Analyse der Integrationsstellen von Lentiviren/Retroviren

Einführung in die Analyse von Lentiviral/Retroviral-Integrationsstellen

Lentivirale Vektoren werden weithin als die vorherrschenden Systeme zur Genübertragung für die Erreichung stabiler genetischer Modifikationen von Zellen anerkannt. Diese Vektoren integrieren sich in das Wirtsgenom, um die Expression von Transgenen zu ermöglichen. Obwohl der Integrationsprozess des lentiviralen RNA-Genoms – zunächst in DNA umgeschrieben – scheinbar zufällig ist, weisen bestehende Literaturquellen auf die Existenz von Integrations-Hotspots hin. Angesichts des Potenzials der lentiviralen Integration, die Zellfunktion zu stören, insbesondere durch die Nähe zu Onkogenen oder kritischen Genen, ist es unerlässlich, die genauen Integrationsstellen nach der Infektion zu identifizieren. Die Auswahl der Integrationsstellen beeinflusst sowohl die Transgenexpression als auch den Phänotyp der Wirtszelle erheblich. Folglich ist die Analyse der Integrationsstellen ein unverzichtbares Werkzeug zur Bewertung der Sicherheit dieser Vektoren und zur Überwachung der klonalen Dynamik modifizierter Zellen in vivo.

Unser Labor hat eine fortschrittliche Suite von Methoden zur umfassenden Analyse von viralen Integrationsstellen entwickelt. Durch die Integration von PCR- und sequenzierungsbasierten Techniken mit proprietären bioinformatischen Pipelines bieten wir unvergleichliche Präzision und Sensitivität bei der Identifizierung von Integrationsstellen und der Quantifizierung von viralen Vektorfrequenzen. Unser End-to-End-Service umfasst PCR-Amplifikation, Bibliothekskonstruktion, Paar-Ende (PE) Sequenzierung und rigorose bioinformatische Analysen. Wir sind bestrebt, Daten von höchster Qualität und zuverlässige analytische Berichte zu liefern, um robuste und reproduzierbare Ergebnisse für unsere Kunden zu gewährleisten.

Methoden zur integrativen Standortanalyse

Die erste Erforschung von viralen Integrationsstellen verwendete Southern Blotting und genomische Bibliotheken, um die Merkmale der Integrationsstellen zu charakterisieren. Im Laufe der Zeit haben PCR-Techniken (Polymerase-Kettenreaktion) das Southern Blotting aufgrund ihrer Einfachheit und Genauigkeit ersetzt. Je nach verwendeter PCR-Methodik kann die Analyse von viralen Integrationsstellen in Reverse PCR, Ligated Mediated PCR (LM-PCR) und Linear Amplification Mediated PCR (LAM-PCR) kategorisiert werden.

• Reverse-PCR

Reverse-PCR umfasst die Zirkularisierung von DNA-Fragmenten nach enzymatischer Verdauung. Spezifische Primer werden dann entworfen, um Sequenzen zu amplifizieren, die die virale Integrationsstelle flankieren. Allerdings begrenzt die geringe Effizienz der Zirkularisierung mit Ligase deren weitverbreitete Anwendung.

• LM-PCR

Bei der LM-PCR wird DNA enzymatisch fragmentiert, und Adapter werden an beiden Enden der Fragmente ligiert. Primer, die sowohl virale DNA als auch die fixierten Adaptersequenzen erkennen, werden verwendet, um Integrationsstellen zu amplifizieren und somit deren Positionsinformationen freizulegen. Die LM-PCR zeichnet sich durch ihr einfaches Prinzip und ihre Benutzerfreundlichkeit aus und behält ihre Relevanz von der Entstehung bis heute.

• LAM-PCR

LAM-PCR beginnt mit der linearen Amplifikation von DNA, wodurch einzelsträngige Produkte erzeugt werden. Diese einzelsträngigen Moleküle werden dann einer weiteren Amplifikation durch LM-PCR unterzogen. Die Einführung der linearen Amplifikation erhöht sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität von LAM-PCR erheblich, was es überlegen gegenüber Reverse PCR und LM-PCR macht und zu seiner breiten Anwendung führt.

• Next-Generation Sequencing für lentivirale Integration

Derzeit stellt die Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Next-Generation Sequencing (NGS) die Hauptplattform zur Erkennung von lentiviralen Integrationsstellen dar. Die am weitesten verfeinerte und genutzte Methode zur Erstellung angereicherter Bibliotheken für die Analyse von Integrationsstellen in industriellen Anwendungen und klinischer Forschung umfasst mechanische Fragmentierung und adapterbasierte Amplikonbibliotheksvorbereitung (wie LM-PCR-Techniken wie INSPIIRED). Diese Methodik wurde umfassend in der Sicherheitsbewertung verschiedener CAR-T19-Klinikprojekte sowie in retrospektiven pharmakodynamischen Analysen im Zusammenhang mit der Proliferation von CAR-T-Zellen angewendet.

Vorteile unseres Analyse-Service für Lentiviral/Retroviral-Integrationsstellen

• Reife Techniken zur Analyse von Integrationsstandorten.
• Multiplexproben für kosteneffektive Ergebnisse.
• Effizienter Arbeitsablauf und schnelle Bearbeitungszeit.
• Qualitative und quantitative Analyse.
• Umfassende bioinformatische Analyse.
• Verschiedene Ansätze, um unterschiedliche Ziele zu erreichen.

Anwendungen der Analyse von Lentiviral/Retroviral-Integrationsstellen

Sicherheitsbewertung:

• Vermeidung von insertionsbedingter Mutagenese
• Überwachung langfristiger Auswirkungen

Virologie Forschung:

• Verstehen des viralen Lebenszyklus
• Entwicklung von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten

Optimierung transgener Tiermodelle

• Stabilität und Ausdruck verbessern
• Reduzierung von Nebenwirkungen

Regenerative Medizin und Zellforschung

• Verbesserung der Forschungseffizienz
• Zellschicksalsverfolgung

Grundlagen der biologischen Forschung

• Erforschung der Genomstruktur und -funktion
• Untersuchung genomischer Umstellungen

Analyse-Workflow für Integrationsstellen von Lentiviren/Retroviren

Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement nach jedem Verfahren durch, um umfassende und genaue Ergebnisse sicherzustellen. Unser Workflow zur Analyse von Lentiviralen Integrationsstellen ist unten aufgeführt, einschließlich Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und bioinformatischer Analyse.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen gDNA-Probe ≥500 ng Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina Hiseq/NovaSeq PE150 Plattform Für die LM-PCR-Methode (geeignet für Proben mit bekannten LTR-Sequenzen): Erstellen Sie eine Bibliothek mit einer Einfügungsgröße von 400~600 bp; 1 Gb Datenoutput. Für die WGS-Methode (nur geeignet für monoklonale Zelllinien): Erstellen Sie eine 350 bp Bibliothek, ~50X Abdeckung.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Datenqualitätskontrolle Ausrichtung an das Referenzgenom und Einfügesequenzen Integrationsstandort-Erkennung Integrationsseitenanmerkung Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Analyse von Lentiviral/Retroviral-Integrationsstellen für Ihr Schreiben (Anpassung)

Der Analyse-Service für Lentivirale Integrationsstellen von CD Genomics nutzt die Leistungsfähigkeit der Illumina-Plattform zur Erkennung von Integrationsstellen und hat einen kostengünstigen, hochdurchsatzfähigen Ansatz entwickelt, der auf Zielanreicherungs-Sequenzierung oder LM-PCR-Methoden basiert. Wir freuen uns, unsere umfangreiche Erfahrung und unsere fortschrittliche Plattform einzusetzen, um den besten Service und die qualifiziertesten Produkte anzubieten, um jede Anforderung unserer Kunden zu erfüllen.

Referenz

1. Dawes JC, Webster P, Iadarola B, et al. LUMI-PCR: ein Illumina-Plattform-Ligation-vermitteltes PCR-Protokoll zur Klonierung von Integrationsstellen, bietet molekulare Quantifizierung von Integrationsstellen. Mob-DNA. 2020; 11:7.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Was ist die Analyse von Lentiviral/Retroviral-Integrationsstellen?

Die Analyse von Integrationsstellen von Lentiviren/Retroviren ist eine anspruchsvolle Technik, die verwendet wird, um zu untersuchen, wie Lentivirus- und Retrovirus-Genome in das Genom der Wirtszelle integriert werden. Durch die Identifizierung und Kartierung dieser Integrationsstellen erhalten Forscher wichtige Einblicke in die Mechanismen der viralen Integration, bewerten die Sicherheit der Vektoren und überwachen das in vivo Verhalten von transgenen Zellen.

2. Warum ist eine Analyse des Integrationsstandorts notwendig?

Die Analyse der Integrationsstelle ist entscheidend für die Bewertung der Sicherheit von viralen Vektoren. Sie stellt sicher, dass diese Vektoren nicht in kritische Regionen des Wirtsgenoms einfügen, was potenziell Onkogenese oder andere genetische Störungen auslösen könnte. Darüber hinaus hilft diese Analyse den Forschern, die Präferenzen und Mechanismen der viralen Integration zu verstehen, und bietet somit wesentliche Unterstützung für die Entwicklung sichererer und effektiverer vektorbasierten Ansätze.

3. Was sind die grundlegenden Schritte der Integrationsstandortanalyse?

Das grundlegende Verfahren zur Analyse von Integrationsstellen von Lentiviren/Retroviren umfasst die folgenden Schritte:

• Infektion von ZielzellenInfizieren Sie die Zielzellen mit dem viralen Vektor.
• Isolierung von genomischer DNAExtrahiere die genomische DNA aus den infizierten Zellen.
• RestriktionsenzymverdauVerdauen Sie die isolierte genomische DNA mit Restriktionsendonukleasen.
• Ligation von AdaptersequenzenLegen Sie Adaptersequenzen an die verdauten DNA-Fragmente an.
• PCR-AmplifikationFühren Sie eine PCR-Amplifikation durch, um DNA-Fragmente mit viralen Integrationsstellen anzureichern.
• BibliotheksbauKonstruiere Sequenzierungsbibliotheken aus den angereicherten PCR-Produkten.
• Hochdurchsatz-SequenzierungDurchführung Hochdurchsatz-Sequenzierungwie zum Beispiel Illumina-Sequenzierung.
• Datenanalyse und IntegrationsstandortidentifikationAnalysiere die Sequenzierungsdaten, um die viralen Integrationsstellen zu identifizieren und zu charakterisieren.

4. Welche Werkzeuge und Techniken werden benötigt?

Die Analyse von Integrationsstandorten umfasst typischerweise die folgenden Werkzeuge und Techniken:

• RestriktionsendonukleasenEnzyme, die verwendet werden, um genomische DNA an spezifischen Sequenzen zu verdauen.
• PCR-AmplifikationTechniken zur selektiven Amplifikation von DNA-Sequenzen, die virale Integrationsstellen enthalten.
• Adapter-LigationDie Methode zum Anbringen von Adaptersequenzen an DNA-Fragmente zur Erleichterung der Sequenzierung.
• Hochdurchsatz-SequenzierungPlattformen wie die Illumina-Sequenzierung zur Erzeugung umfangreicher Sequenzdaten.
• Bioinformatik-AnalysetoolsSoftware und Algorithmen für die Sequenzanpassung (z. B. BLAST, Bowtie) und Datenanalyse (z. B. R, Python), um die Standorte der Integrationsstellen und deren Eigenschaften zu ermitteln.

Genomweite Erkennung von Integrationsstellen mittels Cas9-angereicherter amplifikationsfreier Langstrecken-Sequenzierung

Zeitschrift: Nucleinsäurenforschung
Impact Faktor: 8,278
Veröffentlicht: 22. Februar 2021

Hintergrund

Genübertragungsvektoren, insbesondere Lentiviren, werden verwendet, um genetisches Material in Zellen einzufügen. Fortschritte in der Vektortechnologie und Sequenzierungsmethoden haben ihre Sicherheit und Präzision verbessert. Neue Techniken wie die Nanopore MinION-Sequenzierung ermöglichen eine genaue Kartierung der Integrationsstellen von Vektoren und verbessern unser Verständnis ihrer Auswirkungen.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Die Analyse der Integrationsstellen zeigt, dass lentivirale Vektoren zufällig in verschiedenen Zellmodellen und Spezies integrieren. Die meisten Integrationen erfolgen in Genregionen, wobei eine Präferenz für Introns gegenüber Exons besteht, jedoch kein signifikanter Muster oder Überlappung zwischen verschiedenen Vektortypen oder Zelllinien zu erkennen ist. Diese Zufälligkeit deutet darauf hin, dass lentivirale Vektoren keine spezifischen genomischen Regionen anvisieren, was auf eine breite Verteilung ohne Vorliebe für Onkogene hindeutet.

Abbildung 1. Positionsanalyse der identifizierten IS.

Abbildung 2. Identifizierung mehrerer Integrationsstellen (MIS).

Fazit

Die in dieser Studie verwendete Methode erkennt lentivirale Integrationsstellen ohne DNA-Amplifikation, indem Cas9 verwendet wird, um Adapter für das Long-Read-Nanopore-Sequencing anzubringen. Dieser Ansatz liefert schnellere Ergebnisse als traditionelle Methoden und vermeidet Verzerrungen durch PCR. Er bietet eine detaillierte Kartierung der Integrationsstellen mit langen Reads, erfordert jedoch mehr DNA und könnte einige Stellen aufgrund des hohen Eingangsbedarfs übersehen. Die Methode kann auch für andere genomische Analysen angepasst werden und offenbart zusätzliche genetische Details, die von aktuellen Methoden nicht erfasst werden.

Referenz

1. van Haasteren J, Munis AM, Gill DR, et al. Genomweite Erkennung von Integrationsstellen mittels Cas9-angereicherter amplifikationsfreier Langstrecken-Sequenzierung. Nucleic Acids Research. 2021, 49(3): e16-.