ATAC-Seq

CD Genomics kann jetzt Assays für transposase-zugängliche Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) anbieten, eine Methode zur Kartierung der Chromatinzugänglichkeit im gesamten Genom. Die Methode ist eine schnelle und empfindliche Alternative zu DNase-seq (Sequenzierung von DNase I-hypersensitiven Stellen) oder MNase-seq (Sequenzierung von mikrokokkal-nuklease-sensitiven Stellen). Mit unserem Service können Sie genomweite Profile von offenen und zugänglichen Chromatinregionen erkennen, die auf aktive regulatorische Regionen hinweisen.

Die Einführung von ATAC-Seq

Das eukaryotische Genom ist stark verpackt, um in den sehr begrenzten nukleären Raum zu passen. Infolgedessen wird der Zugang zu genomischen Informationen streng reguliert, basierend auf dem Zellzustand. Welche Regionen des Genoms zugänglich sind, verrät viel über den Zustand der Zelle. ATAC-seq ist eine Technik, um zugängliche Chromatinregionen zu lokalisieren.

Das Akronym ATAC-seq steht für Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing, eine Technik, die die Zugänglichkeit von Chromatin durch Transposase mittels Sequenzierung untersucht. Dieser Ansatz beinhaltet den Schnitt offener Chromatinregionen in spezifischen zeitlichen und räumlichen Kontexten durch Transposase, wodurch regulatorische Sequenzen von aktiv transkribierten Genen im Genom zu diesem spezifischen Zeitpunkt erfasst werden. Diese Methode erfordert nur eine kleine Anzahl von Zellen und liefert Echtzeitinformationen über die regulatorischen Sequenzen, die die genomweite Aktivität steuern. Zu den Anwendungen gehören die Analyse der Bindung von Transkriptionsfaktoren, die Positionierung von Nukleosomen und die Verteilung regulatorischer Elemente, was enorme Perspektiven im Bereich der epigenetischen Forschung bietet.

ATAC-seq ist eine innovative Technik in der epigenetischen Forschung, die Tn5-Transposase verwendet, um offene Chromatinstellen zu schneiden und zu kennzeichnen, was eine effiziente Sequenzierung von Chromatinzugänglichkeitskarten ermöglicht. Die Tn5-Transposase bindet zufällig und schneidet DNA in offenen Chromatinregionen, während sie gleichzeitig Adaptersequenzen an den Schnittstellen einfügt. Durch die Einführung des Transposase-Komplexes, der bekannte DNA-Sequenzmarkierungen (d.h. Tn5-Transposase mit roten und grünen Sequenzmarkierungen) trägt, in den Zellkern zur Co-Inkubation und anschließender PCR-Amplifikation unter Verwendung der bekannten Sequenzmarkierungen kann eine Bibliothek erstellt werden, und die Sequenzierung kann Informationen über offene Chromatinregionen liefern.

Vorteile von ATAC-Seq

• Gewinnen Sie mechanistische Einblicke in die Genregulation, die zelluläre Reaktion auf Behandlung oder Krankheit.
• Identifizieren Sie, welche Transkriptionsfaktoren das Zellschicksal, Krankheiten oder Reaktionen steuern.
• Begrenzte Patientenproben
• Geringe Anforderungen an die Menge der biologischen Probe, und das gesamte Protokoll benötigt insgesamt 3 Stunden.

Anwendungen von ATAC-Seq

• Nukleosomenpositionierung
• Identifizierung wichtiger Transkriptionsfaktoren
• Erkennung von Promotorregionen, potenziellen Enhancern oder Silencern
• Integration von Multi-Omics-Daten
• Kartierung der Chromatinzugänglichkeit
• Identifizierung von durch Transkriptionsfaktoren regulierten Zielgenen

ATAC-Seq Arbeitsablauf

Der zentrale Bestandteil des ATAC-seq-Verfahrens ist die Wirkung der Transposase Tn5 auf die genomische DNA der Probe. Transposasen sind Enzyme, die die Bewegung von Transposons zu anderen Stellen im Genom katalysieren. Während natürlich vorkommende Transposasen ein niedriges Aktivitätsniveau aufweisen, verwendet ATAC-seq eine mutierte hyperaktive Transposase. Die hohe Aktivität ermöglicht ein äußerst effizientes Schneiden von exponierter DNA und die gleichzeitige Ligation spezifischer Sequenzen, die als Adapter bezeichnet werden. Adapter-ligierte DNA-Fragmente werden dann isoliert, durch PCR amplifiziert und verwendet für Next-Generation-SequenzierungDie experimentelle Pipeline von ATAC-seq wird in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Schematischer Arbeitsablauf des ATAC-seq-Prozesses.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Probenart: Menschliche, Maus- und Rattengewebe, lebende Zellen, kein genomisches DNA. Zelle ≥ 1 x106Mindestmenge: 5 x 104 Gewebe ≥ 500 mg, Mindestmenge: 200 mg Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien Illumina HiSeq PE50 oder PE150. Für einige Anwendungen wie die Nukleosomenkartierung wird das paired-end Sequencing bevorzugt. Illumina HiSeq PE150. ≥50M Lesevorgänge.
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle Referenzgenom-Kartierung Peak-Erkennung Annotation Differentialanalyse Motiventdeckung Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in ATAC-Seq für Ihre Schreibweise (Anpassung)

CD Genomics versichert, dass wir einen hochwertigen Service bieten werden, und unser professionelles Team wird Sie nicht enttäuschen. Mit mehr als 10 Jahren Erfahrung in der Unterstützung von Forschern weltweit im Bereich NGS denke ich, dass wir das sein könnten. Bitte zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren, wenn Sie Fragen zu unserem Service haben.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Welche Art von Kontrollen sind für ATAC-Seq-Experimente notwendig?

Im Bereich der ATAC-Seq-Experimente ist die Einbeziehung verschiedener Kontrollen unerlässlich, um Präzision und Zuverlässigkeit zu gewährleisten. Die Verwendung einer Input-DNA-Kontrolle dient dem Zweck, potenzielle Verzerrungen in der DNA-Vorbereitung und den Sequenzierungsprozessen zu normalisieren. Technische Replikate spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestätigung der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Die Einbeziehung positiver Kontrollen, die etablierte offene Chromatinregionen repräsentieren, fungiert als Mechanismus zur Validierung des Protokolls. Auf der anderen Seite helfen negative Kontrollen, die erwartete geschlossene Chromatinregionen anzeigen, bei der Erkennung und Minderung von Hintergrundgeräuschen.

2. Wie vergleicht sich ATAC-Seq mit anderen Chromatinzugänglichkeitsassays wie DNase-Seq und FAIRE-Seq?

DNase-Seq, ATAC-Seq und FAIRE-Seq sind Techniken, die zur Untersuchung offener Chromatinregionen eingesetzt werden. DNase-Seq verwendet die DNase I-Endonuklease, um zugängliche Chromatinregionen zu identifizieren, FAIRE-Seq umfasst Sonikation gefolgt von Phenol-Chloroform-Anreicherung, und ATAC-Seq nutzt die Tn5-Transposase zur Anreicherung und Amplifikation. Die hohe Aktivität der Tn5-Transposase macht ATAC-Seq zu einer einfachen, effizienten Methode, die nur 500-50.000 Zellen benötigt. Die Sensitivität und Spezifität von ATAC-Seq sind vergleichbar mit DNase-Seq und überlegen gegenüber FAIRE-Seq.

3. Welche Techniken werden häufig mit ATAC-seq für die Forschung kombiniert?

ATAC-seq + RNA-SeqIm Allgemeinen wird RNA-seq vor ATAC-seq durchgeführt, um differentielle exprimierte Gene und angereicherte Wege zu identifizieren, die Korrelationen nahelegen. Um zu bestimmen, welche Faktoren diese Zielgene regulieren, kann die Motivanalyse über ATAC-seq potenzielle regulatorische Elemente identifizieren. Eine anschließende Validierung kann durch zusätzliche Experimente oder ChIP-seq erfolgen.

ATAC-seq + Hi-CFür Studien, die die Auswirkungen höherordentlicher Chromatinstrukturen auf biologische Prozesse untersuchen, wird ATAC-seq häufig zusammen mit Hi-C verwendet. Hi-C liefert Informationen über höherordentliche Strukturen wie Kompartimente A/B, TADs und Schleifen, die Korrelationen anzeigen. ATAC-seq kann zudem Promotoren, Enhancer und andere Elemente identifizieren und aufzeigen, wie diese Strukturen die Genexpression beeinflussen.

ATAC-seq + HistonmodifikationenWährend ATAC-seq die Zugänglichkeit spezifischer Stellen und potenzieller Transkriptionsfaktor-Bindungen vorhersagen kann, zeigt es nicht, ob diese Faktoren die Genexpression fördern oder hemmen. Die Kombination von ATAC-seq mit Daten zu Histonmodifikationen (z. B. H3K27ac für Aktivierung oder H3K27me3 für Repression) kann ein umfassenderes Verständnis bieten und die Daten robuster und zuverlässiger machen.

Multiomische Analysen der Auswirkungen von LED-weißem Licht auf die Reifung von Aprikosenfrüchten

Zeitschrift: Zeitschrift für Fortgeschrittene Forschung
Impact-Faktor: 12,822
Veröffentlicht: Online verfügbar am 9. Januar 2024

Hintergrund

AprikosePrunus armeniaca L.., die in Zentralasien heimisch und in Regionen wie dem Mittelmeerraum und China weit verbreitet ist, ist aufgrund ihrer Farbe, ihres Geschmacks und ihrer Nährstoffe beliebt, hat jedoch eine kurze Haltbarkeit von 3-5 Tagen. Der Reifungs- und Alterungsprozess, der durch Ethylen reguliert wird, umfasst komplexe physiologische Veränderungen. Trotz umfangreicher Forschung sind die Veränderungen der Metaboliten und die regulatorischen Mechanismen während der Nachernte-Lagerung nicht vollständig verstanden. Lichtemittierende Dioden (LEDs) bieten eine umweltfreundliche Methode, um die Haltbarkeit zu verlängern, indem sie die Alterung verzögern und die Qualität erhalten. Diese Studie untersucht die Auswirkungen von LED-Weißlicht auf die Qualität von Aprikosenfrüchten, Transkriptom, Metabolom und Chromatinzugänglichkeit, mit dem Ziel, die Lagerungsmethoden zu verbessern und die Haltbarkeit zu verlängern.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Transkriptomik von Früchten genutzt, um PCC als Index zur Bewertung der biologischen Replikatkorrelation zu verwenden, wobei hohe Werte (>0,9) festgestellt wurden, die auf eine starke Ähnlichkeit hinweisen (Abb. 1F). Die Analyse ergab unterschiedliche Muster der Genexpression in den Vergleichen: CK-0 d vs. CK-8 d (6.256 DEGs), CK-0 d vs. LED-8 d (8.110 DEGs) und CK-8 d vs. LED-8 d (1.792 DEGs), mit variierenden Überlappungen (Abb. 1I). Die KEGG- und GO-Anreicherung hob Wege wie die Biosynthese sekundärer Metaboliten und die regulatorischen Rollen von DEGs in Bezug auf Geschmack, Textur, Farbe, Ethylenbiosynthese, Transkriptionsfaktoren und oxidative Prozesse hervor. LED-Licht regulierte 56 DEGs bei der Fruchtreifung, was Auswirkungen auf Stoffwechselwege und transkriptionale Aktivitäten hatte.

Abb. 1. Auswirkungen der LED-Behandlung auf die physiologische Qualität und Transkription von Aprikosenfrüchten.

Kombinierte transkriptomische und metabolomische Analysen zeigten, dass unter LED-Bestrahlung UDP-Zucker-Pyrophosphorylase (USP) hochreguliert wurde, was die Synthese von D-Glucuronat erhöhte, während Inositol-Oxygenase (MIOX) und Aldehyddehydrogenase (ALDH) herunterreguliert wurden, was die Ansammlung von Myo-Inositol verringerte. Die LED-Behandlung verringerte auch die Ansammlung von L-Dehydroascorbinsäure, indem sie die Aktivitäten von L-Ascorbat-Peroxidase (APX) und L-Ascorbat-Oxidase (AO) beeinflusste. Darüber hinaus führten die durch LED induzierten Erhöhungen der Cinnamoyl-CoA-Spiegel zur Hochregulierung von Chalcon-Synthase (CHS) und Phlorizin-Synthase (PTG1), was den Flavonoidstoffwechsel veränderte und die Anthocyanin-Biosynthese durch die Hochregulierung von Dihydroflavonol-4-Reduktase (DFR) förderte.

Abb. 2. Der Stoffwechselweg der Flavonoidbiosynthese wurde durch die Kombination von Transkriptom- und Metabolomdaten analysiert.

Die ATAC-seq-Analyse von Aprikosenfrüchten nach der LED-Behandlung ergab 616,85 Millionen saubere Reads mit hohen Q30-Basenanteilen, was auf eine robuste Datenqualität hinweist. Die Korrelationsanalyse zeigte eine starke Reproduzierbarkeit unter biologischen Replikaten innerhalb jeder Gruppe. Die differentiellen Analysen identifizierten 4492, 1769 und 123 unterschiedlich zugängliche Regionen (DARs) in CK-0 d vs. CK-8 d, CK-0 d vs. LED-8 d und CK-8 d vs. LED-8 d, jeweils. Die Motivanalyse hob 76 Transkriptionsfaktoren (TFs hervor, darunter ethylen-responsive Faktoren (ERF2, ERF9, ERF069, ERF104 und MYB124), die an der Regulierung von DARs und Zielgenen beteiligt sind. Diese Ergebnisse unterstreichen die durch LED induzierten Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit und der TF-Regulation, die die Genexpression und die Fruchtentwicklung bei Aprikosen beeinflussen.

Abb. 3. Übersicht über die ATAC-seq-Daten der Reifung von Aprikosenfrüchten.

Abb. 4. (A) Differenzielle Genexpression und Heatmap der offenen Chromatinregionen. (B) Der Stoffwechselweg der Phenylpropanoid-Biosynthese wurde durch die Kombination von Transkriptom-, Metabolom- und ATAC-seq-Daten analysiert.

In mit LED-behandelten Aprikosenfrüchten zeigten die integrierten Transkriptom- und ATAC-seq-Analysen Gene mit veränderter Chromatinzugänglichkeit und Expressionsniveaus. HCT wies eine reduzierte Chromatinzugänglichkeit und eine verringerte Genexpression auf, während POD und 4CL variable Veränderungen in der Zugänglichkeit zeigten, gepaart mit gemischter Hoch- und Herunterregulierung der Genexpression.

Die metabolomische Analyse hob die Phenylpropanoid-Biosynthese hervor, die durch die LED-Behandlung erheblich beeinflusst wurde. Veränderungen in der HCT-Expression beeinflussten die Ansammlung spezifischer Metaboliten wie p-Coumaroyl-Schikimisäure und Caffeoyl-Chinasäure. POD und 4CL, mit veränderter Chromatinzugänglichkeit und variierter Genexpression, spielten eine Rolle in den Lignin-Synthesewegen, die entscheidend für die Erhaltung der Qualität von Aprikosenfrüchten während der Lagerung sind.

Abb. 5 Modell des Regulierungsnetzwerks von LED-Licht während der Reifung geernteter Aprikosenfrüchte.

Fazit

Die LED-Behandlung veränderte die Stoffwechselwege für Ascorbinsäure- und Uronatmetabolismus, Flavonoidbiosynthese und Phenylpropanoidbiosynthese in Aprikosenfrüchten und beeinflusste die Genexpression, die mit der Pflanzenhormon-Signalübertragung, der Fruchtqualität und der antioxidativen Aktivität in Verbindung steht. Diese Forschung hebt das Potenzial von LEDs hervor, die Lagerung und Haltbarkeit von Obst und Gemüse zu verlängern.

Referenz:

1. Bai C, Zheng Y, Watkins CB, u. a.Multiomische Analysen der Auswirkungen von LED-weißem Licht auf die Reifung von Aprikosenfrüchten. Zeitschrift für fortgeschrittene Forschung. 2024.