Richtlinien zur Einreichung von Proben
Was ist die multiplex ligationsabhängige Sondenamplifikation (MLPA)?
Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) ist eine weit verbreitete molekularbiologische Technik zur Erkennung der Kopienzahl verschiedener DNA-Sequenzen in der Forschung zu menschlichen genetischen Erkrankungen. Diese Technik umfasst die Ligation von Sonden-Oligonukleotiden, gefolgt von einer PCR-Amplifikation, die die Analyse von bis zu 50 multiplexen Sondenpaaren ermöglicht, die für die Hybridisierung mit spezifischen Zielorten entworfen wurden.
Jedes Sondenpaar ist so konzipiert, dass es Amplifikationsprodukte einer bestimmten Länge erzeugt. Durch die Einbeziehung universeller Sequenzen an ihren Enden können alle ligierten Sonden in einer einzigen PCR-Reaktion mit einem Primerpaar amplifiziert werden. Der vorwärts gerichtete PCR-Primer ist mit einem fluoreszierenden Tag von Applied Biosystems™ 6-FAM™ gekennzeichnet, was die Detektion und Quantifizierung basierend auf den molekularen Größen der Sonden ermöglicht, wie sie durch automatisierte Kapillarelektrophorese (CE) bestimmt werden.
Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) Prozess visualisiert in drei Schritten: 1) Denaturierung & Hybridisierung, 2) Ligation, 3) Amplifikation mit fluoreszierenden PCR-Primer zur Erkennung von Kopienzahlvariationen.
Dieses Verfahren wurde erfolgreich in der Untersuchung von Krankheiten eingesetzt, die durch Exon-Deletionen und -Duplikationen verursacht werden, wie z. B. der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und Mutationen der BRCA1/BRCA2-Gene. Darüber hinaus ermöglichen Fortschritte in der MLPA-Technik nun deren Anwendung in der quantitativen Methylierungsanalyse verschiedener genomischer Sequenzen.
Warum MLPA wählen?
MLPA wird aufgrund seiner präzisen, hochdurchsatzfähigen Analyse, selbst mit begrenzten DNA-Proben, bevorzugt. Im Gegensatz zur traditionellen PCR kann MLPA mehrere genetische Loci gleichzeitig testen, was es zu einer kosteneffektiven und zuverlässigen Lösung zur Erkennung genetischer Abnormalitäten macht. Es ist auch empfindlicher als andere Multiplex-PCR-Methoden und bietet eine bessere Erkennung von Kopienzahlvariationen (CNVs).
MLPA kombiniert die Hybridisierung von DNA-Sonden mit PCR-Technologie und bietet folgende Vorteile:
- Hohe EffizienzEine einzelne Reaktion kann Kopienzahlvariationen in bis zu 50 Zielsequenzen nachweisen.
- Schnelle BearbeitungVollständige Experimente können innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden.
- Betriebliche EinfachheitVerschiedene Reagenzkit folgen nahezu identischen Verfahren, wodurch die Technik leicht zu erlernen und zu beherrschen ist.
Technischer Vergleich: MLPA und alternative genetische Analysemethoden
| Parameter | MLPA | qPCR | ddPCR | Sanger-Sequenzierung | Gezielte NGS | WES | WGS | CGH-Mikroarray |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Multiplex-Ebene | Bis zu 50 Ziele | Wenig | Wenig | N/A | Dutzende–Hunderte | Tausende | Ganzes Genom | genomweit |
| Hauptzweck | CNV-Erkennung | Quantifizierung | Quantifizierung | Validierung von Sequenzvarianten | Variantenerkennung (Panel) | Exon-Varianten | Alle Varianten & SV | CNV genomweite |
| Empfindlichkeit für CNV | Hoch | Moderat | Sehr hoch | Niedrig | Hoch | Mittel | Hoch | Hoch |
| Punktmutationsdetektion | Nein | Selten | Begrenzt | Ja | Ja | Ja | Ja | Nein |
| Benötigte Ausrüstung | PCR + CE | qPCR-Gerät | ddPCR-Gerät | Sanger-Sequenzierer | NGS-Gerät | NGS | NGS | Mikroarray-Scanner |
| Durchsatz | Mittel | Niedrig | Niedrig | Niedrig | Medium | Mittel | Hoch | Hoch |
| Quantitative Genauigkeit | Gut | Variable | Ausgezeichnet | n/a | Gut | Gut | Gut | Gut |
| Durchlaufzeit | ~1 Tag | ~1 Tag | ~1 Tag | ungefähr 1 Woche | ~1–2 Wochen | ~2–4 Wochen | ~3–6 Wochen | ~2–3 Wochen |
| Kosten | Niedrig | Niedrig | Mittel | Mittel | Medium | Hoch | Höchste | Hoch |
Anwendungen von MLPA
MLPA ist eine vertrauenswürdige Methode zur Erkennung genetischer Variationen mit hoher Sensitivität und findet Anwendung in verschiedenen Forschungs- und klinischen Bereichen. Sie ermöglicht es Forschern, strukturelle Variationen im Genom zu analysieren und bietet Einblicke in genetische Störungen und Krankheitsmechanismen. Diese vielseitige Technologie unterstützt eine breite Palette wissenschaftlicher Fragestellungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf:
- Erkennung von kleinräumigen Genumstellungen:
Validierte Gene umfassen BRCA1, BRCA2, MSH2, MLH1, DMD, APC, SMA, NF1, NF2, VHL, TSC1/2 usw.
- Erkennung von großflächigen genomischen Umstellungen:
Validierte Störungen umfassen das Williams-Syndrom, das Prader-Willi/Angelman-Syndrom, das DiGeorge-Syndrom, das Cri-du-Chat-Syndrom, die Pelizaeus-Merzbacher-Krankheit, CMT1A und HNPP.
- Subtelomere Kopienzahlvariationen
- Chromosomale Aneuploidie-Tests
- Tumor-Diagnoseforschung:
DNA-Kopienzahlanalyse bei malignen Erkrankungen wie akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), Oligodendrogliomen, Melanomen und Neuroblastomen.
- Quantitative Methylierungsanalyse
Anwendungen umfassen das Prader-Willi/Angelman-Syndrom, das Beckwith-Wiedemann-Syndrom, MGMT, MLH1, das Fragile-X-Syndrom und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen.
- mRNA-Expressionsanalyse:
Fokussierung auf Gene, die an Apoptose und der Entzündungsreaktion beteiligt sind.
Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikationsassay-Service-Workflow
Bei CD Genomics bieten wir einen optimierten, durchgängigen MLPA-Service an, um konsistente, hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Unser standardisierter Arbeitsablauf ist darauf ausgelegt, die Reproduzierbarkeit zu unterstützen und die Entdeckung in genomischen Studien zu beschleunigen.
1. Probeneinreichung
Reichen Sie Ihre DNA-Proben ein, einschließlich Gewebe, Blut oder Zelllinien. Unser Team stellt sicher, dass sie die Qualitätsstandards für die Analyse erfüllen.
2. DNA-Extraktion und Qualitätskontrolle
Falls erforderlich, bieten wir DNA-Extraktionsdienste an und führen Qualitätsprüfungen durch, um eine optimale DNA-Qualität für MLPA sicherzustellen.
3. Probe-Hybridisierung und Ligation
Sonden werden an Ihre DNA hybridisiert und an Zielregionen für die CNV-Analyse ligiert.
4. PCR-Amplifikation
Mehrere DNA-Regionen werden gleichzeitig mit fluoreszierenden Primern amplifiziert, was eine effiziente CNV-Erkennung ermöglicht.
5. Kapillarelektrophorese
Die amplifizierten Produkte werden durch Kapillarelektrophorese analysiert, um eine genaue CNV-Quantifizierung zu ermöglichen.
6. Datenanalyse und Berichterstattung
Wir bieten detaillierte statistische und Annotationsberichte sowie grafische Ergebnisse zur einfachen Interpretation an.
Musteranforderungen für MLPA
| Parameter | Anforderungen |
|---|---|
| Gewebe | Frisch gefrorenes Gewebe ≥ 100 mg, FFPE ≥ 4 Schnitte, 5~20 µm |
| Blutprobe | ≥ 2~4 mL Blut im EDTA-Röhrchen |
| Zelllinie | ≥ 1 x 10^6 Zellen |
| DNA | ≥ 500 ng, OD260/280 so nah wie 1,8~2,0 |
Tipps:
- Versenden Sie Proben auf blauer Eis oder Trockeneis, um die Integrität zu bewahren.
- DNA-Extraktionsdienste auf Anfrage verfügbar.
- Für spezielle Probenarten oder Szenarien mit geringem Input kontaktieren Sie uns für einen maßgeschneiderten Plan.
Warum CD Genomics für MLPA-Dienste wählen?
CD Genomics bietet einen umfassenden MLPA-Service mit fachkundiger Unterstützung, schnellen Ergebnissen und zuverlässigen Daten. Unser Team gewährleistet hochwertige Tests unter Verwendung der neuesten Technologie, mit schnellen Bearbeitungszeiten und globaler Unterstützung. Wir folgen strengen Qualitätskontrollen, um genaue und verlässliche Ergebnisse für Ihre Forschungsbedürfnisse zu liefern.
- Expertenteam: Unser Team aus Genetikern und Molekularbiologen sorgt bei jedem Test für hochwertige Ergebnisse.
- Modernste Technologie: Wir verwenden die neuesten MLPA-Plattformen, um genaue und zuverlässige Daten zu gewährleisten.
- Schnelle Bearbeitung: Erhalten Sie Ihren umfassenden MLPA-Bericht zeitnah, damit Ihre Forschung oder klinische Entscheidungsfindung nicht verzögert wird.
- Globale Reichweite: Unterstützung von Kunden weltweit mit Kundenservice in mehreren Zeitzonen.
- Qualitätssicherung: Wir folgen strengen Qualitätskontrollprotokollen, um sicherzustellen, dass unsere Tests die höchsten Standards in Bezug auf Genauigkeit und Zuverlässigkeit erfüllen.
Referenzen:
- de Boer, S., White, S.J. Genotypisierung multiallelischer Kopienzahlvariationen mit multiplex ligationsabhängiger Sondenamplifikation (MLPA). In: Genotypisierung. Springer, New York, NY, 147–153 (2017). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6442-0_9
- Cuevas, D., Velasco, A. et al. Intratumorale Heterogenität im serösen Endometriumkarzinom, bewertet durch gezielte Sequenzierung und multiplexe Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA): eine beschreibende Studie. Histopathologie 75, 724–733 (2019). DOI: 10.1111/his.14001
- Fu, X., Shi, Y., Ma, J. u. a. Fortschritte der multiplex ligationsabhängigen Sondenamplifikationstechnologie in der molekularen Diagnostik. BioTechniken 73, 205–213 (2022). DOI: 10.2144/btn-2022-0017
Demonstrationsergebnisse
Häufig gestellte Fragen
1. Welche Arten von Proben können für MLPA verwendet werden?
Sie können genomische DNA verwenden, die aus verschiedenen Quellen wie Blut, Speichel oder Gewebeproben extrahiert wurde.
Kann MLPA Punktmutationen nachweisen?
MLPA wird hauptsächlich zur Erkennung von Kopienzahlvariationen (Löschungen, Duplikationen) verwendet, kann jedoch in bestimmten Fällen für die Mutationsdetektion angepasst werden.
3. Was sind die Kosten für MLPA-Tests?
Die Kosten für MLPA-Tests variieren je nach Anzahl der analysierten Ziele. Bitte kontaktieren Sie uns für ein Angebot.
Fallstudie: Kombinierte Anwendung von MLPA und Whole-Exome-Sequenzierung (WES) bei einer seltenen neuromuskulären Erkrankung
Referenz
Xia Y., Feng Y., Xu L., Chen X., Gao F., Mao S. (2021). Fallbericht: Whole-Exom-Sequenzierung mit MLPA offenbarte Varianten in zwei Genen bei einem Patienten mit kombinierten Manifestationen von spinaler Muskelatrophie und Duchenne-Muskeldystrophie.. Frontiers in Genetics, Band 12, Artikel 605611. DOI:10.3389/fgene.2021.605611.
1. Hintergrund
Dieser Fall betrifft einen 11 Monate alten männlichen Patienten, der mit einer schlechten motorischen Entwicklung und fortschreitender Muskelschwäche vorstellig wurde. Die klinischen Merkmale ähnelten sowohl Spinale Muskelatrophie (SMA) und Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), die verschiedene neuromuskuläre genetische Störungen sind. Eine genaue genetische Diagnose war entscheidend, da sich die Symptome überschneiden und Auswirkungen auf die Behandlung haben.
2. Methoden
Um die genetische Ursache(n) genau zu bestimmen, verwendeten die Kliniker ein zwei-stufiger genetischer Testansatz:
- Whole-Exom-Sequenzierung (WES) um Sequenzvarianten in allen kodierenden Regionen zu identifizieren.
- Multiplex-Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) spezifisch zu erkennen Kopienzahlvariationen (CNVs) wie z.B. Löschungen in Zielgenen.
MLPA ist eine gut etablierte Methode zur Erkennung von CNVs auf Exon-Ebene, die sich für DMD- und SMA-Loci eignet.
3. Ergebnisse
Die kombinierte Analyse identifizierte:
- Ein homozygote Deletion der Exons 7 und 8 in der SMN1 Gen, übereinstimmend mit SMA.
- Ein Löschung im Exon 50 des DMD GenDiagnose von DMD.
Diese Ergebnisse wurden durch MLPA bestätigt, nachdem die Vorhersagen der WES durchgeführt wurden.
MLPA-Genetests zeigen null Kopien der SMN1 Exons 7 und 8 sowie eine homozygote Deletion des DMD Exons 50 in der Patientenprobe im Vergleich zu Referenzkontrollen.
4. Schlussfolgerungen
Die Integration von MLPA und WES verbesserten die diagnostische Genauigkeit in diesem komplexen Fall, der duale neuromuskuläre Störungen betrifft. Dieser Ansatz hebt den Wert der Kombination von umfassender Variantenerkennung (WES) mit gezieltem CNV-Profiling (MLPA) für eine umfassende genetische Diagnose bei klinisch überlappenden Phänotypen hervor.
