What are the advantages of 2b-RAD?

CD Genomics is proud to offer advanced 2b-RAD sequencing technology, which harbors numerous advantages over original RAD-seq and GBS . The comparison between different reduced representation whole genome sequencing methods is outlined in Table 1.

What are the disadvantages of 2b-RAD?

Although 2b-RAD is a powerful method for high-throughput genotyping , it also has some drawbacks. 2b-RAD works only on diploid species. Additionally, the short tags may not be long enough for locus discrimination in complex genomes.

How is the 2b-RAD library prepared?

The library construction for 2b-RAD consists of four major stages (BsaXI digestion, ligation, amplification and barcoding). Following DNA digestion by BsaXI, adaptors are ligated to the fragments through cohesive-end, and specific barcodes are incorporated into each sample through PCR amplification using degenerated linkers. Then the single-tag constructs are produced using modified adaptors and biotin-labeled primers, which can be further digested by SapI to generate distinct cohesive ends and then ligated in a predefined order to produce five concatenated tags. Samples are then pooled and sequenced using Illumina technology.

Can 2b-RAD detect SNP in repetitive regions?

2b-RAD may not detect SNP in repetitive regions that include a small number of restriction sites.

How many individuals are required for the construction of linkage map?

At least more than 100 individuals are necessary for constructing genetic linkage map .

For natural populations, how many samples are required?

Natural populations often have more SNP. The number of samples depends on the phenotype of interest, ranging from tens of samples to hundreds. The more samples you submit, the more accurate genotyping results you get.

What is the requirement for species?

Diploids with or without a reference genome are suitable for 2b-RAD. However, polyploids for 2b-RAD had better have a reference genome, and risks are still existing.

2b-RAD - CD Genomics

CD Genomics bietet jetzt 2b-RAD-Sequenzierung an, eine neuartige Methode zur reduzierten Repräsentation der gesamten Genomsequenzierung und zur restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD)-Sequenzierung für die Verknüpfungskartierung und Bestimmung von genomweiten Varianten auf kosteneffiziente Weise.

Was ist die 2b-RAD-Methode?

Die 2b-RAD (IIB-RAD) Methode, die erstmals 2012 von Wang et al. beschrieben wurde, stellt einen modernen Ansatz in der Hochdurchsatz-Genomik dar. SNP-Genotypisierung. Durch die Verwendung von Typ IIB Restriktionsendonukleasen, wie Bcg I, erzeugt diese Technik einheitliche DNA-Fragmente mit einer Länge von 33 bis 36 Basenpaaren, indem sie an spezifischen Erkennungsstellen schneidet. Dies beseitigt die Notwendigkeit für nachfolgende Größenauswahl-Schritte. Einer der Hauptvorteile der 2b-RAD-Methodik ist ihre Fähigkeit, konsistente Fragmentlängen über eine Vielzahl von Proben hinweg zu erzeugen, wodurch präzises und effizientes Sequenzieren sowie die anschließende SNP-Entdeckung erleichtert werden. Obwohl die 2b-RAD-Methode im Vergleich zu Einzel-Enzym-RAD-Ansätzen weniger Fragmente erzeugt, kompensiert sie dies mit überlegener Auflösung und Abdeckung. Folglich adressiert diese Technik mehrere inhärente Einschränkungen früherer Methoden wie RAD-Seq und GBSund bietet eine robuste Alternative für umfassende SNP-Analysen.

Einführung in 2b-RAD

Die 2b-RAD-Methode verwendet Typ IIB Restriktionsenzyme (REs), wie Bcg I, die genomische DNA auf beiden Seiten ihrer Erkennungsstellen spalten, um DNA-Fragmente doppelsträngiger DNA (dsDNA) mit festen Größen und überstehenden, nicht-kohäsiven Enden zu erzeugen. Anschließend werden diese DNA-Fragmente mit einem biotinylierten Adapter, der spezifisch für das ursprüngliche Enzym ist, erfasst. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden wie der restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD) und der Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS) bietet die 2b-RAD-Technik eine überlegene Spezifität für die interessierenden Regionen, während die Erzeugung von Sequenzen aus nicht-informativen und repetitiven Regionen minimiert wird.

Die konsistente Generierung von kurzen und einheitlichen Tags durch die 2b-RAD-Methode bietet mehrere Vorteile, darunter die gezielte Ansprache aller Restriktionsstellen, eine gleichmäßige Sequencing-Tiefe über die Stellen hinweg, hohe Reproduzierbarkeit für quantitative Messungen, reduzierte Sequencing-Kosten pro Tag und eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber DNA-Abbau. Darüber hinaus, um die verbesserten Sequencing-Kapazitäten zu nutzen von Next-Generation Sequencing (NGS) Auf den Plattformen haben wir ein fortschrittliches Protokoll integriert, das die Vorbereitung von fünf verketteten isoRAD-Tags für die Illumina-Paarendsequenzierung (PE) mit 150 bp ermöglicht. Dieses Protokoll bietet Forschern größere Vielseitigkeit und Effizienz bei der Gestaltung von Bibliothekskonfigurationen, die auf spezifische Forschungsziele zugeschnitten sind.

Vorteile unseres 2b-RAD-Services

Durch erhebliche Flexibilität gekennzeichnet, ist die Anzahl der Tags steuerbar.
Die Tags weisen konsistente Längen auf, um eine einheitliche Amplifikationseffizienz während der PCR zu gewährleisten.
Diese Tags zeigen positionsspezifische Eigenschaften, unabhängig von Referenzsequenzen und Assembly-Ergebnissen.
Neben der Verwendung von co-dominanten Markern wie SNPs können auch dominante Marker eingesetzt werden.
Genau und erschwinglich
Flexibler Tag-Nummer
Konsistente Etikettenlänge
Hohe Dichte von Markern
Keine Zwischenreinigungsstufen erforderlich
Ermöglichung von niedrigem DNA-Eingang und degradierter DNA
Hochgradig reduzierte 2b-RAD-Bibliotheken erfordern deutlich weniger Sequenzierung für eine genaue Genotypisierung.

Anwendungen von 2b-RAD

Bin-Kartenkonstruktion und QTL-Standort
Populationsgenetik Studium
Bevölkerungsentwicklung Analyse
Genomweite Assoziationsstudie
Genomphylogenie
Genomische Selektion
Verknüpfungs- und Assoziationsmapping
Diskriminierung von mikrobiellen Stämmen
Erkennung somatischer Mutationen

2b-RAD Arbeitsablauf

Der allgemeine Arbeitsablauf für 2b-RAD umfasst die Probenvorbereitung, die Vorbereitung der 2b-RAD-Bibliothek, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch und überwacht jeden Schritt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten. Der Bibliotheksaufbau für 2b-RAD besteht aus vier Hauptphasen (BsaXI-Digestion, Ligation, Amplifikation und Barcoding).

The Workflow of 2b-RAD.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen Genomisches DNA ≥ 200 ng, Mindestmenge: 50 ng, Konzentration ≥ 5 ng/µL DNA-Proben sollten einen OD260/280-Wert haben, der so nah wie möglich bei 1,8 bis 2,0 liegt. Alle DNA-Proben sollten mit RNase behandelt werden und keine Zersetzung oder Kontamination aufweisen. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina HiSeq X ten, PE 150 Genometikett durchschnittliche Dichte: 2 kb Die durchschnittliche Tiefe des Labels ≥ 20X Klassifikationsgenauigkeit ≥ 95%
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle von Rohdaten Statistische Analyse SNP-Genotypisierung Annotation des SNP-Lokus Konstruktion einer genetischen Verknüpfungskarte Bevölkerungsstudien Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.

Analyse-Pipeline

The Data Analysis Pipeline of 2b-RAD.

Liefergegenstände

Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
Experimentelle Ergebnisse
Datenanalysebericht
Details in 2b-RAD für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics freut sich, modernste 2b-RAD-Sequenzierungstechnologie anzubieten, die einen umfassenden Service umfasst, der den gesamten Workflow von der Qualitätskontrolle genomischer DNA bis zur Bestimmung von Genotypen und der Bewertung der Populationsvielfalt abdeckt. Wir laden Sie ein, uns zu kontaktieren, wenn Sie spezifische Bedürfnisse oder Anfragen zu unseren Dienstleistungen haben. Als lizenzierter Anbieter dieser fortschrittlichen Technologie gewährleistet CD Genomics die Einhaltung von Standards und Exzellenz bei der Bereitstellung robuster genomischer Lösungen. Es ist wichtig zu beachten, dass Keygene N.V. die Patente und Patentanmeldungen hält, die das geistige Eigentum im Zusammenhang mit sequenzbasierten Genotypisierungstechnologien schützen.

Demo-Ergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

The 2b-RAD Results Display Figure.

2b-RAD häufig gestellte Fragen (FAQs)

1. Was sind die Vorteile von 2b-RAD?

CD Genomics ist stolz darauf, die fortschrittliche 2b-RAD-Sequenzierungstechnologie anzubieten, die zahlreiche Vorteile gegenüber der ursprünglichen bietet. RAD-seq und GBSDer Vergleich zwischen verschiedenen Methoden der reduzierten Repräsentation bei der Ganzgenomsequenzierung ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1. Technischer Vergleich zwischen 2b-RAD und anderen NGS-basierten Methoden zur reduzierten Repräsentationsgenotypisierung.

Technologie	RAD-seq, ddRAD	GBS	2b-RAD
Bibliotheksbau	Komplex, einschließlich Sonikation, Fragmentauswahl und mehreren Schritten der DNA-Reinigung.	Keine Sonikation und Fragmentauswahl, Endreparatur	Vereinfacht, keine Sonikation und Fragmentauswahl, Endreparatur
Fragmentgröße	Nicht einheitlich	Nicht einheitlich	Uniform
Tag-Dichte-Anpassung	Schwierig	Möglich, aber nicht getestet	Flexibel
Tag-Sequenzierungstiefe	Hochgradig divergente Tiefe zwischen verschiedenen Tags	Hochgradig divergente Tiefe zwischen verschiedenen Tags	Einheitliche Sequierungstiefe zwischen Tags
Datenanalyse	Falsch-positive Ergebnisse verursacht durch repetitive Sequenzen	Falsch-positiv verursacht durch repetitive Sequenzen	Entfernen Sie die Ablenkung durch sich wiederholende Sequenzen, indem Sie iML verwenden.

2. Was sind die Nachteile von 2b-RAD?

Obwohl 2b-RAD eine leistungsstarke Methode für Hochdurchsatz ist Genotypisierung, es hat auch einige Nachteile. 2b-RAD funktioniert nur bei diploiden Arten. Darüber hinaus sind die kurzen Tags möglicherweise nicht lang genug für die Lokusdiskriminierung in komplexen Genomen.

Wie wird die 2b-RAD-Bibliothek vorbereitet?

Der Bibliotheksaufbau für 2b-RAD besteht aus vier Hauptphasen (BsaXI-Digestion, Ligation, Amplifikation und Barcoding). Nach der DNA-Digestion durch BsaXI werden Adapter über kohäsive Enden an die Fragmente ligiert, und spezifische Barcodes werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Linkern in jede Probe integriert. Anschließend werden die Einzel-Tag-Konstrukte unter Verwendung modifizierter Adapter und biotin-markierter Primer hergestellt, die weiter durch SapI verdaut werden können, um unterschiedliche kohäsive Enden zu erzeugen, die dann in einer vordefinierten Reihenfolge ligiert werden, um fünf verkettete Tags zu produzieren. Die Proben werden dann zusammengeführt und mit Illumina-Technologie sequenziert.

Figure 1. Diagrammatic representation of the 2b-RAD workflow. Abbildung 1. Schematische Übersicht des 2b-RAD-Verfahrens.

4. Kann 2b-RAD SNPs in repetitiven Regionen nachweisen?

2b-RAD kann SNPs in repetitiven Regionen, die nur eine geringe Anzahl von Restriktionsstellen enthalten, möglicherweise nicht erkennen.

5. Wie viele Individuen sind für den Bau einer Verknüpfungskarte erforderlich?

Mindestens mehr als 100 Personen sind erforderlich für den Bau. genetische Verknüpfungskarte.

6. Wie viele Proben sind für natürliche Populationen erforderlich?

Natürliche Populationen haben oft mehr SNPs. Die Anzahl der Proben hängt vom interessierenden Phänotyp ab und reicht von mehreren Dutzend bis zu mehreren Hundert. Je mehr Proben Sie einreichen, desto genauer sind die Genotypisierungsergebnisse.

7. Was ist die Anforderung an Arten?

Diploide mit oder ohne Referenzgenom sind für 2b-RAD geeignet. Polyploide sollten jedoch besser ein Referenzgenom haben, und es bestehen weiterhin Risiken.

2b-RAD Fallstudien

Eine hochauflösende genetische Verknüpfungskarte und feine QTL-Kartierung für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht beim Yangtze-River-KarpfenCyprinus carpio haematopterus)

Journal: BMC Genomik

Veröffentlicht: 02. April 2018

Hintergrund

Die Autoren konstruierten eine hochauflösende genetische Verknüpfungskarte durch die Nutzung von 7820 2b-RAD und 295 Mikrosatellitenmarkern in einer F2-Familie des Karpfens aus dem Yangtze-FlussC. c. Haematopterus). Sie kartierten eine Reihe von vielversprechenden und signifikanten QTLs für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht auf diesem Verknüpfungskarten. Die genetische Karte sowie diese aus QTL abgeleiteten Kandidatengene und Marker sind nützlich für weitere Studien zum Karpfen des Yangtze.

Materialien & Methoden

Probenvorbereitung

Gemeiner Karpfen
DNA-Extraktion

Sequenzierung

2b-RAD-Sequenzierung
De novo Genotypisierung
Mikrosatelliten-Genotypisierung

Datenanalyse

Verknüpfungskartenkonstruktion
Vergleichende Genomanalyse
QTL-Analyse

Ergebnisse

1. Erstellung der hochauflösenden Verknüpfungskarte

Insgesamt wurden 8115 Marker (7820 2b-RAD-Marker und 295 SSRs) in 50 LGs gruppiert, was mit der haploiden Chromosomenzahl übereinstimmte, indem die Software JoinMap 4.1 verwendet wurde.

Figure 1. Sex-averaged genetic linkage map of the Yangtze River common carp C. c. haematopterus, constructed using 2b-RAD and microsatellite markers. (Feng et al., 2018) Abbildung 1. Der geschlechtsdurchschnittliche genetische Verknüpfungsplan des Karpfens im Jangtse. C.c. Haematopterus konstruiert auf der Grundlage von 2b-RAD- und Mikrosatellitenmarkern.

2. Vergleichende Genomkartierung

Figure 2. Circos diagram illustrating the syntenic relationships between C. c. haematopterus (right) and (a and b) C. c. carpio (left) and Danio rerio, with (d) Venn diagrams showing overlaps among uniquely aligned markers mapped to the genomes of C. c. carpio (Cc), D. rerio (Dr), and C. idellus (Ci). (Feng et al., 2018) Abbildung 2. Circos-Diagramm, das syntenische Beziehungen zwischen C. c. Haematopterus (rechts) und (a und b) C. c. Carpio (links) und Danio rerio und (d) Venn-Diagramme, die Überlappungen zwischen einzigartig ausgerichteten Markern beschreiben, die auf das Genom von C. c. carpio (Cc), D. rerio (Dr) und C. Idellus (Ci).

3. Feine QTL-Kartierung für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht.

Insgesamt wurden 21 QTLs, die mit wachstumsbezogenen Merkmalen assoziiert sind, auf 12 LGs identifiziert, darunter zwei genomweit signifikante QTLs und 19 chromosomenweit signifikante QTLs.

Figure 3. Genome scan of LOD profiles for (a) total length, (b) body length, (c) body height, (d) head length, (e) body weight, and (f) sex in C. c. haematopterus. (Feng et al., 2018) Abbildung 3. Eine Genomscan von LOD-Profilen für (a) Gesamtlänge, (b) Körperlänge, (c) Körperhöhe, (d) Kopflänge, (e) Körpergewicht und (f) Geschlecht in C. c. HämatopterusDie gestrichelten und durchgezogenen Linien zeigen die chromosomenweiten und genomweiten Signifikanzschwellen an.

4. Potenzielle Kandidatengene für das Wachstum

Figure 4. QTL region associated with growth traits on LG27 of C. c. haematopterus and its homologous region in the genomes of D. rerio and C. idellus. (Feng et al., 2018) Abbildung 4. Der QTL-Bereich für Wachstumsmerkmale auf LG27 von C. c. Hasematopterus und seine homologe Region in Genomen von D. rerio und C. idellus.

Referenz

Feng X, Yu X, Fu B, u. a.Eine hochauflösende genetische Verknüpfungskarte und feine Kartierung von QTL für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht beim Karpfen aus dem Yangtze.Cyprinus carpio haematopterus). BMC Genomics, 2018, 19(1): 230.

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