Gezielte Regionssequenzierung

CD Genomics bietet seit Jahrzehnten einen schnellen und kostengünstigen Sequenzierungsdienst für gezielte Regionen an. Wir setzen modernste Sequenzierungsinstrumente ein, um Ihnen zu helfen, vollständige DNA-Informationen der ausgewählten Ziele auf kosteneffiziente Weise zu erhalten, was sowohl die Breite als auch die Tiefe Ihrer genomischen Forschung erheblich erhöhen kann.

Die Einführung der gezielten Regionssequenzierung

Die gezielte Regionssequenzierung ist ein effektiver Ansatz zur Untersuchung Ihrer ausgewählten Interessensregion(en) durch Next-Generation-SequenzierungDurch die Nutzung gezielter Regionensequenzierungs-Panels können Sie Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), Insertionen/Löschungen (InDels), Kopienzahlvariationen (CNVs) und strukturelle Varianten (SVs) entdecken. Im Vergleich zu Whole-Genome-SequenzierungDie gezielte Regionssequenzierung ermöglicht eine genaue Erkennung seltener Varianten mit höherer Sensitivität und Spezifität. Dieser Ansatz ist sehr kosteneffektiv, wenn eine große Anzahl von Proben bearbeitet wird, was die Kosten pro Probe erheblich senkt.

Der Prozess der gezielten Regionen-Sequenzierung umfasst das Design/Synthese von Sonden/Primern, die Erfassung der Zielregionen, den Aufbau der Bibliothek, die Paar-End-Sequenzierung und die bioinformatische Analyse basierend auf den Zielsequenzen. Spezifische Sonden-/Primer-Sets werden entworfen, um die gezielten Regionen entweder durch Hybridisierung oder Amplifikationsmethoden anzureichern. Bei der Hybridfängermethode werden biotinylierte Oligonukleotidsonden entworfen, um Zielregionen von Interesse innerhalb einer DNA-Fragmentbibliothek anzusprechen. Nach einer Hybridisierungsinkubation werden streptavidin-beschichtete magnetische Perlen verwendet, um die biotinylierte Sonden/Ziel-Hybride zu erfassen, was zu einer Bibliothek führt, die stark angereichert ist für die gezielte DNA. Die aktuelle Amplifikationsmethode basiert auf Multiplex-PCR oder einer Form der Primerverlängerung über die Zielregionen.

Die gezielte Regionen-Sequenzierung hat ein breites Spektrum an Anwendungen, einschließlich:

• Erkennung von SNPs/InDels/CNVs/SVs
• Entdeckung von Keimbahn- oder somatischen Mutationen
• Erkennung und Quantifizierung seltener Varianten und niederfrequenter Allele
• Verknüpfungsanalyse für erbliche Krankheiten
• Entdeckung von Biomarkern und therapeutischen Zielen

Vorteile der gezielten Regionssequenzierung

• Identifizierung von Varianten mit niedrigen Allelfrequenzen (bis zu 1%).
• Ein kleinerer Datensatz für die bioinformatische Analyse.
• Viel niedrigere Kosten bei einer großen Anzahl von Proben.
• Hohe Tiefe (500-1000X oder höher), die die Identifizierung seltener Varianten ermöglicht.

Gezielte Regionssequenzierung Arbeitsablauf

CD Genomics verwendet Illumina HiSeq-Geräte, um eine schnelle und präzise Sequenzierung gezielter Regionen sowie bioinformatische Analysen anzubieten. Unsere hochqualifizierten Experten führen das Qualitätsmanagement durch und befolgen jeden Schritt, um hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Der allgemeine Arbeitsablauf für die Sequenzierung gezielter Regionen ist unten skizziert.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen DNA-Menge ≥ 10 ng, DNA-Konzentration ≥ 1 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0. Alle DNA-Proben werden auf Reinheit und Menge validiert. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien HiSeq Plattformen PE150, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Deckungstiefe ≥ 100x; ≥ 500x wird für Krebsproben empfohlen. Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an, einschließlich: Qualitätskontrolle von Rohdaten Filtern und Ausrichten SNP/InDel/CNV/SV-Erkennung und Annotation Analyse somatischer Mutationen bei Krebs Komplexe Krankheitsanalyse Mendelianische Krankheitsanalyse De novo Mutationsanalyse für Familienproben DMR-Annotation und Anreicherungsanalyse (GO/KEGG) Weitere Analysen auf Ihre Anfrage hin Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in der gezielten Regionen-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics bietet ein umfassendes Servicepaket für die Sequenzierung gezielter Regionen an, das die Standardisierung von Proben, das Design von Sonden/Primern, die gezielte Erfassung, den Bibliotheksaufbau, die Tiefensequenzierung, die Qualitätskontrolle der Rohdaten und die bioinformatische Analyse umfasst. Wir können diese Pipeline auf Ihr Forschungsinteresse zuschneiden. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

1. Was ist der Unterschied zwischen der gesamten Exom-Sequenzierung und der gezielten Regionssequenzierung?

Trotz wahrscheinlich des gleichen Prinzips und Arbeitsablaufs, Whole-Exom-Sequenzierung fokussiert sich auf das Exom, während das gezielte Regionssequenzieren sich auf beliebige Gene konzentriert, die von Ihnen definiert werden.

2. Was muss ich einreichen?

Der Kunde, der den Dienst für die gezielte Region benötigt, muss die DNA- oder Gewebeproben sowie die Liste der Genkandidaten oder die chromosomale Lokalisation seiner Zielregion einreichen. Wir sind verantwortlich für die Generierung der Sonden, die Anreicherung des Ziels, den Bibliotheksaufbau, die Sequenzierung und die bioinformatische Analyse.

Wir akzeptieren die folgenden Probenarten für die gezielte Regionssequenzierung: gereinigte genomische DNA, PCR-Amplifikate, gefrorene Zellpellets, Bakterienkolonien, FFPE (formalinfixierte, paraffin-eingebettete) Gewebeschnitte, Gewebe, Blut und Abstriche.

3. Wie sieht es mit der Bearbeitungszeit aus?

Die gezielte Regionssequenzierung erfordert maßgeschneiderte Sonden, und die maßgeschneiderte Sonde muss weiter optimiert werden, um eine effektive Anreicherung der Zielregionen zu gewährleisten. Es dauert oft 40 Arbeitstage, um die Anpassung der Sonden und die Tiefensequenzierung abzuschließen. Es gibt jedoch kommerzielle Lösungen für die gezielte Regionssequenzierung, wie die SeqCap EZ Prime Choice Probes, die den Prozess der Anpassung der Sonden eliminieren können.

4. Wie validiert man Varianten?

Identifizierte Varianten durch die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) benötigen weitere Bestätigung mittels entweder NGS oder Sanger-SequenzierungLaut der Umfrage von Coppieters im September 2014 gaben fast 70 % der 178 Befragten an, dass sie ihre NGS-Ergebnisse derzeit mit NGS oder Sanger-Sequenzierung validieren. Wir werden Varianten mit NGS und Sanger-Sequenzierung validieren.

Abbildung 1. Eine Umfrage zu den Methoden zur Bestätigung von Varianten (Coppieters et al. 2016).

Referenz:

1. Coppieters F, Verniers K, De Leeneer K, et al. Zielgerichtete Neusequenzierung und Variantenvalidierung mit pxlence PCR-Assays. Biomolekulare Detektion und Quantifizierung, 2016, 6: 22-26.

Identifizierung einer neuartigen missense Mutation von MIP in einer chinesischen Familie mit kongenitalen Katarakten durch Zielregionen-Sequenzierung
Journal: Wissenschaftliche Berichte
Impactfaktor: 4,259
Veröffentlicht: 06. Januar 2017

Zusammenfassung

Die Autoren rekrutierten eine chinesische Familie mit autosomal dominanten kongenitalen Katarakten (ADCC). Sie fanden eine heterozygote Missense-Mutation c.634G>C (p.G212R) Substitution in der MIP Gen durch gezielte Regionssequenzierung. Zusammenfassend präsentiert die Studie genetische und funktionale Beweise für diese neuartige Mutation, die zu kongenitalen progressiven kortikalen Punktierungen mit oder ohne Y-Nähten führt. Der Proband (II:2) hatte einen anderen Typ von

Ergebnisse

1. Klinische Merkmale

Die Autoren untersuchten eine chinesische Familie (Abbildung 1) und stellten fest, dass der Proband (II:2) eine punktuelle Katarakt aufwies, während die anderen betroffenen Mitglieder punktuelle kortikale Trübungen in Kombination mit Y-suturalen Katarakten zeigten (Abbildung 2).

Abbildung 1. Stammbaum der Familie. Quadrate und Kreise stehen für Männer und Frauen. Schwarze Symbole kennzeichnen betroffene Mitglieder, während offene Symbole nicht betroffene Individuen darstellen. Die diagonale Linie kennzeichnet ein verstorbenes Familienmitglied, und der schwarze Pfeil zeigt den Probanden an. Sterne kennzeichnen sequenzierte Individuen.

Abbildung 2. Spaltlampenfotografien der Patienten. Der Proband II:2 (A) zeigte einen punktuellen Katarakt, während sein jüngerer Bruder II:6 (B) und der Sohn des Bruders III:5 (C) einen Y-Nähten-Katarakt in Kombination mit punktuellen kortikalen Trübungen zeigten.

2. Zielregionssequenzierung und Variantenanalyse

Ein maßgeschneidertes Fangpanel wurde entwickelt, um 351 Gene für genetische Augenerkrankungen zu erfassen, die aus OMIM (Human Genetics Knowledge for the World) und der veröffentlichten Literatur gesammelt wurden. Die Autoren fanden vier seltene Varianten in beiden Proben (Tabelle 1).

Tabelle 1. Seltene Varianten in Genen, die kongenitale Katarakte verursachen.

3. c.634G>C Mutation

Nur die c.634G>C-Mutation des MIP Das Gen war eine neuartige heterozygote Missense-Mutation, die Glycin an Position 212 in Arginin (p.G212R) umwandelte. Die Segregationsanalyse zeigte, dass die Mutation gut mit allen betroffenen Teilnehmern cosegregierte und bei nicht betroffenen Mitgliedern oder den 100 normalen Kontrollen nicht nachgewiesen wurde.

PolyPhen-2 und SIFT-Analysen deuteten stark darauf hin, dass die p.G212R-Mutation wahrscheinlich schädlich für das Protein ist und möglicherweise für die kongenitalen Katarakte verantwortlich sein könnte. Eine multiple Sequenzalignment zeigte, dass das Glycin an Position 212 von MIP ist unter verschiedenen Arten stark konserviert (Abbildung 3B).

Abbildung 3. Mutationsanalyse des MIP Gen.

mRNA- und Proteinspiegel von WT-MIP und G212R-MIP

Die Autoren untersuchten die Expression des Wildtyps. MIP und G212R-MIP in transfizierten Hela-Zellen. Es zeigte sich, dass die grüne Fluoreszenz in Hela-Zellen, die mit dem G212R-Konstrukt transfiziert wurden, viel schwächer war als die in Zellen, die mit dem Wildtyp-Konstrukt transfiziert wurden.

Die RT-PCR wurde verwendet, um das RNA-Transkriptionsniveau von WT- zu messen.MIP und G212R-MIP, was offenbarte, dass ein ähnlicher Verwandter MIP mRNA-Expressionsniveaus (Abbildung 4B). Dennoch zeigte der Western Blot, dass die Proteinexpressionsniveaus von MIP wurden signifikant im G212R- reduziertMIP Zellen (Abbildung 4C) stimmen mit den Ergebnissen der Fluoreszenzmikroskopie-Analyse überein.

Abbildung 4. mRNA- und Proteinspiegel von WT-MIP und G212R-MIP.

Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Studie schlagen die Autoren vor, dass die c.634G>C, G212R Substitution zur Pathogenese von ADCC in dieser chinesischen Familie beitragen könnte.

Die Zielregionensequenzierung ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die klinische Diagnose einer heterogenen Gruppe von monogenen Erkrankungen, aufgrund der kompatiblen Leistung bei der Erfassungsabdeckung, der geringeren Kosten und der kürzeren Bearbeitungszeit.