Mikrosatelliteninstabilitätsanalyse

Was ist Mikrosatelliteninstabilität?

Mikrosatelliteninstabilität (MSI) ist ein Phänomen, das durch Veränderungen in der Länge von Mikrosatelliten gekennzeichnet ist, die sich als repetitive DNA-Sequenzen im gesamten Genom verteilen. Diese Mikrosatelliten, auch als einfache Sequenzwiederholungen (SSRs) oder kurze tandemwiederholungen (STRs) bezeichnet, bestehen typischerweise aus Wiederholungseinheiten, die 1-6 Nukleotide umfassen. Bei Menschen befinden sich Mikrosatelliten überwiegend in nicht-kodierenden Regionen, obwohl sie auch in kodierenden Regionen vorkommen können.

Während der DNA-Replikation sind Mikrosatelliten besonders anfällig für Slippage-Ereignisse, bei denen die DNA-Polymerase Nukleotid-Wiederholungseinheiten einfügen oder löschen kann, was zu Veränderungen in ihrer Länge führt. Normalerweise werden diese Veränderungen durch das Mismatch-Reparatursystem (MMR) korrigiert. Wenn jedoch Komponenten des MMR-Systems defekt sind – aufgrund von Mutationen oder epigenetischen Modifikationen – tritt Mikrosatelliteninstabilität auf.

Was ist ein Mikrosatelliteninstabilitätstest?

Ein MSI-Test ist ein diagnostisches Verfahren, das darauf abzielt, das Vorhandensein von MSI in einer DNA-Probe zu identifizieren. Dieser Test ist entscheidend für das Verständnis der genetischen Grundlagen bestimmter Krebserkrankungen und für die Anpassung geeigneter therapeutischer Strategien. MSI-Tests erkennen typischerweise Abweichungen in der Länge von Mikrosatellitenwiederholungen, die auf Defekte im MMR-System hinweisen können.

Verschiedene Methoden werden für die MSI-Testung eingesetzt, jede mit unterschiedlichen Anwendungen und Empfindlichkeiten. Diese Tests sind besonders wichtig in der Krebsdiagnostik, insbesondere bei kolorektalen Krebserkrankungen und dem Lynch-Syndrom, wo hohe MSI-Werte auf eine genetische Prädisposition für Krebs hinweisen können.

Methoden des Mikrosatelliteninstabilitätstests

• PCR mit Kapillarelektrophorese

Der herkömmliche Goldstandard für MSI-Tests kombiniert die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit der Kapillarelektrophorese. Dieser Ansatz beginnt mit der Amplifikation von Mikrosatellitenregionen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern. Anschließend werden die amplifizierten Produkte nach Größe durch Kapillarelektrophorese getrennt, was die Erkennung und Analyse von Variationen in den Wiederholungs-längen ermöglicht.

Der Prozess beginnt mit der Extraktion von DNA aus Tumor- und normalen Gewebeproben. Bestimmte Mikrosatellitenloci werden dann mittels PCR amplifiziert, wobei ein Primer mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert ist. Die PCR-Produkte werden einer kapillaren Elektrophorese unterzogen, die sie nach Größe trennt und die Erkennung von MSI durch die Analyse der Unterschiede in den Wiederholungs-längen ermöglicht. Diese Methode wird aufgrund ihrer Spezifität und Zuverlässigkeit bei der Erkennung von MSI hoch geschätzt und behält ihren Status als Goldstandard.

• PCR mit Hochauflösender Schmelzkurvenanalyse

Eine weitere Methode für MSI-Tests umfasst PCR in Verbindung mit der Hochauflösungs-Schmelzkurvenanalyse (HRM). Diese Technik verwendet DNA-interkalierende Farbstoffe, um Veränderungen der Schmelztemperatur (Tm) von DNA-Fragmenten zu überwachen, was Einblicke in die Stabilität von Mikrosatelliten bietet.

Das Verfahren umfasst die Amplifikation von DNA-Fragmenten in Anwesenheit eines hochauflösenden Farbstoffs. Nach der Amplifikation wird die DNA schrittweise erhitzt, während das Fluoreszenzsignal überwacht wird, um Unterschiede in den Schmelztemperaturen zu erkennen. Die HRM-Analyse ist besonders empfindlich gegenüber geringfügigen Längenvariationen und eignet sich gut zur Identifizierung von MSI, einschließlich Einzelbasenänderungen sowie kleinen Insertionen oder Deletionen.

• Next-Generation Sequencing (NGS)

Next-Generation Sequencing (NGS) Technologien bieten eine Hochdurchsatzmethode zur Erkennung von MSI durch Sequenzierung mehrerer Mikrosatellitenloci im gesamten Genom. Dieser Ansatz kann angewendet werden durch Whole-Genome-Sequenzierung (WGS), Whole-Exom-Sequenzierung (WES)oder gezielte Regionssequenzierung (TRS) um MSI und andere genetische Variationen zu identifizieren.

Der Prozess umfasst die Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien zur Sequenzierung von Mikrosatellitenregionen. Die Sequenzierungsdaten werden dann analysiert, um Variationen in den Längen der Mikrosatellitenwiederholungen zu erkennen und MSI zu identifizieren. NGS bietet einen umfassenden Überblick über die Mikrosatelliteninstabilität sowie andere genetische Mutationen und liefert ein detailliertes genetisches Profil des Tumors.

Einführung des Mikrosatelliteninstabilitätsanalyse-Dienstes

CD Genomics verwendet das Promega-Kit, das eine fluoreszierende multiplex PCR-Kapillarelektrophorese-basierte Methode zur Bestimmung des MSI-Status ist. Typischerweise umfasst das MSI-Analyse-System den Vergleich der allelischen Profile von Mikrosatellitenmarkern, wobei fünf nahezu monomorphe Mononukleotid-Wiederholungsmarker (BAT-25, BAT-26, MONO-27, NR-21 und NR-24) und zwei hochpolymorphe Pentanukleotid-Wiederholungsmarker (Penta C und Penta D) verwendet werden, die als Qualitätskontrolle zur Authentifizierung von Proben mit übereinstimmendem Normal- und Tumorgewebe dienen. Für die MSI-Detektion müssen Tumor- und Normalgewebe von jedem Patienten parallel analysiert werden. Im Allgemeinen wird eine MSI-Detektion in ≥ 30-40% der Marker als MSI-hoch (MSI-H) betrachtet, während eine Detektion in < 30-40% der Marker als MSI-niedrig (MSI-L) oder MSS, wenn kein Marker instabil ist, angesehen wird.

Vorteile und Anwendungen der Analyse von Mikrosatelliteninstabilität

• Höhere Genauigkeit als IHC, kosteneffizienter und schnellere Bearbeitungszeit als NGS
• Lynch-Syndrom-Screening
• Prognoseerkennung bei sporadischem kolorektalem Krebs
• Diagnosetests bei einer Vielzahl von soliden Tumoren

Mikrosatelliteninstabilitätsanalyse-Workflow

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen 1) Für normales Gewebe 5 ml peripheres Blut in EDTA-Röhrchen 5-6 FFPE-Gewebeschnitte oder ein Block, der nur nicht-tumoröses Gewebe enthält Wir können versuchen, nicht-tumoröses Gewebe aus dem eingereichten Tumorpräparat zu isolieren, wenn kein alternatives Gewebe verfügbar ist. 2) Für Tumorgewebe FFPE-Gewebe (Paraffinblock wird bevorzugt). HinweisZusätzlich wird eine normale, nicht-tumoröse Gewebeprobe von derselben Quelle für Vergleichstests in der MSI-Analyse benötigt. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Teststrategie Verwendung des Applied Biosystems® 3500 xL Genetic Analyzer.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse Datenakquise Analyse der WiederholungsLängen Identifizierung von MSI Qualitätskontrolle Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Rohdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Analyse der Mikrosatelliteninstabilität für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics bietet einen fortschrittlichen Service zur Analyse von Mikrosatelliteninstabilität, der modernste Technologien wie PCR, HRM und NGS nutzt. Dieser Service richtet sich an Forscher, die detaillierte Einblicke in die Mikrosatelliteninstabilität bei verschiedenen Krebsarten suchen. Durch den Einsatz neuester Methoden und Hochdurchsatztechnologien gewährleistet CD Genomics eine genaue und zuverlässige MSI-Erkennung.

Referenzen:

1. Le, D.T. u. a.(2017) Mismatch-Reparatur-Defizienz sagt die Reaktion solider Tumoren auf PD-1-Blockade voraus. Science 10.1126/scienc.aan6733.
2. Le, D.T. u. a.(2015) PD-1-Blockade bei Tumoren mit Mismatch-Reparatur-Defizienz. New Engl. J. Med. 372, 2509–20.
3. NCCN-Klinische Praxisleitlinien in der Onkologie: Genetische/Familiäre Hochrisikobewertung: Kolorektal. Version 2.2015.
4. Promega Technisches Handbuch. MSI-Analyse-System v1.2. Okt 2012.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Welche Bedeutung hat MSI in der Krebsdiagnose?

Mikrosatelliteninstabilität (MSI) dient als ein entscheidender Marker für defekte Mismatch-Reparatursysteme und ist eng mit verschiedenen Krebsarten verbunden, insbesondere mit denen, die mit dem Lynch-Syndrom assoziiert sind. Die Erkennung von MSI liefert wesentliche Informationen in mehreren Dimensionen, einschließlich Diagnose, Prognose und Behandlungsplanung. Durch die Identifizierung von MSI können Kliniker die genetischen Grundlagen von Krebs besser charakterisieren, was zu präziseren und informierteren medizinischen Entscheidungen führt.

2. Wie verbessert NGS die MSI-Testung?

NGS signifikant voran, indem es eine hochdurchsatzfähige, umfassende Analyse mehrerer Mikrosatellitenloci ermöglicht. Diese Technologie bietet detaillierte Einblicke sowohl in MSI als auch in andere genetische Variationen und verbessert somit die Genauigkeit und Tiefe der genetischen Analyse. Die Fähigkeit von NGS, gleichzeitig zahlreiche Loci zu bewerten, ermöglicht ein ganzheitlicheres Verständnis des Genoms, was zu einer verbesserten diagnostischen Präzision führt und potenziell neue therapeutische Ziele aufdecken kann.

3. Kann MSI-Tests an Nicht-Tumorproben durchgeführt werden?

MSI-Tests sind nicht auf Tumorgewebeproben beschränkt; sie können auch an verschiedenen anderen Probenarten durchgeführt werden, einschließlich Blutproben durch die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA). Während Tumorgewebeproben aufgrund ihrer Genauigkeit im Allgemeinen bevorzugt werden, erweitert die Möglichkeit, nicht-invasive Proben zu verwenden, die Praktikabilität von MSI-Tests in klinischen Anwendungen, insbesondere zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und der Behandlungsergebnisse.

4. Was sind die Vorteile der Nutzung des MSI-Analyse-Dienstes von CD Genomics?

CD Genomics bietet einen fortschrittlichen und hochsensitiven MSI-Testdienst an, der die neuesten genomischen Technologien nutzt. Das Unternehmen bietet maßgeschneiderte Lösungen, die auf die spezifischen Bedürfnisse sowohl der Forschung als auch der klinischen Anwendung zugeschnitten sind. Fachkundige Unterstützung gewährleistet die Bereitstellung von hochwertigen Ergebnissen und umfassenden Daten, wodurch CD Genomics ein zuverlässiger Partner für anspruchsvolle MSI-Analysen wird. Ihr Engagement für modernste Methoden stellt sicher, dass die Kunden die genauesten und umsetzbaren Erkenntnisse für ihre Projekte erhalten.

Die isotherme Amplifikation von Mikrosatelliten bei niedrigen Temperaturen reduziert drastisch die Bildung von Stotterartefakten und verbessert die Erkennung von Mikrosatelliteninstabilität bei Krebs.

Zeitschrift: Nucleinsäurenforschung

Impact-Faktor: 16,6

Veröffentlicht: 17. September 2019

Hintergrund

Mikrosatelliten sind repetitive DNA-Sequenzen, die in der genetischen Forschung und der Krebsdiagnostik verwendet werden. MSI, eine Veränderung bei Krebs aufgrund von DNA-Reparaturdefekten, wird typischerweise über PCR und Kapillarelektrophorese nachgewiesen. Die Autoren führten die Niedertemperatur-isothermale Amplifikation mit der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) als vielversprechende Alternative ein, die PCR-Artefakte reduziert und die MSI-Erkennung sowie die Allelzuordnung verbessert.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Bei der Bewertung von Mono- bis Tetra-Nukleotid-Wiederholungs-Mikrosatelliten-LT-RPA-Tests an Blutproben zeigte LT-RPA eine signifikante Verbesserung gegenüber PCR, indem es die Mikrosatellitenprofile durch die Reduzierung oder Eliminierung von Stotterpeaks vereinfachte, was die Allelidentifikation klarer und genauer machte. Dies war insbesondere bei herausfordernden Mikrosatelliten wie BAT26, D18S61 und D12ATA63 offensichtlich, bei denen PCR häufig zu Stotterpeaks und Amplifikationsverzerrungen führte, die die Genotypbestimmung komplizierten. Die Amplicon-Sequenzierung bestätigte weiter, dass die LT-RPA-Profile mit den PCR-Ergebnissen übereinstimmten, mit Ausnahme eines spezifischen Polymorphismus, und ermöglichte eine präzise Allelidentifikation.

Bei der Bewertung von Tri-Nukleotid-Wiederholungs-Mikrosatelliten, die mit genetischen Erkrankungen in Verbindung stehen, amplifizierte LT-RPA effektiv CTG- und GAA-Wiederholungen mit reduzierten Stotterpeaks im Vergleich zur PCR, obwohl es Schwierigkeiten mit CG-reichen FMR1-Mikrosatelliten hatte. Für HTT CAG-Wiederholungen lieferte LT-RPA unter optimierten Reaktionsbedingungen verbesserte Ergebnisse und zeigte seine Fähigkeit, komplexe Wiederholungsstrukturen zu handhaben.

Abbildung 1. Mikrosatellitenprofile von BAT26, D18S61 und D12ATA63, die mit vier Blutproben (benannt B1, B2, B3 und B4) von gesunden Individuen unter Verwendung von PCR (20 ng DNA in 20 μl) und LT-RPA erhalten wurden.

Bei der Testung von HT17 LT-RPA an seriellen Verdünnungen von Krebszelllinien verbesserte LT-RPA die Nachweisgrenze (LOD) für Mikrosatelliteninstabilität (MSI), insbesondere bei kleineren Deletionen, indem es Stutter-Peaks minimierte, die die Detektion in der PCR behinderten. LT-RPA erleichterte auch die bessere Identifizierung von mutierten Allelen in gemischten Proben und ging die Probleme der in der PCR vorhandenen Stutter-Peaks an.

Abbildung 2. HT17 LT-RPA verbessert die Nachweisgrenze von MSI im Vergleich zu PCR.

Schließlich erwies sich LT-RPA als äußerst effektiv bei der Erkennung von MSI in CRC-Proben, einschließlich derjenigen, bei denen PCR aufgrund von Stotterpeaks fehlschlug. Die Methode bot eine bessere Klarheit und Genauigkeit, und die Validierung mit Small-Pool-PCR bestätigte die LT-RPA-Ergebnisse und entdeckte zusätzliche mutierte Allele, obwohl einige Ergebnisse Artefakte der PCR sein könnten.

Abbildung 3. Nachweis von MSI in 12 frisch gefrorenen MMR-defizienten CRC-Proben (S1-S12) unter Verwendung von HT17-Mikrosatelliten sowie LT-RPA und PCR.

Schlussfolgerung

Die Autoren entwickelten eine Niedertemperatur-RPA-Methode für Mikrosatelliten, die Stotterartefakte reduziert und die Allelzuordnung vereinfacht. Diese Methode verbessert die MSI-Erkennung bei kolorektalem Krebs und zeigt großes Potenzial als PCR-Alternative sowohl für klinische als auch für Forschungsanwendungen.

Referenz:

1. Daunay A, Duval A, Baudrin LG, et al. Die isothermale Amplifikation von Mikrosatelliten bei niedrigen Temperaturen reduziert drastisch die Bildung von Stotterartefakten und verbessert die Erkennung von Mikrosatelliteninstabilität bei Krebs. Nukleinsäurenforschung2019, 47(21):e141-.