10x Genomics Einzelzell-Sequenzierung

CD Genomics bietet jetzt Einzelzellanalysen mit verschiedenen Lösungen des 10X Genomics Chromium-Systems an, die das Profiling seltener oder heterogener Zellpopulationen ermöglichen.

Die Einführung von 10x-Sequenzierung

Mächtige Ansätze sind zugänglicher geworden, die das Profiling seltener oder heterogener Zellpopulationen ermöglichen. Die Mittelung, die in herkömmlichen 'Bulk'-Sequenzierungsmethoden auftritt, erlaubt keine direkte Bewertung der grundlegenden biologischen Einheit – der Zelle – oder der einzelnen Zellkerne, die das Genom verpacken. CD-Genomik bietet Zugang zur genomischen und genetischen Analyse auf Einzelzellebene unter Verwendung des 10x-Genomiksystems und seiner entwickelten Reagenzliefermethode. Die tropfenbasierten Plattformen des Chromium 10x-Systems, unterstützt durch die GemCode-Technologie, ermöglichen es biomedizinischen Forschern und Klinikern, wichtige neue Entdeckungen mit diesem leistungsstarken Ansatz zu machen, da die Technologien und Werkzeuge für die Durchführung von Einzelzellstudien benötigt werden. Darüber hinaus haben sich die tropfenbasierten Plattformen, die den Durchsatz von Zellen maximieren und gleichzeitig die Reaktionen auf Nanoliter-Volumina verkleinern, als wirksam erwiesen, um die Nachweisempfindlichkeit und quantitative Genauigkeit zu verbessern. Die tropfenbasierten Methoden bieten Vorteile, da sie eine direkte Analyse seltener Zelltypen oder primärer Zellen ermöglichen, für die möglicherweise nicht genügend Material für herkömmliche Bulk-Sequenzierungsprotokolle vorhanden ist. Sie sind auch ideal, um interessante Subpopulationen von Zellen aus einer größeren heterogenen Population zu profilieren, beispielsweise maligne Tumorzellen innerhalb einer Tumormasse oder hyperreaktive Immunzellen innerhalb einer scheinbar homogenen Gruppe. Sie können sogar völlig neue Zelltypen offenbaren. 10X-Genomik ermöglicht auch das Studium zellulärer Zustände in Szenarien wie embryonaler Entwicklung, Krebs, Myoblasten- und Lungenephithel-Differenzierung sowie der Diversifizierung des Schicksals von Lymphozyten.

Kapseln Sie Ihre Probe in Hunderte bis Zehntausende von einzigartig adressierbaren Partitionen in Minuten, von denen jede einen identifizierenden Barcode für die nachgelagerte Analyse enthält. Jede Gelperle, die mit Millionen von barcodierten Oligonukleotiden infundiert ist, wird mit einer Probe gemischt, die hochmolekulare DNA (HMW), einzelne Zellen, Zellkerne oder Zellperlen sein kann. Gelperlen und Proben werden dann einer Öl-Tensid-Lösung hinzugefügt, um Gelperlen in Emulsion (GEMs) zu erzeugen, die als individuelle Reaktionsvesikel fungieren, in denen die Gelperlen gelöst und die Probe barcodiert wird. Die barcodierten Produkte werden für nachgelagerte Reaktionen zusammengeführt, um Bibliotheken zu erstellen, die mit Kurzlesesequenzierern kompatibel sind. Nach der Sequenzierung werden die resultierenden barcodierten Kurzlesesequenzen in schlüsselfertige Analysepipelines eingespeist, die die Barcode-Informationen verwenden, um die Reads auf ihre ursprüngliche HMW-DNA, einzelne Zelle oder einzelnen Ursprungskern zurückzuführen.

Abbildung 1. Schematische Übersicht über den Fragment eines finalen 10x Chromium Genom-Bibliothek

Chromium™ Einzelzell-Genexpressionslösung

Die Maximierung des Durchsatzes von Zellen ist entscheidend, um die Zelltypen aus komplexen Geweben zu identifizieren. Die 10X Genomics Chromium Single Cell Gene Expression Lösung kann verwendet werden, um die Transkriptom-Messung in einzelnen Zellen durchzuführen, wobei die Sequenzierung großer Mengen einzelner Zellen die Komplexität des Bulk-Transkriptoms nachbilden kann. CD Genomics hat sich der Bereitstellung eines hochwertigen Dienstes zur Profilierung des Einzelzell-Transkriptoms mit der 10X Genomics Chromium Single Cell Gene Expression Lösung verschrieben, zusammen mit schlüsselfertigen Software-Tools, die die Erstellung von hochkomplexen Bibliotheken aus Einzelzellen ermöglichen, um Einblicke aus jedem Proben-Typ zu maximieren. Die Cell Ranger-Analyse-Pipelines führen die primäre Analyse und Visualisierung durch. Die Cell Ranger-Analyse-Pipelines führen Standardanalyse-Schritte wie Demultiplexing, Ausrichtung und Genzählung durch. Cell Ranger nutzt die 10X Barcodes, um Expressionsdaten mit Einzelzellauflösung zu generieren. Dieser Datentyp ermöglicht Anwendungen wie Zellclusterung, Zelltypklassifikation und differentielle Genexpression im Maßstab von Hunderten bis Zehntausenden von Zellen.

Das Chromium™-System ermöglicht die transkriptionale Profilierung einzelner Zellen von bis zu zehntausenden Zellen (typischerweise 1000-6000), indem Zellen in Nanoliter-große GEMs partitioniert werden, in denen alle erzeugten cDNA einen gemeinsamen 10x Barcode teilen, der verwendet wird, um einzelne Reads wieder den einzelnen Partitionen zuzuordnen. Die Inkubation der GEMs erzeugt barcodierte, voll-längliche cDNA aus poly-adenyliertem mRNA. Die Single Cell 3' Bibliothek umfasst standardmäßige Illumina-Paired-End-Konstrukte, die mit P5 beginnen und mit P7 enden. 16 bp 10x Barcodes und 12 bp molekulare Barcodes sind in Read 1 codiert, als die ersten Basenpaare des Bibliotheksinserts. Probenindexsequenzen werden als i7-Index-Read integriert.

Abbildung 2. Der Chromium™ Zellpartitionierungsworkflow für scRNA-Sequenzierung

Die 10x Genomics Einzelzellprotokolle erfordern eine Suspension von lebensfähigen Einzelzellen oder Einzelkernen als Eingabe. Forscher müssen eine dissociierte Suspension lebender Zellen einreichen. Um hochwertige Daten zu erhalten, ist es entscheidend, die Lebensfähigkeit zu maximieren und die Anwesenheit von nukleären Aggregaten, toten Zellen, Zelltrümmern, zytoplasmatischen Nukleinsäuren und potenziellen Inhibitoren der reversen Transkription zu minimieren. Eine genaue Zellzählung ist entscheidend für den Erfolg der Anwendung. Die empfohlene Einzelzellensuspension liegt zwischen 700-1200 Zellen/µl für eine optimale Rückgewinnung der Zielzellen. Es wird empfohlen, die Zellensuspension 3-4 Mal zu zählen, und die Standardabweichung zwischen allen Zählungen sollte < 25 % betragen.

• Feature-Barcoding: Zelloberflächen-Barcoding

Die Barcoding-Technologie ermöglicht Multiplexing und die Erkennung von Doppelten und/oder die Identifizierung von Isoformen von Zelloberflächenproteinen, die Detektion von Proteinen für Transkripte mit geringer Häufigkeit und erhöht weiter die phänotypische Spezifität.

• Feature-Barcoding: CRISPR-Screening

Implementierung des CRISPR-Screenings zur Durchführung von hochdurchsatzfähigen und skalierbaren funktionalen genetischen Screens in Hunderten bis Zehntausenden von Einzelzellen gleichzeitig.

Chromium™ Einzelzell-Immunprofilierungslösung

Die Chromium Single Cell Immune Profiling Lösung ist ein umfassender Ansatz, um das adaptive Immunsystem von Hunderten bis Zehntausenden von T- und B-Zellen in Menschen oder Mäusen mit Einzelzellauflösung zu verstehen. CD Genomics bietet optimierte Arbeitsabläufe, die es Ihnen ermöglichen, von Zellaufhängungen über die Bibliotheksvorbereitung, Immunsequenzierung bis hin zur Softwareanalyse zu gelangen, wodurch die Zusammenstellung und Annotation von vollständigen V(D)J-Segmenten sowie die gleichzeitige Bewertung von TCR, Ig und 5'-Genexpression in derselben Zelle ermöglicht wird.

Einzelzell-Suspensionen, die in das System geladen werden, werden in GEMs partitioniert, wobei Transkripte mit zellspezifischen Barcodes markiert werden. Das barcodierte cDNA wird dann für die nachgelagerte Verarbeitung und Bibliotheksvorbereitung zusammengeführt. Für die Profilierung des Immunrepertoires unterzieht sich die cDNA einer gezielten Anreicherung für T- oder B-Zellrezeptor-Transkripte vor der Bibliotheksvorbereitung. Das Protokoll erzeugt Chromium Single Cell V(D)J-Bibliotheken, die bereit für die Illumina-Sequenzierung sind.

Für V(D)J-angereicherte Bibliotheken kodiert Lesevorgang 1 den 16 bp 10x™ Barcode, 10 bp molekulare Barcodes und das 13 bp Switch-Oligo sowie das 5'-Ende eines angereicherten Transkripts. Für 5'-Genexpressionsbibliotheken kodiert Lesevorgang 1 den 16 bp 10x Barcode und 10 bp molekulare Barcodes. Aufgrund der enzymatischen Fragmentierung kodiert Lesevorgang 2 für beide Bibliotheken ein zufälliges internes Fragment des entsprechenden Inserts. Die Probenindexsequenzen werden als i7-Indexlesung integriert. Ein Schema der endgültigen Bibliothekskonstrukte ist unten dargestellt.

Abbildung 3. Chrom-V(D)J-angereicherte Einzelzellbibliothek

Abbildung 4. Struktur der 5'-Genexpressionsbibliothek

Die Chromium™ Linked-Reads Sequenzierungslösung

Die Chromium-Genom-Sequenzierungslösung ermöglicht es, molekulare Barcodes zu verwenden, um Lesevorgänge zu kennzeichnen, die von demselben langen DNA-Fragment stammen, was die langreichweitigen Informationen bereitstellt, die in Standardansätzen fehlen. Dadurch sind wir in der Lage, die kurzen Lesevorgänge miteinander zu verknüpfen, indem wir jedem kurzen Lesevorgang, der aus einem einzelnen Molekül erzeugt wird, einen einzigartigen Barcode zuweisen. Verknüpfte Reads können helfen, auf NGS tote Zonen, mehr strukturelle Varianten finden, Haplotypen auflösen und einfach von Neuem Genomassemblierungen.

Für Analysen des gesamten Genoms beginnt der Prozess mit hochmolekularer (HMW) genomischer DNA, aus der sequenzierbare Bibliotheken von Kopien einzigartig barcodierter gDNA erstellt werden. Für Analysen des gesamten Exoms sorgt das Hinzufügen des Agilent SureSelectXT Human All Exon V6 Reagenz-Kits dafür, dass die Target Enrichment-Bibliotheken ebenfalls eine optimale Exom-Anwendungsleistung bieten. Die optimale Leistung wurde bei Eingangs-gDNA mit einer mittleren Länge von mehr als 65 kb charakterisiert, und dieses Protokoll beschreibt die Extraktion von HMW gDNA mit optimaler Größe aus lebenden Zellen.

Die Chromium™ Einzelzell-Kopienzahlprofilierung

CD-Genomik hat die Fähigkeit, Bibliotheken aus der DNA einzelner Zellen zu sequenzieren und die genomischen Daten zu analysieren, wobei einzelne CNV-Ereignisse (Copy Number Variations) genau erkannt werden.

Aufbauend auf der 10x GEMs-Technologie ist die Chromium Single Cell CNV-Lösung in der Lage, Hunderte bis Tausende von Zellen zu profilieren. DNA aus Einzelzellen wird innerhalb der Cell Bead Gel Bead-Partitionen mit Barcodes versehen, und die barcodierten Fragmente werden dann für die Bibliotheksproduktion zusammengeführt. Die barcodierten Bibliotheksfragmente können mithilfe von nachgelagerten bioinformatischen Werkzeugen leicht auf die Zellen zurückverfolgt werden, aus denen sie stammen. Sie bietet einen umfassenden, skalierbaren Ansatz zur Bestimmung der Genomheterogenität und zur Kartierung der klonalen Evolution, indem Hunderte bis Tausende von Zellen in einer einzigen Probe profiliert werden. Es war noch nie einfacher, komplexe Pathogenese, einschließlich Krebsprogression und genetischer Störungen, in beispiellosem Maßstab und mit beispielloser Auflösung zu untersuchen. Einzelzell-CNV-Ereignisse werden mit einer Auflösung von etwa 2 Mb identifiziert, aber in Zellclustern können CNV-Ereignisse bis hinunter zu einer Auflösung von Hunderten von Kb erkannt werden.

Die Chromium™ ATAC-Sequenzierung

Das 10x Chromium™ System entwickelte eine Lösung für die Einzelzell-ATAC (Assay for Transposase Accessible Chromatin), um die regulatorische Landschaft des Genoms zu verstehen. Es ermöglicht auch das Verständnis von epigenetischen und regulatorischen Variationen über Zehntausende von Zellen hinweg mit dem Chromium Single Cell Assay for Transposase Accessible Chromatin (ATAC) System. Ausgehend von Hunderten bis Zehntausenden von Zellkernen wird das Transposase-Enzym verwendet, um bevorzugt zugängliche DNA-Regionen mit Sequenzierungsadaptern zu kennzeichnen. Transponierte DNA-Fragmente aus einzelnen Zellkernen werden mit einem von etwa 750.000 möglichen 10x Barcodes unterschieden. Es profiliert 500 bis 10.000 Zellkerne pro Kanal und untersucht die offenen Chromatinprofile einzelner Zellkerne.

Vorteile der 10x Einzelzell-Sequenzierung

• Hohe ZellendurchsatzrateDas mikrofluidische "Double-Cross"-System verfügt über eine 8-Kanal-Konfiguration, die es ermöglicht, bis zu 10.000 Zellen pro Kanal zu erfassen. Dies ermöglicht die Analyse von 50.000 bis 80.000 Probenzellen in einem einzigen Durchlauf über alle acht Kanäle.
• Hoch Einzelzell-SequenzierungsabdeckungDie Sequenzierungstiefe erreicht im Durchschnitt 50.000 Reads pro Zelle.
• Hohe ZellfangeffizienzMit einer Einzelzellfangrate von bis zu 65 % kann das System seltene Zelltypen genau identifizieren und erleichtert die Forschung an seltenen Proben oder solchen mit einer geringen Zellanzahl.
• Echte Einzelzell-SequenzierungDie Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner GEM (Gel-Bead in Emulsion) mehrere Zellen erfasst, ist äußerst gering (weniger als 0,09 % pro 1.000 Zellen).
• Breite ZellanpassungsfähigkeitDas System auferlegt keine Einschränkungen hinsichtlich der Zellgröße (Zellen mit Durchmessern über 40 μm erfordern die Vorbereitung von Zellkernen) oder Zelltyp und ermöglicht die Verwendung von Gewebezellen, Immunzellen, Blutzellen, Krebsgewebezellen, Nervenzellen und mehr.

Anwendungen der 10x Einzelzell-Sequenzierung

Immunologische Studien

• Identifizierung von Immunzell-Subtypen: Verwendung von Einzelzelltechnologie zur Identifizierung und Kennzeichnung verschiedener Subtypen von Immunzellen.
• Analyse der genetischen Vielfalt: Untersuchen Sie die genetische Vielfalt von Immunzellen und die hohe Heterogenität, die durch Pathogene verursacht wird.
• Entdeckung neuer Marker-Gene: Seltene Immunzelltypen identifizieren, neue Marker-Gene entdecken und die molekularen Mechanismen von Immunantworten untersuchen.

Tumorforschung

• Identifizierung von Tumorzellsubtypen: Erkennen verschiedener Zellsubtypen innerhalb von Tumoren und Bereitstellung präziser genetischer und transkriptomischer Daten.
• Forschung zur Tumorheterogenität: Untersuchung der Heterogenität von Tumorzellen, Clusterbildung und die Entdeckung neuer Zelltypen, auf der Suche nach neuen pathogenetischen Wegen und Mechanismen.

Forschung zur neuronalen Entwicklung

• Analyse der Neuronheterogenität: Untersuchen Sie die Heterogenität und Clusterbildung verschiedener Neuronzellen.
• Analyse der molekularen Regulationsmechanismen: Untersuchen Sie die molekularen Regulations- und Differenzierungsmechanismen von Neuronen, um die Mechanismen neurologischer Erkrankungen zu verstehen.

Forschung zur Gehirnentwicklung

• Genexpressionsatlas des menschlichen Gehirns: Erhalten Sie einen Genexpressionsatlas menschlicher Gehirnzellen, analysieren Sie die Zellheterogenität und komplexe Zellgruppen.
• Verstehen von Funktionen und Mechanismen: Verstehen Sie die normale Funktion und die abnormalen Mechanismen des menschlichen Gehirns.

Krankheitsklassifizierung

• Entdeckung abnormaler Zelltypen: Finden Sie abnormal proliferierende Zelltypen, um bei der Krankheitsklassifizierung zu helfen.

Stammzell-Differenzierung

• Analyse der Zellheterogenität: Untersuchen Sie die Heterogenität von Stammzellen und identifizieren Sie Zellen unterschiedlicher Phänotypen.
• Entdeckung spezifischer Marker: Finden Sie spezifische Marker verschiedener Arten von Stammzellen und analysieren Sie die molekularen Mechanismen der Stammzellentwicklung und -differenzierung.

Forschung zur embryonalen Zellentwicklung

• Konstruktion von Zelllinien: Untersuchung der Konstruktion von Zelllinien basierend auf den Eigenschaften verschiedener Zellsubtypen zur Unterstützung bei der Krankheitsklassifizierung.

Zellatlas-Konstruktion

• Erkennung neuer Zelltypen: Verschiedene Zelltypen durch Einzelzell-Transkriptomanalyse genau identifizieren und neue Zelltypen sowie Marker-Gene entdecken.

10x Einzelzell-Sequenzierungs-Workflow

Der umfassende Workflow zur Vorbereitung von Einzelzellbibliotheken mit 10x Genomics umfasst drei Hauptschritte: die Vorbereitung einer Einzelzell-Suspension, den Aufbau von GEMs (Gel Bead in Emulsion) und die Bibliothekskonstruktion. Darauf folgen Zelllyse und reverser Transkription, Sequenzierung und Datenanalyse. CD Genomics stellt sicher, dass der 10x Genomics Einzelzell-Sequenzierungsprozess mit voller Integrität, Präzision und Effizienz durchgeführt wird.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Zellen Empfohlene Menge & Qualität: 1-103Einzelne Zellen werden in 1xPBS-Puffer (ohne Ca) gelagert.2+, Mg2+), das Volumen liegt innerhalb von 2 μL Zellkonzentration: 700-1200 Zellen/μL Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie 10x Genomics 50000 Lesevorgänge/Zellen Die Erfassungsrate erreicht 65 %.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Datenqualitätskontrolle Genom-Ausrichtung Zellzählung Genexpressionsanalyse Differenzielle Analyse von Marker-Genen Zelltypanalyse Pseudotime-Analyse Hinweis: Die empfohlenen Datenausgaben und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in 10x Einzelzell-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, können Sie sich gerne an uns wenden.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Warum Einzelzell-Sequenzierungsforschung durchführen?

Heterogenität existiert sogar zwischen benachbarten Zellen innerhalb desselben Gewebes, wie zum Beispiel im Gehirn oder im Herzgewebe. Dies ist besonders ausgeprägt in Tumoren, die Mischungen aus verschiedenen mutierten Zellen sind. Die herkömmliche Bulk-Phasen-Sequenzierung, die das genetische Material aus einer Mischung von Zellen innerhalb eines Gewebes und dessen Mikroumgebung analysiert, kann aufgrund der zellulären Heterogenität wichtige Informationen verschleiern. Im Gegensatz dazu löst die Einzelzellsequenzierung dieses Problem, indem sie die Auflösung der Sequenzierungsanalyse auf die Ebene einzelner Zellen erheblich erhöht. Diese Präzision ermöglicht ein genaueres Verständnis genetischer Informationen und bietet wertvolle Einblicke in die individuelle Entwicklung und die Krankheitsforschung.

Von 2013 bis 2020 wurde die Einzelzell-Sequenzierungstechnologie konsequent als bahnbrechende Jahrestechnologie von renommierten Fachzeitschriften wie Science und Nature hervorgehoben. Diese Technik leitet eine neue Welle der Revolution im Bereich der biomedizinischen Forschung ein.

2. Welche Einzelzellprodukte bietet 10x Genomics derzeit an?

10x Genomics bietet eine Reihe von Einzelzell-Lösungen basierend auf ihrem Chromium-System, das die fortschrittliche 10x Next GEM-Technologie nutzt. Diese Lösungen umfassen:

• Einzelzell-TranskriptomikFür die Genexpressionsanalyse auf RNA-Ebene.
• Einzelzell-CNV-SeqZur Untersuchung von Kopienzahlvariationen (CNVs) auf DNA-Ebene.
• Funktion Barcode-Protein-DetektionZur Profilerstellung von Oberflächenproteinen mittels Merkmals-Barcoding.
• Einzelzell-Immunprofilierung (V(D)J-Seq)Für umfassende immunologische Analysen, einschließlich der Profilierung der Antigenrezeptor-Repertoires von Immunzellen.
• Einzelzell-ATAC-SeqZur Bewertung der Chromatinzugänglichkeit und zur Bereitstellung von Einblicken in die epigenetische Landschaft.

3. Ist die Einzelzell-Sequenzierung derzeit für Pflanzen machbar?

Im Gegensatz zur Einzelzell-Sequenzierung bei Tieren befindet sich die Einzelzellforschung bei Pflanzen noch in den Kinderschuhen. Eine wesentliche Herausforderung ergibt sich aus der Anwesenheit der Pflanzenzellwand, die die Vorbereitung von Protoplasten erforderlich macht, bevor Einzelzell-Suspensionen erstellt werden können. Dieser Prozess wird oft durch Probleme im Zusammenhang mit den enzymatischen Verdauungszeiten und der Pufferosmolarität kompliziert. Darüber hinaus erschwert die geringere zelluläre Heterogenität innerhalb von Pflanzengeweben die Bemühungen um Zellclusterbildung. Zudem kann die Größe bestimmter Pflanzenzellen zu groß sein, um mit der 10x Genomics-Plattform kompatibel zu sein, was die Einzelzell-Sequenzierung erschwert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung klärt molekulare Beziehungen zwischen einzelnen Pflanzenzellen.

Zeitschrift: Pflanzenphysiologie

Impactfaktor: 7,479

Veröffentlicht: 04. Februar 2019

Hintergrund

Verschiedene Zelltypen in Organismen resultieren aus variierender Genexpression, die für die Funktionen von Vielzellern entscheidend ist. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) hat unser Verständnis der Genexpression innerhalb von Zellen revolutioniert, insbesondere bei Tieren, und dabei vielfältige Muster und seltene Typen offenbart. Ihre Anwendung in Pflanzen steht vor Herausforderungen wie der Isolierung von Zellen innerhalb der Zellwand, doch aktuelle Studien an Arabidopsis-Wurzeln unter Verwendung von scRNA-seq bieten Einblicke in die Genexpression und Entwicklung und zeigen vielversprechende Ansätze für die Pflanzenbiologie.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Diese Studie nutzte die 10X Genomics Chromium-Plattform, um 7522 Einzelzell-Transkriptome aus den Wurzeltipps von Arabidopsis zu analysieren, was eine hohe Reproduzierbarkeit offenbarte und neun Hauptzellcluster identifizierte. Die Analyse der differentiellen Genexpression und der GO-Analyse hob gewebespezifische Funktionen hervor, wie Gene, die mit Wurzelhaaren und dem Stele in Verbindung stehen. Die Analyse von Marker-Genen ermöglichte eine präzise Zuordnung der Cluster zu verschiedenen Wurzelgeweben. Die Subcluster-Analyse innerhalb der Stele identifizierte spezifische Zelltypen wie Xylem und Phloem und zeigte die Fähigkeit des Datensatzes, seltene Zellsubtypen zu entdecken. Genexpressionsgradienten über die Cluster hinweg deuteten auf Entwicklungsdynamiken hin und veranschaulichten ein räumliches Differenzierungsmuster von meristematischen zu reifen Zellen.

Abbildung 1. Isolation und Clusteranalyse von Einzelzelltranskriptomen aus Wurzeln von Wildtyp-Arabidopsis.

Abbildung 2. Die Genexpression von Stele-Markergenen in tSNE-Projektionsdiagrammen definiert Cluster unterschiedlicher Gewebe- und Zelltypen in der Stele.

Abbildung 3. Intrakluster-Entwicklungsvariation in der Genexpression.

In dieser Studie wurde die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) eingesetzt, um das Wurzelepidermis der rhd6- und gl2-Mutanten in hoher Auflösung zu analysieren. Die Analyse ergab unterschiedliche molekulare Phänotypen: rhd6-Mutanten wiesen keine Wurzelhaarzellen auf, während einige Zellen Eigenschaften von Nicht-Haarzellen annahmen, während gl2-Mutanten keine Nicht-Haarzellen hatten, wobei einige Zellen frühe Nicht-Haar-Marker exprimierten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wirksamkeit von scRNA-seq bei der Identifizierung von zellspezifischen Genexpressionsänderungen und der Charakterisierung von Mutantenphänotypen auf Einzelzellebene.

Abbildung 4. Vergleichende Einzelzell-Transkriptomanalyse von Wurzeln des Wildtyps und Wurzeln von Wurzelepidermis-Mutanten.

Fazit

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) wurde im Vergleich zu Tieren in Pflanzen weniger erforscht. Die Autoren nutzten eine tropfenbasierte Mikrofluidik-Plattform, um eine Hochdurchsatz-scRNA-seq-Analyse an über 10.000 Arabidopsis-Wurzelzellen durchzuführen, und enthüllten verschiedene Gewebetypen und Entwicklungsstadien. Sie identifizierten seltene Zelltypen wie ruhende Zentrumzellen und verfolgten Entwicklungsverläufe in Wurzelepidermiszellen, einschließlich Mutanten, und zeigten das Potenzial von scRNA-seq für eine detaillierte Analyse der Genexpression in Pflanzen.

Referenz

1. Ryu KH, Huang L, Kang HM, et al. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung klärt die molekularen Beziehungen zwischen einzelnen Pflanzenzellen. Pflanzenphysiologie. 2019, 179(4):1444-56.