AAV (Adeno-assoziierter Virus) Integrationsstellenanalyse

Wo befindet sich die AAV-Genom-Integrationsstelle?

Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind bekannt für ihre Fähigkeit, Transgene effizient in verschiedene somatische Zellen innerhalb der Organe von Patienten zu übertragen. Obwohl sie traditionell als episomale Vektoren betrachtet werden, können AAV-Genome in das Genom der Wirtszelle integrieren, wobei die Integrationsfrequenzen in verschiedenen Zelltypen wie Hepatozyten, Fibroblasten, Muskelzellen und Neuronen zwischen 0,1 % und 3 % liegen. Integrationshotspots wurden an genomischen Stellen identifiziert, die durch palindromische Sequenzen, CpG-Inseln, Transkriptionsstartstellen (TSS) und aktive Gene gekennzeichnet sind.

Ein bedeutender Integrationsort ist das AAVS1-Locus, das sich innerhalb des PPP1R12C-Gens auf Chromosom 19 des menschlichen Genoms befindet. Dieser Ort ist bekannt für seine Fähigkeit, die Einspeisung exogener Gene zu ermöglichen, während eine stabile Genexpression aufrechterhalten wird, ohne die normale Zellfunktion und -entwicklung negativ zu beeinflussen. Folglich wird AAVS1 oft als "sicherer Hafen" bezeichnet, was es zu einem idealen Ziel für die Genbearbeitung und andere Anwendungen macht.

Wie integriert AAV?

Die Integration von AAV in das Wirtsgenom ist ein komplexer Prozess, der stark von Wirtsfaktoren abhängt, da AAV-Vektoren keine für die Integration notwendigen Proteine kodieren. Die AAV-Integration erfolgt typischerweise an Stellen von Doppelstrangbrüchen (DSBs) oder Einschnitten im Wirtsgenom. Diese Integration kann durch homologe Rekombination oder Mechanismen des nicht-homologen End-Joining erfolgen. Das Vorhandensein freier chromosomaler Enden, die für die Ligation mit AAV-Genomen verfügbar sind, deutet darauf hin, dass nukleäre Proteine, die an der DNA-Schadenreaktion beteiligt sind, eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Integrationsprozesses spielen.

Während präklinische und klinische Studien ein günstiges Sicherheitsprofil für AAV-Integrationen gezeigt haben, bestehen Bedenken hinsichtlich ihres langfristigen genotoxischen Potenzials. Hohe Dosen von AAV in präklinischen Modellen wurden mit hepatozellulärem Karzinom und klonalen Expansionen aufgrund der Aktivierung von Onkogenen in Verbindung gebracht. Folglich gewährleistet die AAV-Integration zwar eine anhaltende Transgenexpression und potenzielle weitere Vorteile, erfordert jedoch auch eine sorgfältige Berücksichtigung von Sicherheitsmaßnahmen.

Einführung in die Analyse von AAV-Integrationsstellen

AAV-Integrationsstellenanalyse ist ein wichtiges Forschungsinstrument, um die genomischen Interaktionen zwischen AAV-Vektoren und Wirtszellen zu verstehen. Obwohl AAV-Vektoren hauptsächlich in einem episomalen Zustand bestehen, bleibt ein Teil der virale Genome kann in das Wirtsgenom integriert werden, was Fragen zu Integrationspräferenzen und potenziellen Risiken aufwirft.

CD Genomics verfolgt einen hochauflösenden Ansatz, der sich auf die zielgerichtete Anreicherung von Sequenzen (TES) mit hybrider Erfassung von Kurzlesungen stützt. Diese Methode verwendet biotinylierte Sonden, um selektiv AAV-Wirt-Junction-Fragmente aus fragmentierter genomischer DNA zu erfassen, was eine empfindliche Erkennung von vollwertigen und verkürzten Einfügungen ermöglicht. Im Gegensatz zu amplifikationsbasierten Methoden erfordert TES keine intakten genomischen Enden und bietet eine unvoreingenommene Abdeckung von Integrationsereignissen. In Kombination mit maßgeschneiderten bioinformatischen Pipelines unterstützt diese Strategie eine präzise, hochdurchsatzfähige Profilierung von AAV-Integrationslandschaften.

Vorteile des AAV-Integrationsstellen-Analyse-Dienstes

• Umfassende CharakterisierungDer AAV-Integrationsstellen-Analyse-Service von CD Genomics ermöglicht die detaillierte Charakterisierung von AAV-Integrationsstellen, die entscheidend für das Verständnis der langfristigen Auswirkungen von AAV-Vektoren auf das Wirtsgenom ist.
• Erweiterte SicherheitsbewertungDurch die Identifizierung von Integrations-Hotspots und potenziellen onkogenen Insertionen hilft unser Service, die mit insertionsbedingter Mutagenese verbundenen Risiken zu mindern und die Sicherheit zu gewährleisten.
• Optimierte StrategienEinblicke aus Analysen der AAV-Integrationsstellen ermöglichen die Verfeinerung von Ansätzen, die eine gezielte Lieferung erleichtern und unerwünschte Wirkungen, die mit zufälliger Integration verbunden sind, minimieren.
• Unterstützung bei der Einhaltung von VorschriftenUmfassende Integrationsstandortanalysen sind zunehmend für regulatorische Einreichungen erforderlich. Unsere Dienstleistungen unterstützen Kunden dabei, die notwendigen regulatorischen Standards zu erfüllen.

Anwendungen der AAV-Integrationsstellenanalyse

Der AAV-Integrationsstellen-Analyse-Service von CD Genomics hat vielfältige Anwendungen in verschiedenen Bereichen, einschließlich:

• Onkologische Forschung: Die Analyse von Integrationsstellen ist entscheidend in der Onkologieforschung, insbesondere bei der Bewertung der Genotoxizität von AAV-Vektoren und ihrem Potenzial zur Tumorbildung.
• Immunologie Studien: AAV-Integration kann für Vorteile in immunologischen Anwendungen genutzt werden, wie z.B. zur Verbesserung der T-Zell-Funktionalität oder zur Bekämpfung von Immunmangelzuständen.
• Tiermodelle: Die Analyse von Integrationsstandorten in präklinischen Modellen liefert wertvolle Daten über die potenziellen Auswirkungen der AAV-Verabreichung und unterstützt die Vorhersage von Ergebnissen.

AAV-Integrationsstellen-Analyse-Workflow

Genomisches DNA wird aus AAV-behandelten Gewebe- oder Zellproben extrahiert. Bibliotheken werden erstellt und angereichert, indem hybrid-capture-basierte Short-Read-TES verwendet wird, die auf AAV-Wirt-Junktionen abzielt. Eine Illumina 150 bp Paar-End-Sequenzierung wird durchgeführt, um eine hochgradige Abdeckung zu erzeugen. Die Daten werden über eine maßgeschneiderte Pipeline verarbeitet, um Integrationsstellen zu identifizieren, Hotspot-Kartierungen durchzuführen und die klonale Expansion zu analysieren.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen gDNA>500 ng OD260/280=1,8 - 2,0 Keine Verschlechterung Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Hybrid-Capture-basierte Zielanreicherung-Sequenzierung Illumina NextSeq oder NovaSeq PacBio-Plattform
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle & Adapterkürzung Lesen der Ausrichtung auf die Wirts- und AAV-Referenzgenome AAV-Wirt-Fusionslesedetektion Analyse der Integrationsseitenfrequenz Hotspot-Clustering und genomische Annotation Klonale Expansionsprofilierung Schätzung der Vektor-Kopienanzahl Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte sind nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Rohdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht

Referenzen

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. AAV-Integration in menschlichen Hepatozyten. Molekulare Therapie, 2021, 29(10): 2898-2909.
2. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Integrierte Vektorgenom kann zur langfristigen Expression in der Leber von Primaten nach AAV-Verabreichung beitragen. Naturwissenschaftliche Biotechnologie, 2023: 1-11.
3. Henckaerts E, Dutheil N, Zeltner N, et al. Standortspezifische Integration des adenoassoziierten Virus umfasst eine partielle Duplikation des Zielortes. Sitzungsberichte der Nationalen Akademie der Wissenschaften, 2009, 106(18): 7571-7576.
4. Dyall J, Szabo P, Berns K I. Adeno-assoziiertes Virus (AAV) standortspezifische Integration: Bildung von AAV–AAVS1-Verbindungen in einem in vitro-System. Sitzungsberichte der Nationalen Akademie der Wissenschaften, 1999, 96(22): 12849-12854.
5. Calabria A, Cipriani C, Spinozzi G, et al. Intrathymische AAV-Zufuhr führt zu therapeutischer, standortspezifischer Integration an TCR-Loci in Mäusen. Blood, Das Journal der American Society of Hematology, 2023, 141(19): 2316-2329.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Referenz

1. Dalwadi D A, Calabria A, Tiyaboonchai A, et al. AAV-Integration in menschlichen Hepatozyten. Molekulare Therapie, 2021, 29(10): 2898-2909.

1. Was sind die Vorteile der Analyse von AAV-Integrationsstellen?

Die Analyse der AAV-Integrationsstellen charakterisiert Integrationsmuster, bewertet die Sicherheit, verfeinert Ansätze und unterstützt die Einhaltung von Vorschriften.

2. Wie führt CD Genomics die Analyse der AAV-Integrationsstellen durch?

Der Prozess umfasst die Probenentnahme, DNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung, bioinformatische Analyse und Dateninterpretation.

3. Wie wird die Qualität der Sequenzierungsdaten sichergestellt?

Qualitätskontrollmaßnahmen, wie FastQC, werden eingesetzt, um die Qualität der Sequierungsdaten vor der Analyse zu überprüfen.

4. Kann die Analyse von Integrationsstandorten potenzielle Sicherheitsbedenken vorhersagen?

Die Analyse identifiziert Integrations-Hotspots und potenzielle onkogene Insertionen, die dabei helfen, Risiken im Zusammenhang mit insertionsbedingter Mutagenese zu bewerten.

Integrierte Vektorgenome könnten zur langfristigen Expression in der Primatenleber nach AAV-Verabreichung beitragen.

Zeitschrift: Nature Biotechnology
Impactfaktor: 68,164
Veröffentlicht: 06. November 2023

Hintergrund

Leberbasierte AAV-Ansätze erreichen zunächst eine hohe Transgenexpression bei nichtmenschlichen Primaten, erfahren jedoch einen Rückgang über 90 Tage und stabilisieren sich auf niedrigeren Ebenen. Die Studie stellt fest, dass die AAV-vermittelte Expression eine kurzlebige Phase von episomalen Genomen und eine langfristige Phase von integrierten Vektoren umfasst, wobei genomische Integrationen in einem kleinen Bruchteil der Zellen nachgewiesen werden.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Die Studie untersuchte Faktoren, die die Transgenexpression in Leber-AAV-Systemen unter Verwendung von Rhesusaffen und β-Choriogonadotropin-Glykoprotein (rh-β-CG) als Transgen beeinflussen. Es wurden AAV8- und AAVrh10-Vektoren durch Leberbiopsien zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die rh-β-CG-Proteinspiegel früh anstiegen und sich auf niedrigeren Niveaus stabilisierten, während die Vektor-DNA und -RNA im Laufe der Zeit abnahmen, wobei die RNA in späteren Bewertungen stabil blieb.

Abb. 1: Anfänglicher Peak, gefolgt von einem Rückgang auf niedrigere stabile Werte des Selbst-Transgens nach i.v. Verabreichung von AAV-Vektoren an NHPs.

Die Studie ergab, dass AAV-Vektoren als komplexe concatemerische Strukturen in chromosomales DNA integrieren, wobei hohe Integrationsfrequenzen in nicht-exprimierenden Hepatozyten beobachtet wurden. Mit Hilfe der Sequenzierung inverser terminaler Wiederholungen (ITR-seq) identifizierten die Forscher Integrationsereignisse in der Leber-DNA, die eine weit verbreitete Verteilung im Genom zeigten, insbesondere in der Nähe von hoch exprimierten Lebergenen. Bemerkenswerterweise lagen keine der Integrationsstellen in Regionen, die mit Mutationen des hepatozellulären Karzinoms assoziiert sind. Klonale Expansionen wurden analysiert, wobei festgestellt wurde, dass Tiere, die bestimmten Vektoren ausgesetzt waren, mehr erweiterte Loci aufwiesen. Darüber hinaus zeigte die Langsequenzierung eine vielfältige Reihe von AAV-Sequenzen in vivo, die Umstrukturierungen und Trunkierungen hervorhob, die wahrscheinlich nach der Verabreichung auftraten.

Abb. 2: Lokalisierung der integrierten Vektor-DNA nach intravenöser Verabreichung von AAV-Vektoren an NHPs.

Abb. 3: Struktur der integrierten Vektor-DNA nach i.v. Verabreichung von AAV-Vektoren an NHPs.

Fazit

Die Studie zeigt, dass AAV in den Lebern von Primaten von Immunantworten und DNA-Reparatur beeinflusst wird. Persistente nukleare Bereiche von Vektor-DNA existieren neben abnehmender Transgenexpression, was auf eine potenzielle Stummschaltung hinweist. Integrationen mit niedriger Frequenz deuten darauf hin, dass die frühe Expression von episomalen Formen abhängt. Die Verbesserung der Effektivität könnte die Förderung der episomalen Aktivität und die gezielte Integration für Langlebigkeit umfassen.

Referenz

1. Greig J A, Martins K M, Breton C, et al. Integrierte Vektorgenom können zur langfristigen Expression in der Leber von Primaten nach AAV-Verabreichung beitragen. Naturwissenschaftliche Biotechnologie, 2023: 1-11.