsanalyse. Für die kombinierte V(D)J + CITE-Seq ist die 5'-v2-Chemie mit TotalSeq-C-Antikörpern der Standardworkflow.

Wie viele Oberflächenproteine kann ich mit CITE-Seq profilieren?

Aktuelle TotalSeq-Panels unterstützen bis zu 200 Marker gleichzeitig, obwohl die meisten Studien 30 bis 50 Antikörper verwenden, die sich auf die Immunlinien und funktionalen Marker konzentrieren, die für ihre biologische Fragestellung relevant sind. Die praktische Grenze wird durch die Verfügbarkeit von Antikörpern, das design von spektral überlappungsfreien Barcodes und die abnehmenden Erträge beim Hinzufügen von Markern, die die Zelltypdiskriminierung über das hinaus, was das Kernpanel bereits bietet, nicht verbessern, festgelegt.

Was ist Cell Hashing und wann sollte ich es verwenden?

Cell Hashing verwendet oligonukleotid-konjugierte Antikörper gegen ubiquitär exprimierte Oberflächenmarker (CD298, β2-Mikroglobulin), um jede Probe vor dem Pooling mit einem einzigartigen Barcode zu kennzeichnen. Es ermöglicht das Multiplexing von bis zu 14 Proben in einem einzigen 10x-Lane, wodurch die Kosten pro Probe gesenkt und Batch-Effekte eliminiert werden. Verwenden Sie es für Studien mit mehreren Proben, mehreren Bedingungen oder mehreren Zeitpunkten, bei denen eine Batch-Korrektur die Analyse ansonsten komplizieren würde.

Kann ich V(D)J-Sequenzierung an nicht-menschlichen/nicht-Maus-Spezies durchführen?

Die 10x V(D)J-Anreicherungsprimer sind für die konstanten Regionen von Mensch und Maus konzipiert. Kreuzreaktivität wurde für einige nicht-menschliche Primaten- und Rattenproben berichtet, aber die meisten nicht-modellhaften Arten erfordern ein maßgeschneidertes Primerdesign, das auf die konstanten Regionen ihrer TCR/BCR-Loci abzielt. Für jede nicht-standardisierte Art konsultieren Sie bitte den Dienstleister bezüglich der Machbarkeit maßgeschneiderter Primer, bevor Sie Proben einreichen.

Was ist die minimale Anzahl an Zellen, die für V(D)J-Sequenzierung benötigt wird?

Für eine aussagekräftige Analyse der Klonotypenvielfalt wird eine Mindestanzahl von 5.000 bis 10.000 viablen T- oder B-Zellen empfohlen, obwohl klonale Expansion – bei der einige dominante Klonotypen einen großen Teil des Repertoires einnehmen – bereits mit so wenigen wie 1.000 Zellen nachgewiesen werden kann. Für seltene Populationen wie antigen-spezifische T-Zellen (vor der Anreicherung) werden höhere Eingangszahlen (50.000 bis 100.000 Gesamtezellen) empfohlen, um eine angemessene Repräsentation der interessierenden Population sicherzustellen.

Wie vergleicht sich CITE-Seq mit der Durchflusszytometrie zur Detektion von Oberflächenproteinen?

CITE-Seq erkennt Oberflächenproteine über DNA-Barcodes anstelle von Fluoreszenz und ermöglicht die gleichzeitige Messung von 30 bis 200 Markern – weit mehr als die etwa 18 bis 30 Parameter, die mit spektraler Durchflusszytometrie erreichbar sind. Allerdings zerstört CITE-Seq die Zelle und kann keine lebenden Populationen sortieren. Die beiden Technologien sind komplementär: Durchflusszytometrie für die Isolation und Sortierung lebender Zellen, CITE-Seq für die Entdeckung von Hochparametern und die Integration mit transkriptomischen und Repertoire-Daten.

Welche Sequenzierungstiefe wird für kombinierte V(D)J + CITE-Seq empfohlen?

Genexpressionsbibliothek: 20.000 bis 25.000 Lese-Paare pro Zelle. V(D)J-Bibliothek: 5.000 bis 10.000 Lese-Paare pro Zelle. ADT-Bibliothek: 5.000 bis 10.000 Lese-Paare pro Zelle. Für BEAM-Antigen-Capture-Bibliotheken, 5.000 Reads pro Zelle. Bei 10.000 Zellen pro Probe beträgt die gesamte Sequenzierung ungefähr 350 bis 500 Millionen Lese-Paare.

Wie lange dauert es, ein V(D)J + CITE-Seq-Projekt abzuschließen?

Die Probenverarbeitung durch den Aufbau der Bibliothek erfordert typischerweise 2 bis 3 Wochen, und die Sequenzierung 1 bis 2 zusätzliche Wochen. Die vollständige bioinformatische Analyse — einschließlich der Klonotypen-Zusammenstellung, ADT-Normalisierung, multimodaler Clusterung und Antigenspezifitätsbewertung — fügt 2 bis 4 Wochen hinzu.

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Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.