Umfassender Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierungsdienst für Isoformen, RNA-Modifikationen und Poly(A)-Analyse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Differenzielle Isoform-Expressions-Hitze-Karte

Verteilung der m6A-Stellen über Transkriptregionen

Differentiale Isoform-Volcano-Diagramm

m6A Sequenzmotiv-Logo

Sequenzabdeckung an einem Genlocus

Referenz:

1. Sonne, Bin, et al. "Die FIONA1-vermittelte Methylierung der 3'UTR von FLC beeinflusst die FLC-Transkriptspiegel und die Blüte in Arabidopsis.." PLoS Genetik 18.9 (2022): e1010386.

Häufig gestellte Fragen (FAQs)

Q1. Wann ist Direct RNA nicht die erste Wahl für die Analyse?

Für große, genebasierte Differenzielle Ausdrucksanalysen unter strengen Budgetvorgaben bietet cDNA/Illumina in der Regel mehr Tiefe pro Dollar. Der Durchsatz von Direct RNA ist niedriger und die Kosten pro nutzbarem Read sind höher, daher ist es am besten, es für Fragen zu reservieren, bei denen native RNA-Eigenschaften von Bedeutung sind – vollständige Isoformen, alternatives Spleißen, Fusionstranskripte, RNA-Modifikationen und die Biologie des poly(A)-Schwanzes.

Q2. Wie unterscheidet sich das Nanopore Direct RNA-Sequencing von herkömmlichem RNA-seq?

Traditionelles RNA-seq wandelt RNA in cDNA um und amplifiziert es durch PCR, was Bias einführen und native chemische Markierungen entfernen kann. Nanopore Direct RNA liest native RNA-Moleküle direkt in einer 3′→5′-Orientierung ohne RT/PCR, bewahrt RNA-Modifikationen und ermöglicht die Messung der poly(A)-Schwänze pro Lesevorgang sowie vollständige Isoformen.

Q3. Was sind die Hauptprobleme der direkten RNA?

Direkte RNA hat derzeit eine geringere Durchsatzrate als cDNA und eine höhere Einzel-Lese-Fehlerrate als Illumina, und es erfordert eine spezialisierte, signalbewusste Analyse sowie ausreichende Rechenleistung. In der Praxis mildern wir diese Einschränkungen durch angemessenes experimentelles Design, Konsens über die Reads, robuste Ausrichtung und sorgfältige Qualitätskontrolle.

Q4. Kann Direct RNA die Analyse von Genexpression, Splicing-Isoformen und Fusions-Transkripten durchführen?

Ja, vorausgesetzt, die Studie ist für diese Endpunkte ausgelegt. Wir quantifizieren routinemäßig Transkripte, analysieren die Isoformnutzung (AltTP/DIU) und detektieren Fusionstranskripte mit Einzelmolekülbeweisen; jedoch kann cDNA/Illumina für sehr große Kohorten, die sich ausschließlich auf die genebene DE konzentrieren, wirtschaftlicher sein, während Direct RNA für mechanismusgetriebene Studien bevorzugt wird, bei denen native RNA-Merkmale entscheidend sind.

Q5. Können Poly(A)-Schwänze und RNA-Modifikationen in demselben Durchlauf profiliert werden?

Ja. Sowohl die Länge des Poly(A)-Schwanzes als auch Modifikationssignaturen wie m6A, m5C und Ψ/Inosin stammen aus demselben Nanopore-Signal auf nativer RNA, was eine gemeinsame Interpretation der Moleküle ermöglicht, die die Merkmale tragen.

Q6. Ist die direkte RNA-strangspezifisch, und wie steht es um die 5'-Trunkierung?

Reads sind von Natur aus strangspezifisch und verlaufen 3′→5′ von einem Poly(T)-Adapter. Einige Reads sind chemisch und durch die Dynamik der Pore 5′-verkürzt; unsere Schritte zur Isoform-Clustering und De-Duplikation berücksichtigen dies, sodass die Aufrufe auf Isoform-Ebene zuverlässig bleiben.

Q7. Welche Eingaben benötige ich?

Wir empfehlen ≥50 µg Gesamt-RNA bei ≥180 ng/µL, mit einem praktikablen Bereich von 20–80 µg, abhängig von den Zielen und der Qualität; intakte RNA (z. B. RIN ≥ 7 oder hoher DV200) verbessert die Ergebnisse erheblich. Siehe Probenanforderungen für Versand- und QC-Details.

Q8. Erkennen Nanopore Direct RNA-Lesungen m6A direkt?

Ja. Da native RNA die Pore ohne RT/PCR passiert, erzeugt m6A charakteristische Stromsignaturen, die mit nahezu basenlevel Auflösung erfasst und spezifischen Transkripten und Isoformen zugeordnet werden können.

Q9. Wie viel RNA wird für die ONT Direct RNA-Sequenzierung benötigt?

Die meisten Projekte zielen auf ≥50 µg Gesamt-RNA bei ≥180 ng/µL ab; Studien mit 20–80 µg können je nach Zielsetzung und RNA-Integrität machbar sein, was die Ausbeute und die Analyse-Tiefe stark beeinflusst.

Q10. Wie unterscheidet sich Direct RNA von cDNA Long-Read oder Illumina Short-Read RNA-Seq?

Direkte RNA-Lesungen erfassen natives RNA (3′→5′) ohne RT/PCR, bewahren RNA-Modifikationen und ermöglichen poly(A) pro Lesung. cDNA/kurz-Lesungen verlieren native Modifikationen und leiten Isoformen aus Fragmenten ab.

Kundenveröffentlichungshighlight

FIONA1-vermittelte Methylierung des 3'UTR von FLC beeinflusst FLC Transkriptionsniveaus und Blütenbildung in Arabidopsis

Journal: PLoS Genetik
AutorSun, B., Bhati, K. K., Song, P., et al.
Veröffentlicht27. September 2022

1) Hintergrund

Blütezeit in Arabidopsis thaliana wird streng durch RNA-regulatorische Schichten kontrolliert, einschließlich N6-Methyladenosin (m6A). Sonne u. a.untersuchte, ob der m6A-Schreiber FIONA1 (FIO1; METTL16-ähnlich) Methylmarkierungen an der 3′UTR von FLC und stabilisiert damit das Transkript. Um eine unverzerrte, Einzelmolekülansicht der RNA-Methylierung und Isoformabdeckung zu erhalten, integrierte das Team Illumina RNA-Seq, MeRIP-seqund Nanopore Direct RNA-Sequenzierung (DRS).

2) Methoden

• 14-Tage Arabidopsis thaliana Setzlinge (WT Col-0; fio1-1, fio1-5).
• Bibliotheksvorbereitung: ONT SQK-RNA002 Direkt-RNA-Protokoll; Bibliotheken vorbereitet von CD Genomics.
• Sequenzierung: PromethION (R9.4), ~48–72 h Läufe.
• Basecalling/QC: Guppy v3.2.6; Filterung mit NanoFilt.
• Ausrichtung & Korrektur: minimap2-Mapping; Fclmr2-Korrektur; Metriken über samtools.
• m6A-Analyse & Statistiken: Tombo (de novo) + MINES; differentielle Methylierung mit methylKit.

3) Ergebnisse

Die Analyse der direkten RNA-Sequenzierung mit Nanoporen zeigte genotypabhängige Transkriptomveränderungen und einen Arabidopsis m6A-Konsens von RGACH. Im Wildtyp traten die meisten m6A-Ereignisse bei GGACA (34,7 %) auf, gefolgt von AGACT (27,2 %), GGACT (22,9 %) und GGACC (15,2 %). Über fio1 Mutanten, DRS identifizierte 74 hypomethylierte Gene (fio1-1) und 63 (fio1-5) im Vergleich zu WT. Kritisch ist, dass die DRS-Abdeckung eine Depletion von bestätigte. FLC mRNA in fio1-1 und fio1-5, konsistent mit dem Verlust der Methylierung des 3′UTR.

4) Fazit

Diese Studie zeigt, wie die Nanopore Direct RNA Sequencing eindeutige, vollwertige Beweise liefert, die 3′UTR m6A mit der mRNA-Stabilität verknüpfen. Durch die Erhaltung der nativen RNA koppelt DRS direkt die Erkennung von m6A-Stellen, die Entdeckung von Motiven und die Abdeckung auf Isoform-Ebene – und stellt fest, dass FIO1 m6A an der FLC 3′UTR, und der Verlust dieses Merkmals führt zu einer schnellen FLC Zersetzung und frühe Blüte.

Direkte RNA-Sequenzierungsanalyse.