AAV-Genomsequenzierung

Was ist das AAV-Genom?

Das Genom des AAV (Adeno-assoziierten Virus) ist ein kleines, aber hochfunktionales einzelsträngiges DNA-Molekül (ssDNA), das etwa 4,7 Kilobasen (kb) umfasst. Dieses kompakte genetische Paket ist geschickt mit mehreren wichtigen Merkmalen gestaltet:

• Inversierte terminale Wiederholungen (ITRs)An beiden Enden des Genoms gelegen, sind diese repetitiven Sequenzen entscheidend für den Lebenszyklus des Virus. Sie bilden charakteristische Haarnadelstrukturen, die für den Replikationsprozess und die Verpackung des viralen Genoms von wesentlicher Bedeutung sind. Diese ITRs spielen auch eine Schlüsselrolle bei der Integration der viralen DNA in das Genom der Wirtszelle.
• Rep-GeneDie Rep (Replikation) Gene kodieren für Proteine, die für die Replikation des AAV-Genoms und die Regulierung seines Lebenszyklus unerlässlich sind. Diese Proteine sind an der Herstellung von Kopien der viralen DNA beteiligt und können auch dabei helfen, das genetische Material des Virus in das Genom des Wirts zu integrieren, wodurch sichergestellt wird, dass das Virus effektiv bestehen und sich verbreiten kann.
• Cap-GeneDie Cap-Gene produzieren die Proteine, die die schützende äußere Hülle des Virus, das Kapsid, bilden. Diese Kapsidproteine sind nicht nur strukturelle Komponenten; sie bestimmen die Fähigkeit des Virus, spezifische Zelltypen zu infizieren. Sie tragen auch zur Stabilität des Virus und seiner Effizienz bei, sein genetisches Material zu übertragen.
• Regulatorische RegionenDiese Regionen steuern die Expression der Rep- und Cap-Gene. Sie fungieren wie Verkehrsleiter und stellen sicher, dass die Produktion von Virusproteinen zur richtigen Zeit und in den richtigen Mengen während des Lebenszyklus des Virus erfolgt.

Was ist NGS-Sequenzierung von AAV?

NGS (Next Generation Sequencing)Next-Generation Sequencing) von AAV bietet einen tiefen Einblick in das virale Genom und enthüllt eine Fülle von Informationen über seine Struktur und potenzielle Probleme. Diese hochmoderne Technologie kartiert das gesamte AAV-Genom sorgfältig, identifiziert genetische Varianten, Mutationen und mögliche Verunreinigungen. Solche detaillierten Einblicke sind entscheidend für die Feinabstimmung von AAV-Vektoren, die in der Gentherapie verwendet werden, um sicherzustellen, dass sie sowohl sicher als auch effektiv sind. Darüber hinaus hilft NGS, die genaue Konzentration von AAV in Proben zu bestimmen und die Reinheit der Vektorvorbereitungen zu bestätigen, um sicherzustellen, dass sie frei von unerwünschten viralen oder bakteriellen Elementen sind. Im Wesentlichen ist NGS ein wichtiges Werkzeug, das die präzise Entwicklung, strenge Qualitätskontrolle und erfolgreiche Anwendung von AAV-basierten Gentherapien unterstützt.

Einführung in die AAV-Genomsequenzierung

AAVs sind derzeit einer der am weitesten verbreiteten und bedeutendsten Vektoren für die in vivo Gentherapie. Diese Vektoren können genetische Lasten von bis zu 4,7 kb liefern und können eine Vielzahl von Zelltypen mit minimaler Pathogenität infizieren. Die Produktion von AAVs beginnt mit dem Bau von Plasmiden und endet mit der Verpackung in virale Partikel. Aufgrund der strukturellen Eigenschaften des AAV-Genoms ist die Herstellung von AAV-Viren mit hochpräzisem DNA inhärent herausfordernd. Um diese Komplexitäten zu bewältigen, bietet CD Genomics umfassende AAV-Genom-Sequenzierungs- und Qualitätskontrolllösungen an, die darauf ausgelegt sind, die Qualität von AAV-Vektoren zu optimieren.

Agarose-Gelelektrophorese, PCR/ddPCR und Southern Blotting wurden umfassend zur Bewertung der AAV-Genomgröße und zur Identifizierung spezifischer Regionen eingesetzt. Diese Methoden sind jedoch in ihrer Fähigkeit begrenzt, umfassende Sequenzinformationen und Einblicke in die genomische Integrität zu liefern. Sequenzierungstechniken der dritten Generation, die für ihre Long-Read-Fähigkeiten bekannt sind, wurden als potenzielle Lösungen für die Analyse der Integrität des AAV-Genoms entwickelt. Dennoch erfordert die intrinsische Natur des AAV-Genoms als einzelsträngige DNA (ssDNA) dessen Umwandlung in doppelsträngige DNA vor der Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung der dritten Generation.

Dieser Umwandlungsprozess, zusammen mit den modifizierten Termini in AAV-Genomen, erschwert die präzise Analyse der terminalen Sequenzen. Darüber hinaus zeigen fragmentierte AAV-Genome, die kürzer sind als ihre intakten Gegenstücke, während der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung eine signifikante Verzerrung, was zu einer unverhältnismäßigen Darstellung in Sequenzierungsdatensätzen führt. Folglich liefert die Analyse der Integrität von AAV-Genomen mit Hilfe der Sequenzierung der dritten Generation oft Ergebnisse, die die tatsächliche Integrität unterschätzen, was zu Datenverzerrungen führt. Diese Verzerrung hat schwerwiegende Auswirkungen auf nachfolgende Compliance-Prüfungen und den Arzneimittelzulassungsprozess. Daher ist die Sequenzierung der dritten Generation zwar für die genaue Sequenzanalyse von AAV-Genomen geeignet, jedoch unzureichend für die Bewertung der terminalen Sequenzen und der allgemeinen Genomintegrität.

Angesichts der zunehmenden regulatorischen Anforderungen sind robuste Erkennungsprotokolle und analytische Methoden unerlässlich, um die Sicherheit und Konformität von AAVs zu gewährleisten. CD Genomics hat AAV-Genomsequenzierungs- und Qualitätskontrolldienste auf der Grundlage von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien eingeführt. Durch den Einsatz von Sequenzierung der zweiten Generation (NGS) und dritte Generation (Einzelmolekül-Echtzeit-SequenzierungDurch Sequenzierungsanalysen überprüfen wir die Reinheit von AAV, die Integrität der ITR-Sequenz und die Genauigkeit der Zielsequenz. Unsere Dienstleistungen sind darauf ausgelegt, Kunden in der Entwicklung von Gentherapien dabei zu unterstützen, ihre AAV-Produktionsprozesse zu verbessern und somit die Sicherheit nachfolgender klinischer Studien zu gewährleisten.

Vorteile unseres AAV-Genom-Sequenzierungsdienstes

• Genau ErgebnisseDurch präzise Sequenzierungsmethoden erreichen wir eine vollständige Sequenzierung der ITR-Regionen und identifizieren effizient und genau die Mutationsstellen innerhalb dieser Sequenzen.
• SchnellsequenzierungUnser Ansatz stellt sicher, dass die Sequenzierung der ITR-Regionen zügig durchgeführt wird, was zu verkürzten Bearbeitungszeiten für die Lieferung der Ergebnisse führt.
• Umfassende BeratungsdiensteCD Genomics bietet während des gesamten Projektlebenszyklus kontinuierliche technische Unterstützung, egal ob in der Anfangs-, Zwischen- oder Abschlussphase.
• Compliance-gesteuerte ITR-SequenzierungCD Genomics betreibt voll akkreditierte Labore, die mit modernsten Instrumenten ausgestattet sind und strikt nach Qualitätsmanagementkontrollsystemen und standardisierten Betriebsverfahren (SOPs) arbeiten.

Anwendungen der AAV-Genomsequenzierung

Gentherapieforschung

• Optimierung von AAV-Vektoren
• Bewertung der therapeutischen Ergebnisse

Genomeditierung

• Effizienzanalyse
• Spezifitätsvalidierung

Impfstoffentwicklung

• Optimierung des Liefersystems
• Immunogenitätsbewertung

Grundlagenforschung

• Erforschung des Infektionsmechanismus
• Auswirkungen von viralen Varianten

AAV-Genom-Sequenzierungs-Workflow

Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement nach jedem Verfahren durch, um umfassende und genaue Ergebnisse sicherzustellen. Unser AAV-Sequenzierungsworkflow ist unten aufgeführt, einschließlich Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatischer Analyse.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen gDNA-Probe≥500ng für Illumina-Plattform-Sequenzierung gDNA-Probe ≥5 µg für PacBio-Plattform-Sequenzierung Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina PE150 Plattform, 10 Gb Datenoutput PacBio-Plattform, 7-10K CCS-Lesungen
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Datenqualitätskontrolle Ausrichtung an Plasmidsequenz und Referenzgenom des Wirts Untersuchen der Genomintegrität Heterogenitätserkennung Identifizierung von DNA-Contaminanten Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur AAV-Genomsequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

CD Genomics verwendet die Kurzlese-Whole-Genome-Sequenzierung zur Durchführung der AAV-Genomsequenzierung und integriert Sanger-Sequenzierung und Hochdurchsatzplattformen für umfassende Bewertungen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Genomintegrität, die Erkennung von Heterogenität und die Identifizierung von DNA-Verunreinigungen in AAV-Bibliotheksvorbereitungen. Wir sind bestrebt, unser umfangreiches Fachwissen und modernste Technologie zu nutzen, um überlegene Dienstleistungen und hochwertige Produkte anzubieten, die auf die spezifischen Bedürfnisse unserer Kunden zugeschnitten sind.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Warum AAV für Gentherapie wählen?

AAV hebt sich in der Gentherapie durch sein hohes Sicherheitsprofil, seine geringe Immunogenität, physikalische Stabilität, breites zelluläres Tropismus und verlängerte in vivo-Expression hervor. Diese Eigenschaften machen AAV zu einem der am häufigsten verwendeten Vektoren in diesem Bereich. Der Bau von AAV-basierten Vektoren ist ein Grundpfeiler der Gentherapietechnologie.

Forscher haben umfassende Studien durchgeführt, um AAV-Vektoren zu optimieren. Diese Bemühungen umfassen die Modifizierung der genomischen Struktur des Virusvektors, die Erhöhung seiner Tragfähigkeit, die Verbesserung des viralen Ertrags und die Steigerung der Transduktionseffizienz in verschiedenen Gewebetypen. Solche Modifikationen zielen darauf ab, AAV-Vektoren an die spezifischen Bedürfnisse verschiedener Krankheiten anzupassen.

2. Warum sind die Kosten für AAV so hoch?

• Reinheitsanforderungen für AAV-Vektoren

AAV-Vektoren müssen strengen Reinheitsstandards genügen. Leere virale Kapside können Immunantworten auslösen und mit vollständig verkapselten Vektoren um die Infektion von Patienten-Zellen konkurrieren, was höhere Dosen erforderlich macht, um die therapeutische Wirksamkeit zu erreichen. Diese Erhöhung der Dosis erhöht nicht nur das Risiko von Nebenwirkungen bei hohen Dosen, sondern steigert auch die potenzielle Hepatotoxizität und Karzinogenität. Daher wird die Durchführung einer gründlichen Reinheitsvalidierung nach dem Bau von AAV-Vektoren zu einem wesentlichen Schritt.

• Hohe Mutationsraten in spezifischen ITR-Strukturen

Das AAV-Genom ist an beiden Enden von inversen terminalen Wiederholungssequenzen (ITRs) flankiert, die entscheidend für die Verpackung und Replikation von rAAV sind. Die ITR-Regionen in AAV-Plasmiden sind jedoch aufgrund ihrer palindromischen Sequenzen und des hohen GC-Gehalts instabil, was sie während der bakteriellen Replikation anfällig für Mutationen oder Deletionen macht. Selbst bei den am stärksten standardisierten experimentellen Protokollen können AAV-Plasmide Mutationsraten von 5 % bis 15 % aufweisen.

• Herausforderungen bei der ITR-Erkennung

Angesichts der hohen Frequenz von ITR-Mutationen ist es entscheidend, die Integrität der ITR-Regionen in Plasmiden vor der viralen Verpackung zu bewerten. Diese Regionen sind jedoch reich an palindromischen Sequenzen, die stabile Sekundärstrukturen bilden können. Während der Sanger-Sequenzierung können diese stabilen Haarnadel-Schleifen die PCR-Amplifikation hemmen, was zu Unterbrechungen bei der Sequenzierung führt und die Validierung der Sequenz erschwert. Ebenso kann die herkömmliche Methode mit Restriktionsenzymen unter Verwendung von SmaI zur Überprüfung der ITR-Integrität unzureichend sein, da kleinere Deletionen durch Gelelektrophorese möglicherweise unentdeckt bleiben.

3. Was sind die Vorteile der Verwendung von AAV als Vektor für die Gentherapie?

AAV hat mehrere Vorteile, darunter eine geringe Immunogenität, ein breites Wirtsspektrum, stabile physikochemische Eigenschaften und eine langfristige Expression exogener Gene.

Konkret sind diese Vorteile:

• Hohes SicherheitsprofilAAV ist im Allgemeinen nicht pathogen für Menschen oder kann nur sehr milde Symptome verursachen.
• Zielgerichtete IntegrationAAV kann spezifisch in die AAVS1-Stelle auf dem menschlichen Chromosom 19 integrieren, was das Risiko von insertionsbedingter Mutagenese verringert, das mit der zufälligen Integration anderer viraler Vektoren verbunden ist.
• Nachhaltige GenexpressionAAV-vermittelte Gentransfersysteme ermöglichen eine anhaltende und stabile Expression der eingeführten Gene, die durch umgebende genetische Elemente reguliert werden kann.
• Breite Host-ReichweiteAAV kann eine Vielzahl von Zelltypen infizieren, einschließlich sowohl sich teilender als auch nicht sich teilender Zellen.
• Thermische und chemische StabilitätDas AAV-Transfer-System zeigt eine signifikante thermische Stabilität und Widerstandsfähigkeit gegenüber sauren und alkalischen Bedingungen sowie organischen Lösungsmitteln, was es praktisch für die Lagerung macht.

Die Sequenzierung der Genompopulation von adenoassoziierten Viren erreicht eine vollständige Auflösung des Vektorgenoms und zeigt menschliche-Vektor-Chimären.

Journal: Molekulare Therapie Methoden & Klinische Entwicklung

Impactfaktor: 4,771

Veröffentlicht: 27. Februar 2018

Hintergrund

Rekombinante adeno-assozierte Viren (rAAVs) erfordern eine präzise Qualitätskontrolle für die Gentherapie. Traditionelle Methoden wie qPCR und Gelelektrophorese erfassen nicht vollständig die Genomfragmentierung oder Kontamination. Einzelmolekül-Echtzeit (SMRT) Sequenzierung bietet einen detaillierten Überblick über sowohl vollständige als auch verkürzte rAAV-Genome und zeigt Fehler bei der Genomverpackung sowie Kontaminationen durch Wirtszell- oder Virusfragmente auf. Diese fortschrittliche Technik ermöglicht eine umfassende Analyse von rAAV-Vektorpopulationen.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

AAV-GPseq verwendet SMRT-Sequenzierung, um vollständige scAAV-Genome von den 5'- zu den 3'-ITRs zu analysieren. Es zeigt, dass shRNA-Kassetten zu kürzeren Genomen führen und ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der ITR-Orientierungen sowie der Plus-/Minus-Strang-Verhältnisse, was Einblicke in die Verpackung und Replikationsdynamik von AAV-Vektoren bietet.

Abbildung 1. Einzelpartikelauflösungsprofilierung von scAAV-Genomen durch AAV-Gpseq.

AAV-GPseq zeigt, dass die meisten Vektorgenom-Lesevorgänge kürzer als 500 bp sind, was von der Gelanalyse abweicht. Durch die Verwendung von Spike-in-DNA zur Normalisierung quantifiziert es genau die Voll-Längen- versus die verkürzten Genome. Diese Methode zeigt, dass Voll-Längen-Vektoren weniger verbreitet sind, als es die traditionellen Gel-Ergebnisse nahelegen.

Abbildung 2. Bewertung der Häufigkeit heterogener AAV-Genom-Populationen.

AAV-GPseq erkennt Plasmid-Rückgratsequenzen in Vektorgenomen, indem es Reads offenbart, die über die ITR-Regionen hinausgehen. Diese Methode identifiziert Reads, die mit Plasmid-Rückgratsequenzen übereinstimmen, was auf das Vorhandensein von rückverpackten oder größeren als einheitlichen Genomen hindeutet. Die Analyse bestätigt auch, dass viele kurze Genome, die unter 500 bp liegen, ITR-Sequenzen enthalten, jedoch in gereinigten Vektormustern nicht in nachweisbaren Mengen vorhanden sind.

Abbildung 3. Ausrichtungen heterogener Vektorpopulationen auf das pCis-Plasmid-Referenz.

Schlussfolgerung

Traditionelle Methoden zur Bewertung der Integrität von rAAV-Vektoren sind in der Profilierung einzelner Genome eingeschränkt. AAV-GPseq verbessert dies, indem es Genome von ITR zu ITR analysiert und chimäre Sequenzen sowie Plasmid-Rückgrate offenbart. Trotz seiner Stärken gibt es Herausforderungen, darunter die Unterrepräsentation längerer chimärer Sequenzen und Einschränkungen bei einzelsträngigen AAVs. Insgesamt verbessert AAV-GPseq die Qualitäts- und Sicherheitsbewertung von Gentherapievektoren.

Referenz

1. Tai P W L, Xie J, Fong K, et al. Die Sequenzierung der Genompopulation von adenoassoziierten Viren erreicht eine vollständige Auflösung des Vektorgenoms und zeigt menschlich-Vektor-Chimären. Molekulare Therapie-Methoden & Klinische Entwicklung, 2018, 9: 130-141.