Menschliche mitochondriale DNA (mtDNA) Sequenzierung

Einführung in die Sequenzierung der menschlichen mitochondrialen DNA (mtDNA)

Mitochondrien, die als "Kraftwerke der Zelle" bezeichnet werden, sind lebenswichtige Organellen in menschlichen Zellen. Die menschliche mitochondriale DNA (mtDNA) bildet doppelsträngige, zirkuläre Moleküle, die etwa 16.569 DNA-Basenpaare enthalten und 37 Gene kodieren (Abb. 1). Es gibt Tausende von mtDNA-Molekülen in der mtDNA, die hochvariabel ist, da sie nicht durch Histone geschützt ist. Die mutierten mtDNAs koexistieren mit den Wildtyp-Molekülen in einem Zustand, der als Heteroplasmie bezeichnet wird, und wurde mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht, wie z.B. Autismus-Spektrum-Störung (ASD), Leber'sche erbliche Optikusneuropathie (LHON), Brustkrebs, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Bluthochdruck. Daher ist das mitochondriale Genom ein bedeutendes Forschungsobjekt in der klinischen Diagnostik.

CD Genomics hat Panels entwickelt, die das gesamte menschliche mitochondriale DNA-Genom spezifisch erfassen. Diese basieren auf Multiplex-PCR und Probenfang. gezielte Sequenzierung Ansätze, die das menschliche mitochondriale Genom zu 100 % abdecken könnten. Mit diesem Panel müssen Kunden kein gereinigtes mtDNA mehr bereitstellen. Die Anreicherung von mtDNA erfolgt durch Multiplex-PCR-Amplifikation oder Probenfang des mitochondrialen Genoms. Die angereicherte mtDNA wird dann einer Bibliotheksvorbereitung und ultra-tiefen Sequenzierung unterzogen. CD Genomics bietet diese Technologie an, um Kunden bei der Forschung zu mitochondrialen genombezogenen Krankheiten zu unterstützen.

Abbildung 1. Das zirkuläre menschliche mitochondriale Genom.

Vorteile unseres Sequenzierungsdienstes für menschliche mitochondriale DNA (mtDNA)

• Einfacherer Zugang zu anfänglichen Proben: menschliche gDNA, die sowohl mtDNA als auch nukleare DNA enthält.
• Ultra-tiefe Sequenzierung: >1000x Abdeckung, mit der Illumina PE150 Plattform
• Hohe Genauigkeit: 100 % Amplikon- oder Sondenabdeckung aller Regionen des mitochondrialen Genoms
• Niedrigster Preis: der von der Stichprobengröße abhängt, bitte kontaktieren Sie uns für ein Angebot.
• Schnellste Bearbeitungszeit: 3-4 Wochen

Workflow zur Sequenzierung der menschlichen mitochondrialen DNA (mtDNA)

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen Multiplex-PCR-Probe: Genomisches DNA ≥ 200 ng, Mindestmenge: 50 ng, Konzentration ≥ 5 ng/µL Menschliche mtDNA-Sequenzierungs-Sonden: Genom-DNA ≥ 500 ng, Mindestmenge: 200 ng, Konzentration ≥ 10 ng/µL Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien Illumina-Plattformen Erfassungsrate: 60%~80%
	Bioinformatische Analyse Der Standard-Service für die Bioinformatik von mtDNA-Sequenzierungen umfasst Rohdaten-QC Ausrichtung an das mitochondriale Referenzgenom Variant (SNP/Indel) Erkennung Annotierungsanalyse Heteroplasmie- und Haplogruppenanalysen sind auf Anfrage verfügbar. Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Sequenzierung von mitochondrialer DNA (mtDNA) für Ihre Schrift (Anpassung)

Kartierung und Abdeckungsergebnisse der mtDNA-Sequenzierung sowie die Darstellung der mtDNA-pathologischen Profile. (Yao et al., 2019)

Referenz:

1. Yao Y, Nishimura M, Murayama K, et al. Eine einfache Methode zur Sequenzierung des gesamten menschlichen mitochondrialen Genoms direkt aus Proben und ihre Anwendung in der genetischen Testung. Wissenschaftliche Berichte, 2019, 9(1): 17411.

1. Umfasst die gesamte Genomsequenzierung mitochondriale DNA?

Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) umfasst von Natur aus mitochondrialer DNA in seinem Umfang. Diese umfassende Sequenzierungstechnik beinhaltet die Extraktion und Sequenzierung sowohl von nukleärer als auch von mitochondrialer DNA. Aufgrund der Fülle an mtDNA-Kopien innerhalb der Zellen, Whole-Genome-Sequenzierung sichert eine umfassende Abdeckung des mitochondrialen Genoms und ermöglicht eine gleichzeitige Analyse mit dem nukleären Genom.

2. Welche Methoden gibt es zur Sequenzierung von menschlicher mitochondrialer DNA?

Verschiedene Methoden werden verwendet, um die mitochondriale DNA (mtDNA) des Menschen zu sequenzieren. Zu den gängigen Ansätzen gehören Sanger-Sequenzierung, Next-Generation-Sequenzierung Plattformen (z. B. Illumina-Sequenzierung) und Langzeit-Sequenzierungstechnologien (z. B. Oxford Nanopore Technologien und Pacific BiosciencesJede Methodologie bietet unterschiedliche Vorteile, Nachteile und Anwendbarkeit, wodurch Forscher ihre Auswahl basierend auf spezifischen Forschungszielen und Ressourcenüberlegungen anpassen können.

Ein Verfahren zur multiplexen Voll-Längen-Einzelmolekül-Sequenzierung des menschlichen mitochondrialen Genoms

Zeitschrift: Nature Communications

Impact-Faktor: 16,7

Veröffentlicht: 06. Oktober 2022

Hintergrund

Mitochondrien enthalten zirkuläre Genome mit vestigialen Funktionen. Heteroplasmie kann die Gesundheit erheblich beeinflussen, was eine genaue Variantenerkennung für Diagnose und Behandlung erfordert. Traditionelle Sequenzierungsmethoden haben Einschränkungen, aber Langlesetechnologien wie ONT und PacBio bieten verbesserte Genauigkeit. Die Verwendung von Cas9 für gezielte Anreicherung mit der Q20+-Chemie von ONT verbessert die Lesegenauigkeit und senkt die Kosten, wodurch sie sich für Proben niedriger Qualität eignet und ihren Einsatz in der mitochondrialen Forschung und klinischen Anwendungen erweitert.

Methoden

Ergebnisse

Die Autoren verfeinerten das Cas9-mtDNA-Anreicherungsprotokoll, um eine hochselektive Einzelmolekül-Sequenzierung von mtDNA aus menschlichen gDNA-Proben zu ermöglichen, was Multiplexing ohne zusätzliche Barcode-Schritte erleichtert. Diese Methode umfasst die Verdauung mit Exonuklease V zur Anreicherung von mtDNA, die Dephosphorylierung der gDNA-Enden und die sequenzspezifische Spaltung durch die dual-RNA-geführte Cas9-Endonuklease. Dieser Ansatz erzeugt einen Barcode an der Cas9-Schnittstelle, was die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung erleichtert. Nach der Cas9-Spaltung werden die Proben mit Proteinase K behandelt, um das gebundene Cas9-Protein zu entfernen, gefolgt von der Ligation von ONT-Sequenzierungsadaptern an die phosphorylierten Schnittstellen.

Abb. 1 Cas9-mtDNA-Anreicherung, Barcoding, Pooling und Demultiplexing-Ansatz für Langsequenzierung.

Die Cas9-mtDNA-Anreicherungsanalyse erkennt genau Heteroplasmie in pathogenen SNVs über 14 klinische Proben. Die Methode, ohne Exonuklease-V-Behandlung, erreicht eine variable mtDNA-Genomabdeckung (×33 bis ×2335), die mit den DNA-Abbaustufen der Proben korreliert. Die Einbeziehung sowohl vollständiger Reads als auch Reads, die an spezifischen Cas9-Schnittstellen-Barcodes beginnen, erhöht die Abdeckung und das Vertrauen in die Variantenbestimmung. Alle berichteten Heteroplasmien sind bestätigt, mit Frequenzen von <0,2 % bis 100 %, und es wurden keine großen Deletionen beobachtet. Darüber hinaus werden nicht-pathogene polymorphe Stellen und Varianten unbekannter Bedeutung identifiziert, was die Bedeutung der Bewertung der Variantenfrequenz innerhalb der allgemeinen Bevölkerung und spezifischer Haplogruppen unterstreicht.

Tabelle 1. Identifizierung pathogener SNVs und Bestimmung der Heteroplasmie in den bestätigten klinischen Proben mit mtDNA-Veränderungen

Die Cas9-mtDNA-Anreicherungsanalyse identifiziert erfolgreich multiple mtDNA-Deletionen in einem komplexen klinischen Fall. Mit drei gRNAs, die das mitochondriale Genom abdecken, erkennt die Methode zwei große Deletionen: m.3264_16070del (7,6% Heteroplasmie) und m.10751_14129del (84,1% Heteroplasmie), neben wildtypischem mtDNA (8,3% Frequenz). Der Vergleich mit lrPCR und Illumina-Sequenzierung bestätigt den Vorteil der nativen mtDNA-Sequenzierung, da sie Verzerrungen überwindet und genauere Schätzungen der mtDNA-Populationen liefert.

Abb. 2 Mehrfache mtDNA-Deletionen in einer klinischen Probe.

Fazit

Dieses Verfahren verwendet die Cas9-Nuklease und Nanoporen-Sequenzierung, um das vollständige menschliche mitochondriale Genom effizient zu zielen und zu sequenzieren. Es erreicht eine hohe Abdeckung und erkennt genau SNVs und multiple Deletionen in klinischen Proben. Die maßgeschneiderte Analyse-Pipeline der Autoren ermöglicht eine präzise Variantenbestimmung und erleichtert eine umfassende mtDNA-Analyse, die der molekularen Diagnostik und Bevölkerungsstudien zugutekommt. Darüber hinaus hat es potenzielle Anwendungen bei der Untersuchung somatischer Mutationen und DNA-Modifikationen und erstreckt sich auf Tierarten für die Erhaltungsgenetik und phylogenetische Forschung.

Referenz:

1. Keraite I, Becker P, Canevazzi D, et al. Eine Methode zur multiplexen Voll-Längen-Einzelmolekül-Sequenzierung des menschlichen mitochondrialen Genoms. Naturkommunikation, 2022, 13(1): 5902.