2b-RAD

CD Genomics bietet jetzt 2b-RAD-Sequenzierung an, eine neuartige Methode zur reduzierten Repräsentation der gesamten Genomsequenzierung und zur restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD)-Sequenzierung für die Verknüpfungskartierung und Bestimmung von genomweiten Varianten auf kosteneffiziente Weise.

Was ist die 2b-RAD-Methode?

Die 2b-RAD (IIB-RAD) Methode, die erstmals 2012 von Wang et al. beschrieben wurde, stellt einen modernen Ansatz in der Hochdurchsatz-Genomik dar. SNP-GenotypisierungDurch die Verwendung von Typ IIB Restriktionsendonukleasen, wie Bcg I, erzeugt diese Technik einheitliche DNA-Fragmente mit einer Länge von 33 bis 36 Basenpaaren, indem sie an spezifischen Erkennungsstellen schneidet. Dies macht nachfolgende Schritte zur Größenauswahl überflüssig. Einer der Hauptvorteile der 2b-RAD-Methodik ist ihre Fähigkeit, konsistente Fragmentlängen über eine Vielzahl von Proben hinweg zu erzeugen, was präzises und effizientes Sequenzieren sowie die anschließende Entdeckung von SNPs erleichtert. Obwohl die 2b-RAD-Methode im Vergleich zu Einzel-Enzym-RAD-Ansätzen weniger Fragmente erzeugt, kompensiert sie dies mit überlegener Auflösung und Abdeckung. Folglich adressiert diese Technik mehrere inhärente Einschränkungen früherer Methoden wie RAD-Seq und GBSund bietet eine robuste Alternative für umfassende SNP-Analysen.

Einführung in 2b-RAD

Die 2b-RAD-Methode verwendet Typ IIB Restriktionsenzyme (REs), wie Bcg I, die genomische DNA auf beiden Seiten ihrer Erkennungsstellen spalten, um DNA-Fragmente doppelsträngiger DNA (dsDNA) fester Größe mit hervorstehenden, nicht-kohäsiven Enden zu erzeugen. Anschließend werden diese DNA-Fragmente mit einem biotinylierten Adapter, der spezifisch für das ursprüngliche Enzym ist, eingefangen. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden wie der restriktionsstellenassoziierten DNA (RAD) und dem Genotyping-by-Sequencing (GBS) bietet die 2b-RAD-Technik eine überlegene Spezifität für die Interessensregionen, während die Erzeugung von Sequenzen aus nicht-informativen und repetitiven Regionen minimiert wird.

Die konsistente Generierung von kurzen und einheitlichen Tags durch die 2b-RAD-Methode bietet mehrere Vorteile, darunter die gezielte Ansprache aller Restriktionsstellen, eine gleichmäßige Sequierungstiefe über die Stellen hinweg, hohe Reproduzierbarkeit für quantitative Messungen, reduzierte Sequierungskosten pro Tag und eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber DNA-Abbau. Darüber hinaus, um die verbesserten Sequierungskapazitäten zu nutzen von Next-Generation-Sequenzierung (NGS) Plattformen haben wir ein fortschrittliches Protokoll integriert, das die Vorbereitung von fünf verketteten isoRAD-Tags für die Illumina-Paarendsequenzierung (PE) mit 150 bp ermöglicht. Dieses Protokoll bietet Forschern größere Vielseitigkeit und Effizienz bei der Gestaltung von Bibliothekskonfigurationen, die auf spezifische Forschungsziele zugeschnitten sind.

Vorteile unseres 2b-RAD-Services

• Durch erhebliche Flexibilität gekennzeichnet, ist die Anzahl der Tags steuerbar.
• Die Tags weisen konsistente Längen auf, um eine einheitliche Amplifikationseffizienz während der PCR zu gewährleisten.
• Diese Tags zeigen positionsspezifische Eigenschaften, unabhängig von Referenzsequenzen und Assembly-Ergebnissen.
• Neben der Verwendung von co-dominanten Markern wie SNPs können auch dominante Marker eingesetzt werden.
• Genau und erschwinglich
• Flexibler Tag-Nummer
• Konsistente Beschriftungslänge
• Hohe Dichte von Markern
• Keine Zwischenreinigungsstufen erforderlich
• Ermöglichung von niedrigem DNA-Eingang und degradierter DNA
• Hochgradig reduzierte 2b-RAD-Bibliotheken erfordern wesentlich weniger Sequenzierung für eine genaue Genotypisierung.

Anwendungen von 2b-RAD

• Bin-Kartenkonstruktion und QTL-Standort
• Populationsgenetik studieren
• Bevölkerungsentwicklung Analyse
• Genomweite Assoziationsstudie
• Genomphylogenie
• Genomische Selektion
• Verknüpfungs- und Assoziationskartierung
• Diskriminierung von mikrobiellen Stämmen
• Erkennung somatischer Mutationen

2b-RAD Arbeitsablauf

Der allgemeine Arbeitsablauf für 2b-RAD umfasst die Probenvorbereitung, die Vorbereitung der 2b-RAD-Bibliothek, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch und folgt jedem Verfahren, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten. Der Bibliotheksaufbau für 2b-RAD besteht aus vier Hauptphasen (BsaXI-Digestion, Ligation, Amplifikation und Barcode-Generierung).

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Genomisches DNA ≥ 200 ng, Mindestmenge: 50 ng, Konzentration ≥ 5 ng/µL DNA-Proben erfordern ein OD260/280, das so nah wie möglich bei 1,8~2,0 liegt. Alle DNA-Proben sollten mit RNase behandelt werden und keine Zersetzung oder Kontamination aufweisen. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina HiSeq X ten, PE 150 Genometikett durchschnittliche Dichte: 2 kb Die durchschnittliche Tiefe des Labels ≥ 20X Klassifikationsgenauigkeit ≥ 95%
	Bioinformatische Analyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle von Rohdaten Statistische Analyse SNP-Genotypisierung Annotation des SNP-Lokus Bau einer genetischen Verknüpfungskarte Bevölkerungsstudien Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in 2b-RAD für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics freut sich, modernste 2b-RAD-Sequenzierungstechnologie anzubieten und einen umfassenden Service bereitzustellen, der den gesamten Workflow von der Qualitätskontrolle genomischer DNA bis zur Bestimmung von Genotypen und der Bewertung der Populationsvielfalt umfasst. Wir laden Sie ein, uns zu kontaktieren, sollten Sie spezifische Bedürfnisse oder Anfragen zu unseren Dienstleistungen haben. Als lizenzierter Anbieter dieser fortschrittlichen Technologie gewährleistet CD Genomics die Einhaltung von Standards und Exzellenz bei der Bereitstellung robuster genomischer Lösungen. Es ist wichtig zu beachten, dass Keygene N.V. die Patente und Patentanmeldungen hält, die das geistige Eigentum im Zusammenhang mit sequenzbasierten Genotypisierungstechnologien schützen.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Was sind die Vorteile von 2b-RAD?

CD Genomics ist stolz darauf, fortschrittliche 2b-RAD-Sequenzierungstechnologie anzubieten, die zahlreiche Vorteile gegenüber der ursprünglichen bietet. RAD-seq und GBSDer Vergleich zwischen verschiedenen Methoden der reduzierten Repräsentation von Whole-Genome-Sequenzierungen ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1. Technischer Vergleich zwischen 2b-RAD und anderen NGS-basierten Methoden zur genotypischen Reduzierung der Repräsentation.

2. Was sind die Nachteile von 2b-RAD?

Obwohl 2b-RAD eine leistungsstarke Methode für Hochdurchsatz ist Genotypisierung, es hat auch einige Nachteile. 2b-RAD funktioniert nur bei diploiden Arten. Darüber hinaus sind die kurzen Tags möglicherweise nicht lang genug, um Locus-Unterscheidungen in komplexen Genomen vorzunehmen.

Wie wird die 2b-RAD-Bibliothek vorbereitet?

Der Bibliotheksaufbau für 2b-RAD besteht aus vier Hauptphasen (BsaXI-Digestion, Ligation, Amplifikation und Barcoding). Nach der DNA-Digestion durch BsaXI werden Adapter über kohäsive Enden an die Fragmente ligiert, und spezifische Barcodes werden in jede Probe durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Linkern integriert. Anschließend werden die Einzel-Tag-Konstrukte unter Verwendung von modifizierten Adaptern und biotinmarkierten Primern hergestellt, die weiter durch SapI verdaut werden können, um unterschiedliche kohäsive Enden zu erzeugen, die dann in einer vordefinierten Reihenfolge ligiert werden, um fünf verkettete Tags zu produzieren. Die Proben werden dann zusammengeführt und mit Illumina-Technologie sequenziert.

Abbildung 1. Schematische Übersicht des 2b-RAD-Verfahrens.

Kann 2b-RAD SNPs in repetitiven Regionen nachweisen?

2b-RAD erkennt möglicherweise keine SNPs in repetitiven Regionen, die nur eine geringe Anzahl von Restriktionsstellen enthalten.

5. Wie viele Individuen sind für den Bau einer Kopplungslandkarte erforderlich?

Mindestens mehr als 100 Personen sind erforderlich, um zu konstruieren. genetischer Verknüpfungsplan.

6. Wie viele Proben sind für natürliche Populationen erforderlich?

Natürliche Populationen haben oft mehr SNPs. Die Anzahl der Proben hängt vom interessierenden Phänotyp ab und reicht von mehreren Dutzend bis hin zu Hunderten. Je mehr Proben Sie einreichen, desto genauer sind die Genotypisierungsergebnisse.

7. Was ist die Anforderung an Arten?

Diploide mit oder ohne Referenzgenom sind für 2b-RAD geeignet. Polyploide sollten jedoch besser ein Referenzgenom haben, und es bestehen weiterhin Risiken.

Eine hochauflösende genetische Verknüpfungskarte und feine Kartierung von QTL für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht beim Karpfen des YangtzeflussesCyprinus carpio haematopterus)

Journal: BMC Genomics

Veröffentlicht: 02. April 2018

Hintergrund

Die Autoren erstellten eine hochauflösende genetische Kopplungskarte durch die Nutzung von 7820 2b-RAD und 295 Mikrosatellitenmarkern in einer F2-Familie des Karpfens aus dem Yangtze-FlussC. c. Haematopterus). Sie kartierten eine Reihe von vielversprechenden und signifikanten QTLs für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht auf diesem Kopplungsplan. Der genetische Plan sowie diese aus QTL abgeleiteten Kandidatengene und Marker sind nützlich für weitere Studien zum Karpfen im Yangtze.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

1. Erstellung der hochauflösenden Verknüpfungskarte

Insgesamt wurden 8115 Marker (7820 2b-RAD-Marker und 295 SSRs) in 50 LGs gruppiert, die mit der haploiden Chromosomenzahl übereinstimmten, indem die Software JoinMap 4.1 verwendet wurde.

Abbildung 1. Der geschlechtsdurchschnittliche genetische Verknüpfungsplan des Karpfens im Jangtse. C.c. Hämatopterus konstruiert auf der Grundlage von 2b-RAD- und Mikrosatellitenmarkern.

2. Vergleichende Genomkartierung

Abbildung 2. Circos-Diagramm, das syntenische Beziehungen zwischen C. c. Haematopterus (rechts) und (a und b) C. c. Carpio (links) und Danio rerio und (d) Venn-Diagramme, die Überlappungen zwischen eindeutig zugeordneten Markern beschreiben, die auf das Genom von C. c. Carpio (Cc), D. rerio (Dr) und C. idellus (Ci).

3. Feine QTL-Kartierung für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht.

Insgesamt wurden 21 QTLs, die mit wachstumsbezogenen Merkmalen assoziiert sind, auf 12 LGs nachgewiesen, darunter zwei genomweit signifikante QTLs und 19 chromosomenweit signifikante QTLs.

Abbildung 3. Eine Genomscan von LOD-Profilen für (a) Gesamtlänge, (b) Körperlänge, (c) Körperhöhe, (d) Kopflänge, (e) Körpergewicht und (f) Geschlecht in C. c. HämatopterusDie gestrichelten und durchgezogenen Linien zeigen die chromosomenweiten und genomweiten Signifikanzschwellen an.

4. Potenzielle Kandidatengene für das Wachstum

Abbildung 4. Der QTL-Bereich für Wachstumsmerkmale auf LG27 von C. c. Hasematopterus und seine homologe Region in Genomen von D. rerio und C. idellus.

Referenz

1. Feng X, Yu X, Fu B, u. a.Eine hochauflösende genetische Verknüpfungskarte und feine Kartierung von QTL für wachstumsbezogene Merkmale und Geschlecht beim Karpfen aus dem Yangtze.Cyprinus carpio haematopterus). BMC Genomics, 2018, 19(1): 230.