Q1. When is Direct RNA not the first choice for analysis?

For large, gene-level differential expression screens under tight budgets, cDNA/Illumina usually offers more depth per dollar. Direct RNA's throughput is lower and cost per usable read is higher, so it's best reserved for questions where native-RNA features matter—full-length isoforms, alternative splicing, fusion transcripts, RNA modifications, and poly(A) tail biology.

Q2. How does Nanopore Direct RNA Sequencing differ from traditional RNA-seq?

Traditional RNA-seq converts RNA to cDNA and amplifies it by PCR, which can introduce bias and remove native chemical marks. Nanopore Direct RNA reads native RNA molecules directly in a 3′→5′ orientation without RT/PCR, preserving RNA modifications and enabling per-read poly(A) tail measurements alongside full-length isoforms.

Q3. What are the main challenges of Direct RNA?

Direct RNA currently has lower throughput than cDNA and higher single-read error than Illumina, and it requires specialized, signal-aware analysis and adequate compute. In practice, we mitigate these limitations with appropriate experimental design, consensus across reads, robust alignment, and careful QC.

Q4. Can Direct RNA do gene expression, splicing isoform, and fusion transcript analysis?

Yes, provided the study is designed for these endpoints. We routinely quantify transcripts, analyze isoform usage (AltTP/DIU), and detect fusion transcripts with single-molecule evidence; however, for very large cohorts focused solely on gene-level DE, cDNA/Illumina can be more economical, while Direct RNA is favored for mechanism-driven studies where native-RNA features are critical.

Q5. Can poly(A) tails and RNA modifications be profiled in the same run?

Yes. Both poly(A) tail length and modification signatures such as m6A, m5C, and Ψ/inosine are derived from the same nanopore signal on native RNA, enabling joint interpretation on the very molecules that carry the features.

Q6. Is Direct RNA strand-specific, and what about 5′ truncation?

Reads are inherently strand-specific and proceed 3′→5′ from a poly(T) adapter. Some reads are 5′-truncated by chemistry and pore dynamics; our isoform clustering and de-redundancy steps account for this so that isoform-level calls remain reliable.

Q7. What input do I need?

We recommend ≥50 µg total RNA at ≥180 ng/µL, with a workable range of 20–80 µg depending on goals and quality; intact RNA (e.g., RIN ≥ 7 or high DV200) markedly improves outcomes. See Sample Requirements for shipping and QC details.

Q8. Do Nanopore Direct RNA reads detect m6A directly?

Yes. Because native RNA passes the pore without RT/PCR, m6A produces characteristic current signatures that can be called at near base-level resolution and linked to specific transcripts and isoforms.

Q9. How much RNA is needed for ONT Direct RNA sequencing?

Most projects target ≥50 µg total RNA at ≥180 ng/µL; studies with 20–80 µg can be feasible depending on aims and RNA integrity, which strongly influences yield and analysis depth.

Q10. How does Direct RNA differ from cDNA long-read or Illumina short-read RNA-seq?

Direct RNA reads native RNA (3′→5′) with no RT/PCR, preserving RNA modifications and enabling per-read poly(A). cDNA/short-read lose native modifications and infer isoforms from fragments.

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Nanoporen-Sequenzierung
Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung

Umfassender Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierungsdienst für Isoformen, RNA-Modifikationen und Poly(A)-Analyse

Hören Sie auf, Isoformen zu rekonstruieren – lesen Sie native RNA direkt. In einem einzigen Durchlauf liefert CD Genomics vollständige Transkript-Isoformen, RNA-Modifikationskarten (m6A/m5C/Ψ/I) und Poly(A)-Schwanzlängen mit Einzelmolekülauflösung.

Schlüsselthemen

Einzelmolekül, PCR-frei Nanopore Direct-RNA-Sequenzierung (3′→5′) mit vollständiger Transkriptauflösung.
End-to-End-Workflow & Analyse — Stichproben-QC, Direkt-RNA-Sequenzierung Nanopore-Protokoll, Durchführung und Berichterstattung.
Integrierte Ausgaben — Isoformen, m6A/m5C/Ψ/I, Poly(A)-Schwanzlänge, optionale naszierende RNA.

Richtlinien zur Einreichung von Mustern

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Inhaltsverzeichnis

Übersicht: Was ist die Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung?

Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung ist der einzige Ansatz, der native RNA-Moleküle direkt liest – ohne Reverse Transkription oder PCR – sodass Ihre Daten reale Basismodifikationen und molekularspezifische Merkmale bewahren. Die Sequenzierung erfolgt 3′→5′ von einem Poly(T)-Adapter und erzeugt Einzelmolekül-Lesungen, die vollständige 5′-UTR–CDS–3′-UTR-Strukturen abdecken.

Wie es funktioniert

Anreichern und anpassen: Poly(A)+ RNA (oder eine benutzerdefinierte Erfassung) wird vorbereitet und mit einem Motorprotein an einen Poly(T)-Adapter ligiert.
Translokation durch die Pore: Jeder RNA-Strang wird durch eine Nanopore gezogen, wo Änderungen des Ionenstroms die Nukleotididentitäten kodieren.
Dekodierung und Analyse: Die Basiserkennung rekonstruiert die Sequenz, während signalbewusste Algorithmen RNA-Modifikationssignaturen (m6A/m5C/Ψ/I) und die Poly(A)-Schwanzlänge pro Lesevorgang ausgeben.
Die Orientierung und Chemie sind in unserem validierten Nanopore-Protokoll zur direkten RNA-Sequenzierung dokumentiert, das Teil des Arbeitsablaufs zur direkten RNA-Sequenzierung mit Nanopore ist.

Warum es wichtig ist

Vollständige Isoformen, keine Assemblierung: Lange Reads lösen direkt alternatives Splicing und komplexe Transkriptstrukturen auf, wodurch Inferenzfehler, die bei Kurz-Reads häufig auftreten, reduziert werden. RNA-Seq.
Native Epitranskriptom: Da es keine RT/PCR gibt, bleiben echte chemische RNA-Modifikationen erhalten und sind mit nahezu basenaufer Auflösung nachweisbar.
Poly(A)-Biologie: Die Poly(A)-Schwanzlängen pro Lesevorgang ermöglichen Studien zur Stabilität, Translation und isoformspezifischen Regulation.
Geringere Amplifikation/GC-Bias: PCR-freie Bibliotheken verbessern die Quantifizierung von GC-extremen und strukturierten RNAs.

Nanopore Direkt-RNA-Sequenzierungs-Workflow

An infographic illustrating the four stages of Nanopore Direct RNA Sequencing: Sample Prep, Library Prep and Run, Data Processing, and Analytics and Hand-off.

1. Musterbeleg & QC

Akzeptierte Eingabe: Gesamte RNA (empfohlen ≥50 µg bei ≥180 ng/µL; brauchbar 20–80 µg, abhängig von der Studie).
Integritätsprüfung (Bioanalyzer/TapeStation), Kontaminanten-Screen, rRNA-Gehalt; RNase-freie Handhabung.
Optionale Kontrollen: ERCC-Spike-ins; Methylierungsstandards zur Kalibrierung des Anrufers.
Empfehlung: ≥2 biologische Replikate pro Bedingung (≥3 verbessern die Aussagekraft).

2. Poly(A)+-Selektion / benutzerdefinierte Erfassung

Standard: Oligo-dT-Anreicherung für mRNA.
Optionen: rRNA-Depletion oder gezielte Erfassung (z. B. lncRNA/circRNA-Panels oder organsim-spezifische Sonden).

3. Bibliotheksvorbereitung — Direkte RNA 1D (PCR-frei)

Ligation des Poly(T)-Adapters und Motorproteins; kein RT / keine PCR.
Die Orientierung ist 3′→5′ nach Vorgabe; Chemie und Barcode-Identifizierung sind in unserem validierten Direct RNA Sequencing Nanopore-Protokoll dokumentiert.

4. Nanopore-Lauf und Echtzeitüberwachung

Flow-Cell-QC, Porenbelegung, Live-Ertragsverfolgung.
Die Ausführungskonfiguration entspricht den Tiefenzielen (Organismengröße, Komplexität, Vergleiche).

5. Basiscalling und Signalverarbeitung

Rohes FAST5 → FASTQ mit Qualitätsmetriken.
Signalbewusste Extraktion der Poly(A)-Schwanzlänge pro Lesevorgang und Modifikationsmerkmale (m6A/m5C/Ψ/I-Kandidaten).

6. Ausrichtung und Isoformverarbeitung

Referenzgeführte gespleißte Ausrichtung.
Isoform-Clusterbildung und De-Duplikation zur Minderung von 5′-Trunkierung und Molekülvielfalt; Nutzung von poly(A)-Stellen erfasst.

7. Primäre Analyseübergabe

Strukturierte Ausgaben (BAM/CRAM, GTF/GFF, per-Read Poly(A)-Tabellen, Modifikationsmerkmals-Tabellen) wurden in die Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierungsanalyse-Module übergeben.

Hinweise & bewährte Praktiken

PCR-freie Bibliotheken reduzieren GC/Amp-Bias und bewahren native RNA-Modifikationen.
Eine gewisse 5′-Trunkierung wird erwartet; unsere Cluster-Pipeline gewährleistet die Genauigkeit auf Isoform-Ebene.
Optionales naszentes RNA-Modul: 5-EU-Markierung ermöglicht die Identifizierung naszenter Transkripte, Schätzung der Halbwertszeit und Stabilitätsanalysen.

Integrierter Analyseplan

Flowchart of Nanopore Direct RNA-seq analysis: gene/isoform/modification/nascent modules feed joint analyses to identify key molecules for validation.

Nanopore Direkte RNA-Sequenzierung Bioinformatikanalyse

Flowchart of Nanopore Direct RNA-seq analysis: gene/isoform/modification/nascent modules feed joint analyses to identify key molecules for validation.

I. Isoform-Analyse

Analyse des alternativen Spleißens
Identifizierung von Fusionstranskripten
Poly(A)-Schwanzanalyse

II. Ausdrucksquantifizierung

Transkriptquantifizierung
Differenzielle Transkriptanalyse
Funktionelle Anreicherung (GO/KEGG/GSEA)
Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI-Netzwerk)

III. RNA-Methylierung / Modifikationsanalyse

m6A-Stellenannotation
Modifikationsanreicherungsanalyse
Differenzielle m6A-Analyse

IV. Gemeinsame quantitative Expressionsanalyse von Isoformen

AltTP-Analyse
Funktionale Diversitätsanalyse (FDA)
Differenzielle Anreicherungsanalyse

V. Analyse von naszentem mRNA (optional)

Identifizierung von naszierendem mRNA
Halbwertszeitabschätzung
Analyse der Korrelation der mRNA-Stabilität
Differenzielle neuartige Expression

Was Sie von unserem Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierungsdienst erhalten werden

Key outputs and benefits of Nanopore Direct RNA Sequencing, including comprehensive data, functional insights, visualizations, transparent records, and optional add-ons.

Umfassende direkte RNA-Ergebnisse

Vollständig verarbeitete Datensätze einschließlich FAST5/FASTQ, gespleißte BAM/CRAM, GTF/GFF (neue/bekannte Isoformen, TSS/TTS, poly(A)-Stellen), poly(A)-Schwanz-Tabellen, Listen von RNA-Modifikationsstellen (m6A/m5C/Ψ/I), Fusionsaufrufe und Transkript-Level-Zählungen/TPM—bereit für die sofortige Analyse mit Nanopore Direct RNA Sequencing und nachgelagerte Verwendung.

Differenzielle und funktionale Einblicke

Zustandspezifische Ergebnisse, die unterschiedliche Transkripte, AltTP/DIU, differenzielles m6A und poly(A)-Vergleiche umfassen, sowie GO/KEGG-Anreicherung und optionale PPI-Netzwerküberlagerungen, um Isoform-/Modifikationsänderungen mit Signalwegen zu verknüpfen.

Veröffentlichungsbereite Visualisierungen

Hochwertige Abbildungen: Isoform-Hitzekarten, Vulkan-Diagramme, Sashimi/AltTP/DIU-Visualisierungen, Fusion-Breakpoint-Panels, Modifikations-Metagene/Motivansichten und poly(A)-Histogramme – optimiert für die Interpretation und die Einreichung bei Fachzeitschriften.

Transparente Analyseaufzeichnungen

Ein prägnanter Methoden- und QC-Bericht (Zusammenfassung des Direct RNA 3′→5′ Protokolls, Software-Versionen/Parameter, Ausbeute/Lesequalität/Mappings/Junction-Metriken) mit Pipeline-Manifest, Umgebungsdatei und Prüfziffern für vollständige Reproduzierbarkeit.

Optionale Zusatzleistungen

Entwickeltes RNA-Modul (5-EU-Identifikation, Halbwertszeit, Stabilitätskorrelationen), integrative Multi-Omik (z.B. Illumina-Tiefe + direkte RNA-Merkmale), Nicht-Poly(A)-Erfassungsstrategien, interaktive HTML-Dashboards und benutzerdefinierte Exporte (z.B. Cytoscape-bereit).

Musteranforderungen & Versand

Kategorie	Anforderungen & Hinweise
Standard-Eingabe	Gesamt-RNAempfohlen ≥50 µg bei ≥180 ng/µL; praktikabel 20–80 µg (zielabhängig). ZellführerEtwa 1×10^7 Zellen liefern typischerweise ausreichend RNA. RNA-TypStandardmäßig Poly(A)+ mRNA; nicht-poly(A) Optionen verfügbar (benutzerdefinierte Erfassung/NERD-ähnlich).
Qualitätskriterien	IntegritätRIN ≥7 oder hohe DV200. SauberkeitVermeiden Sie Phenol/EDTA-Übertragungen und DNase-Inhibitoren.
Replikate & Kontrollen	Replikate≥2 biologische Proben pro Bedingung (≥3 bevorzugt für Differential/AltTP). Steuerungen (optional)ERCC-Spike-Ins, Methylierungsstandards (zur Kalibrierung des Modifikationsaufrufs).
Einreichung & Versand	VerpackungRNase-freie Röhrchen, deutlich beschriftet (Projekt-ID, Proben-ID, Konzentration, Volumen). Temperatur: Schiff auf Trockeneis. Manifestieren: Beispiel-Metadaten einfügen (Organismus, Behandlung, beabsichtigte Vergleiche). EinhaltungBefolgen Sie internationale Vorschriften für Bioproben; fügen Sie das Sicherheitsdatenblatt (SDS) hinzu, falls erforderlich.
Niedrigeingaben / Sonderfälle	Konsultieren Sie uns für RNA-Strategien mit niedrigem Input, gezielte Erfassungs-Panels (lncRNA/circRNA) oder degradierte/archivierte Gewebe (Machbarkeit von Fall zu Fall).

Anwendungen & Fallstudien

Kernanwendungen

Isoform-resolvente Transkriptomikvollständige Isoformen, alternatives Splicing (AltTP/DIU), TSS/TTS & Nutzung von Poly(A)-Stellen.
Fusion-Transkript-ErkennungEinzelmolekülbeweise über Bruchstellen für hochkonfidente Anrufe.
EpitranskriptomikTranskriptom-weite RNA-Modifikationskartierung (m6A/m5C/Ψ/I) mit differentieller Analyse.
Poly(A)-Schwanzbiologie: per-Read Poly(A)-Schwanzlänge zur Untersuchung von Stabilität und Translation; isoformspezifische Unterschiede.
Entstehende RNA & Zerfall (optional)5-EU-basiertes naszentes RNA, Halbwertszeitabschätzung, Stabilitätskorrelationen.
Nicht-codierende RNAEntdeckung/Quantifizierung von lncRNA und circRNA mit langen Reads.
Genomannotation: neuartige Transkripte/Gene in Nicht-Modellorganismen oder heterogenen Geweben.
Längsdynamikgleichzeitige Veränderungen in Struktur, Ausdruck und Modifikationen über Zeit oder Bedingungen hinweg.

Fallaufnahmen

Viral-RNABasisniveau m6A-Kartierung auf Vollgenomen, um Modifikationen mit Spleißung/Isoformen in Beziehung zu setzen.
Hepatitis-Virus-ModelleDirekte Detektion von m5C auf viralen RNAs zur Erforschung von Export- und angeborenen Erkennungspfaden.
OnkologiePseudouridin (Ψ) Dynamik im Zusammenhang mit der Kontrolle der Translation; Fusionstranskripte in Tumorproben.
Pflanzen-/LichtreaktionenVollständige Lesevorgänge zeigen lichtregulierte post-transkriptionale Spleißereignisse.
Stoffwechselzuständegewebespezifische poly(A)-Änderungen und Isoformenwechsel unter Fasten/Essen.
StressphysiologieLangzeit-Blutprofilierung zeigt gleichzeitige Veränderungen in der Expression und den m6A-Markierungen.

Core applications and specific case snapshots demonstrating the versatility of Nanopore Direct RNA Sequencing.

Methodenvergleich

Merkmal	Illumina-KurzleseRNA-Seq	ONT cDNA Langzeitlesung (RT/PCR)	ONT Direkte RNA (Dieser Dienst)
Molekülauslesung	cDNA-Fragmente	cDNA Volllängen (amplifiziert)	Native RNA, Einzelmolekül
Vollständige Isoformen	Abgeleitet/mehrdeutig	Ja	Ja (keine Montage)
RT/PCR-Bias und GC-Effekte	Geschenk	Präsent (reduziert vs. SR)	Minimal (PCR-frei)
RNA-Modifikationen	Indirekt/assay-spezifisch	Verloren während RT	Direkte m6A/m5C/Ψ/I-Signale
Poly(A)-Schwanzlänge	Nicht zugänglich	Indirekt/nicht pro Lesevorgang	Vorgelese Schwanzlängen
Fusion-Transkript-Erkennung	Herausfordernd (Montage)	Gut	Hohe Zuversicht (einzelner Lesevorgang über den Bruchpunkt)
Quantifizierungsgenauigkeit	Betroffen von Fragmentierung/Modellierung	RT/PCR-Bias möglich	Native, strand-spezifisch, reduzierte Verzerrung
Durchsatz	Höchste	Moderat	Niedriger vs cDNA (höhere Detailgenauigkeit pro Molekül)
Am besten für	Sehr große Kohorten; Genebene DE	Isoformen in hoher Ausbeute (keine Modifikationen)	Isoformen + Modifikationen + poly(A) auf denselben Molekülen
Typische Verwendung	Expressionsscreening, Bulk DE	Isoform-Kataloge, lange UTRs	Mechanismusfokussierte Studien: Spleißen/AltTP, Epitranskriptom, Stabilität

Warum CD Genomics

Why CD Genomics—icons for native-RNA expertise, end-to-end workflow, validation, quality, tailored design, and secure RUO delivery.

1. Native-RNA-Expertise
Direkte RNA 1D, PCR-frei, 3′→5′ Orientierung; validiertes Direct RNA Sequenzierungs-Nanopore-Protokoll mit strengen Proben-/Lauf-QC.

2. End-to-End-Workflow & Analyse
Von der Proben-QC und Bibliotheksvorbereitung über die Sequenzierung, Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierungsanalyse bis hin zu integrierten Berichten – Isoformen, m6A/m5C/Ψ/I, Poly(A)-Schwanz.sund optionale naszierende RNA.

3. In peer-reviewed Forschung nachgewiesen
Nanopore-Direkt-RNA-Bibliotheken, die von CD Genomics vorbereitet wurden, wurden in einer PLOS Genetics-Studie verwendet über Arabidopsis Epitranskriptomik, die Einzelmolekül-m6A-Kartierung mit DRS demonstrierend (Sun et al., 2022).

4. Qualität & Reproduzierbarkeit
Transparente Methoden & QC-Bericht, versionsgesperrte Pipelines, Manifeste und Prüfziffern; veröffentlichungsbereite Abbildungen und wiederverwendbare Datenpakete.

5. Entwickelt für Ihre Frage
Studienentwurf für Isoformen/Spleißen, Epitranskriptom, Poly(A)-Biologie, naszente RNA; Optionen für die Nicht-Poly(A)-Erfassung und Multi-Plattform-Integration.

Vertreter der Nanopore-Direkt-RNA-Analyseergebnisse

Diese anonymisierten Bilder stammen aus zwei separaten gelieferten Direct RNA-Demo-Berichten. Die Ansichten zur Transkriptlänge und Poly(A) stammen aus Bericht 11; die Modifikationsdichte-Diagramme stammen aus Bericht 15. Sie dürfen nicht als ein Kundenprojekt oder als verifizierte Kundenergebnisse dargestellt werden.

6 Ausgaben · 1 Stufe

Nicht-redundantes Transkriptlängenprofil aus Bericht 11; exaktes N50-Label entfernt.

Beziehung zwischen Poly(A)-Länge und Expression aus Bericht 11; genaue Korrelationsstatistiken entfernt.

m6A-Stellen-Dichteverteilung aus Bericht 15.

m5C-Städte-Dichteverteilung aus Bericht 15.

Verteilung der Pseudouridin-Stellendichte aus Bericht 15.

Inosin-Stellendichteverteilung aus Bericht 15.

Nur für Forschungszwecke. Bestätigen Sie intern die Veröffentlichungsrechte für Kundenmaterialbilder, bevor Sie diese Abbildungen auf einer öffentlichen Seite platzieren.

Nanopore Direkte RNA-Sequenzierung FAQs

Q1. Wann ist Direct RNA nicht die erste Wahl für die Analyse?

Für große, genebasierte Differenzielle Ausdrucksanalysen unter strengen Budgetvorgaben bietet cDNA/Illumina in der Regel mehr Tiefe pro Dollar. Der Durchsatz von Direct RNA ist niedriger und die Kosten pro nutzbarem Read sind höher, daher ist es am besten, es für Fragen zu reservieren, bei denen native RNA-Merkmale von Bedeutung sind – vollständige Isoformen, alternatives Spleißen, Fusionstranskripte, RNA-Modifikationen und die Biologie des poly(A)-Schwanzes.

Q2. Wie unterscheidet sich die Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung von der traditionellen RNA-Seq?

Traditionelles RNA-seq wandelt RNA in cDNA um und amplifiziert es durch PCR, was Bias einführen und native chemische Markierungen entfernen kann. Nanopore Direct RNA liest native RNA-Moleküle direkt in einer 3′→5′-Orientierung ohne RT/PCR, bewahrt RNA-Modifikationen und ermöglicht Messungen des poly(A)-Schwanzes pro Lesevorgang sowie vollständige Isoformen.

Q3. Was sind die Hauptprobleme der direkten RNA?

Direkte RNA hat derzeit eine niedrigere Durchsatzrate als cDNA und eine höhere Einzel-Lese-Fehlerrate als Illumina, und sie erfordert eine spezialisierte, signalbewusste Analyse sowie ausreichende Rechenleistung. In der Praxis mildern wir diese Einschränkungen durch angemessenes experimentelles Design, Konsens über die Reads, robuste Ausrichtung und sorgfältige Qualitätskontrolle.

Q4. Kann Direct RNA die Analyse von Genexpression, Splicing-Isoformen und Fusions-Transkripten durchführen?

Ja, vorausgesetzt, die Studie ist für diese Endpunkte konzipiert. Wir quantifizieren routinemäßig Transkripte, analysieren die Isoformnutzung (AltTP/DIU) und detektieren Fusionstranskripte mit Einzelmolekülbeweisen; jedoch kann cDNA/Illumina für sehr große Kohorten, die sich ausschließlich auf die Genebene DE konzentrieren, wirtschaftlicher sein, während Direct RNA für mechanismusgetriebene Studien bevorzugt wird, bei denen native RNA-Merkmale entscheidend sind.

Q5. Können Poly(A)-Schwänze und RNA-Modifikationen in demselben Durchlauf profiliert werden?

Ja. Sowohl die Länge des poly(A)-Schwanzes als auch Modifikationssignaturen wie m6A, m5C und Ψ/Inosin stammen aus demselben Nanopore-Signal auf nativer RNA, was eine gemeinsame Interpretation der Moleküle ermöglicht, die die Merkmale tragen.

Q6. Ist die direkte RNA-strangspezifisch, und wie steht es um die 5'-Trunkierung?

Reads sind von Natur aus strangspezifisch und verlaufen 3′→5′ von einem Poly(T)-Adapter. Einige Reads sind chemisch und durch die Dynamik der Pore 5′-verkürzt; unsere Schritte zur Isoform-Klusterung und De-Duplizierung berücksichtigen dies, sodass die Aufrufe auf Isoform-Ebene zuverlässig bleiben.

Q7. Welche Eingaben benötige ich?

Wir empfehlen ≥50 µg Gesamt-RNA bei ≥180 ng/µL, mit einem praktikablen Bereich von 20–80 µg, abhängig von Zielen und Qualität; intakte RNA (z. B. RIN ≥ 7 oder hoher DV200) verbessert die Ergebnisse erheblich. Siehe Probenanforderungen für Versand- und Qualitätskontrolldetails.

Q8. Erfassen Nanopore Direct RNA-Lesungen m6A direkt?

Ja. Da native RNA die Pore ohne RT/PCR passiert, erzeugt m6A charakteristische Stromsignaturen, die mit nahezu basenaufer Auflösung erfasst und spezifischen Transkripten und Isoformen zugeordnet werden können.

Q9. Wie viel RNA wird für die ONT Direct RNA-Sequenzierung benötigt?

Die meisten Projekte zielen auf ≥50 µg Gesamt-RNA bei ≥180 ng/µL ab; Studien mit 20–80 µg können je nach Zielen und RNA-Integrität machbar sein, die stark den Ertrag und die Analyse-Tiefe beeinflusst.

Q10. Wie unterscheidet sich Direct RNA von cDNA-Langlese- oder Illumina-Kurzlese-RNA-Seq?

Direkte RNA-Lesungen lesen natives RNA (3′→5′) ohne RT/PCR, bewahren RNA-Modifikationen und ermöglichen poly(A) pro Lesung. cDNA/kurze Lesungen verlieren native Modifikationen und leiten Isoformen aus Fragmenten ab.

Nanopore Direkte RNA-Sequenzierung Fallstudien

Kundenveröffentlichungshighlight

FIONA1-vermittelte Methylierung des 3'UTR von FLC beeinflusst FLC Transkriptionsniveaus und Blütenbildung in Arabidopsis

Journal: PLoS Genetik
AutorSun, B., Bhati, K. K., Song, P., et al.
Veröffentlicht27. September 2022

1) Hintergrund

Blütezeit in Arabidopsis thaliana wird streng durch RNA-regulatorische Schichten kontrolliert, einschließlich N6-Methyladenosin (m6A). Sonne u. a.untersuchte, ob der m6A-Schreiber FIONA1 (FIO1; METTL16-ähnlich) Methylmarkierungen an der 3′UTR von FLC und stabilisiert damit das Transkript. Um eine unvoreingenommene, Einzelmolekülansicht der RNA-Methylierung und Isoformabdeckung zu erhalten, integrierte das Team Illumina RNA-Seq, MeRIP-seqund Nanopore Direct RNA-Sequenzierung (DRS).

2) Methoden

14-Tage Arabidopsis thaliana Setzlinge (WT Col-0; fio1-1, fio1-5).
Bibliotheksvorbereitung: ONT SQK-RNA002 Direkt-RNA-Protokoll; Bibliotheken vorbereitet von CD Genomics.
Sequenzierung: PromethION (R9.4), ~48–72 h Läufe.
Basecalling/QC: Guppy v3.2.6; Filterung mit NanoFilt.
Ausrichtung & Korrektur: minimap2-Mapping; Fclmr2-Korrektur; Metriken über samtools.
m6A-Analyse und Statistiken: Tombo (de novo) + MINES; differentielle Methylierung mit methylKit.

3) Ergebnisse

Die Analyse der direkten RNA-Sequenzierung mit Nanoporen offenbarte genotypabhängige Transkriptomveränderungen und einen m6A-Konsens von RGACH in Arabidopsis. Im Wildtyp traten die meisten m6A-Ereignisse an GGACA (34,7 %) auf, gefolgt von AGACT (27,2 %), GGACT (22,9 %) und GGACC (15,2 %). Über fio1 Mutanten, DRS identifizierte 74 hypomethylierte Gene (fio1-1) und 63 (fio1-5) im Vergleich zu WT. Kritisch ist, dass die DRS-Abdeckung eine Depletion bestätigte von FLC mRNA in fio1-1 und fio1-5, konsistent mit dem Verlust der Methylierung des 3′UTR.

4) Schlussfolgerungen

Diese Studie zeigt, wie die Nanopore Direct RNA Sequencing eindeutige, vollständige Nachweise liefert, die 3′UTR m6A mit der Stabilität von mRNA verknüpfen. Durch die Erhaltung von nativer RNA koppelt DRS direkt die Erkennung von m6A-Stellen, die Entdeckung von Motiven und die Abdeckung auf Isoform-Ebene – und stellt fest, dass FIO1 m6A an der FLC 3′UTR, und der Verlust dieses Merkmals führt zu einer schnellen FLC Zersetzung und frühe Blüte.

Direct RNA-sequencing analysis Result display. Direkte RNA-Sequenzierungsanalyse.