EM-seq Dienst

DNA-Methylierung ist entscheidend für die Regulierung der Genexpression und beeinflusst eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich Entwicklung, Alterung und verschiedener Krankheiten wie Krebs. Mit dem Fortschritt der Genomforschung steigt die Nachfrage nach effizienteren und genaueren Methoden zur Detektion von DNA-Methylierung. EM-seq (enzymatische Methylierungssequenzierung) tritt als neuartige Technologie zur Analyse von DNA-Methylierung auf und führt mit modernsten Vorteilen in der präzisen Methylierungsanalyse. Es bietet beispiellose Lösungen mit erhöhter Sensitivität, Genauigkeit und minimalen Anforderungen an die DNA-Menge.

Bei CD Genomics nutzen wir die Leistungsfähigkeit der EM-seq-Technologie, um außergewöhnliche Methylierungsanalysedienste anzubieten, die es Ihnen ermöglichen, die Feinheiten der Genregulation und die Mechanismen, die verschiedenen Krankheiten zugrunde liegen, zu erkunden. Auf dieser umfassenden Serviceseite werden wir die wichtigsten Aspekte von EM-seq, seine technologischen Vorteile, Anwendungsbereiche und die Art und Weise, wie wir fortschrittliche Unterstützung bieten, die auf Ihre Forschungsbedürfnisse zugeschnitten ist, näher beleuchten.

Einführung in die EM-seq-Technologie

EM-seq ist eine enzymbasierte DNA-Methylierungssequenzierungstechnologie, die zwischen unmethylierter Cytosin (C) und methylierter 5-Methylcytosin (5mC) mithilfe enzymatischer Methoden unterscheidet. Im Gegensatz zur traditionellen Bisulfit-Konversionsmethode (WGBS) verwendet EM-seq enzymatische Katalyse, um unmethylierte Cytosine in Uracil (U) umzuwandeln, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Während der anschließenden Amplifikation und Sequenzierung wird Uracil als Thymin (T) erkannt. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Erkennung von Methylierungsstellen.

Vergleich der enzymatischen Umwandlung und der Bisulfitumwandlung

Die konventionelle Bisulfit-Konversionsmethode ist effektiv zur Erkennung von Methylierung. Sie erfordert jedoch strenge Reaktionsbedingungen, die oft DNA schädigen und ihre Anwendung bei DNA-Proben mit geringem Input einschränken. EM-seq überwindet diese Probleme, indem es die DNA-Integrität bewahrt und es ermöglicht, ein breiteres Spektrum an Proben zu verarbeiten, einschließlich spuren- und fragiler DNA-Proben wie zirkulierendem Tumor-DNA (ctDNA).

Experimentelles Prinzip

EM-seq bietet eine umfassende und robuste Lösung zur Identifizierung von Methylierungsregionen im menschlichen Genom. Während der Bibliotheksvorbereitung wird eine einzigartige enzymatische Umwandlung eingesetzt, die viel weniger Schäden an der DNA verursacht und kleinere Probenmengen erfordert, was zu qualitativ hochwertigeren und leistungsfähigeren Bibliotheken führt. Das maßgeschneiderte Methylierungsproben-Design von Twist bietet effektive, spezialisierte Sonden für die gezielte CpG-Anreicherung. Optimierte Hybridisierungsreagenzien erhöhen die Flexibilität der Arbeitsabläufe und verbessern die On-Target-Raten.

Die Methylierungssequenzierung umfasst enzymatische oder chemische Methoden, die unmethylierte Cytosine durch Deaminierung in Uracil umwandeln, während methylierte Cytosine intakt bleiben. Während der Amplifikation paart sich komplementäres Adenin mit Uracil auf dem komplementären Strang, wodurch Thymin an der ursprünglichen unmethylierten Cytosin-Position eingeführt wird. Das Endprodukt der Sequenz ist asymmetrisch und erzeugt nach der Umwandlung zwei unterschiedliche doppelsträngige DNA-Moleküle. Bei methylierter DNA führt der Prozess zu einem alternativen Sequenzmuster, das den Unterschied zwischen methylisierten und unmethylisierten Regionen in DNA-Sequenzen veranschaulicht.

Abbildung 1. Die Methylierungssequenzierung umfasst enzymatische oder chemische Methoden.

In der Anfangsphase der Reaktion spielt die Ten-Eleven Translocation Dioxygenase 2 (TET2) eine entscheidende Rolle bei der Umwandlung von methylierte Cytosinen wie 5-Methylcytosin (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) in 5-Carboxycytosin (5caC). Dies wird durch einen Oxidationsbooster, 5-Glucosylhydroxymethylcytosin (5ghmC), weiter verstärkt. Diese Reaktionen dienen als Schutzmechanismen, die 5mC und 5hmC vor nachfolgenden Deaminierungsaktivitäten abschirmen.

Vor der Deaminierung von Cytosinen zu Uracil durch das Enzym APOBEC wird die DNA denaturiert, um sie auf weitere Reaktionen vorzubereiten. Die anschließende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wandelt modifiziertes 5mC oder 5hmC in Cytosin um und konvertiert Uracil in Thymin. Nach der PCR spiegelt die Nukleinsäuresequenz die der bisulfid-konvertierten Sequenzen wider, was die Kompatibilität von EM-seq mit bestehenden Analyse-Workflows, einschließlich Tools wie Bismark und bwa-meth, gewährleistet.

Effizienz der enzymatischen Umwandlung

Vorteile von EM-seq

EM-seq übertrifft die traditionelle Bisulfit-Konversionsmethode in mehreren wichtigen Aspekten, insbesondere bei der Arbeit mit geringen Mengen DNA. Hier sind einige Hauptvorteile der EM-seq-Technologie:

1. Niedrige DNA-Eingabe und hohe EmpfindlichkeitEiner der Hauptvorteile von EM-seq ist die Fähigkeit, hochwertige Sequenzierungsdaten aus minimalen DNA-Mengen zu gewinnen. Im Gegensatz zu WGBS verursacht EM-seq weniger Schäden an der DNA, sodass eine Sequenzierung mit nur 10 ng DNA möglich ist. Dieses Merkmal ist von unschätzbarem Wert für die Analyse seltener oder wertvoller Proben, wie z.B. zirkulierendes Tumor-DNA (ctDNA) im Plasma, die typischerweise niedrig in Konzentration und Molekulargewicht sind.

2. Längere, vollständigere BibliotheksfragmenteIm Vergleich zu WGBS erzeugt EM-seq längere und intaktere DNA-Fragmente, wodurch Sequenzierungslücken minimiert werden. Dies erhöht die Vollständigkeit der genombreiten Methylierungsinformationen, insbesondere in schwer sequenzierbaren Regionen, indem es effektiv die durch kurze DNA-Fragmente verursachten Sequenzierungsblindstellen reduziert.

3. Überlegene Gleichmäßigkeit der GC-AbdeckungDNA-Regionen mit hohem GC-Gehalt stellen oft Herausforderungen bei der Sequenzierung dar, da potenzielle Verzerrungen die Genauigkeit beeinträchtigen können. EM-seq zeichnet sich in diesem Bereich aus und gewährleistet eine gleichmäßige Abdeckung sowohl in GC-reichen als auch in AT-reichen Bereichen, wodurch die in WGBS häufig vorkommende GC-Abdeckungsverzerrung vermieden wird. Dieses Merkmal ist entscheidend für die genaue Analyse der Methylierungszustände im gesamten Genom.

4. Genauere Erkennung von CpG-InselnEM-seq ist besonders effektiv bei der Erkennung von CpG-Inseln. Bei vergleichbaren Sequenzierungstiefen kann EM-seq mehr CpG-Stellen aufdecken, von denen viele durch traditionelle WGBS-Methoden übersehen werden könnten. Diese Fähigkeit ist besonders wichtig für das frühe Screening von Krankheiten wie Krebs, bei denen Methylierungsänderungen in CpG-Inseln als frühe Krankheitsmarker dienen können.

Anwendungen von EM-seq

In der heutigen schnell fortschreitenden wissenschaftlichen Landschaft hat sich die EM-seq-Technologie als leistungsstarkes Werkzeug mit umfangreichen Anwendungen in verschiedenen Bereichen etabliert. Ihre Fähigkeit, DNA-Proben in niedrigen Konzentrationen zu detektieren und Veränderungen in der DNA-Methylierung zu untersuchen, macht sie besonders wertvoll. So transformiert EM-seq wichtige Forschungs- und Entwicklungsbereiche:

• Früherkennung von Krebs: Screening und FlüssigbiopsienEM-seq spielt eine entscheidende Rolle bei der frühen Erkennung und fortlaufenden Überwachung von Krankheiten, indem es cfDNA-Methylierungsmarker in Körperflüssigkeiten wie Plasma und Urin identifiziert.
• Eintauchen in die EpigenetikDiese Technik hilft dabei, zu enthüllen, wie die DNA-Methylierung die Genexpression und biologische Prozesse beeinflusst und Licht auf die epigenetischen Variationen in verschiedenen biologischen Zuständen wirft.
• Präzision in der Analyse von SpurensamplesEgal, ob es sich um wertvolle Proben wie Eizellen, Spermatocyten oder Embryonen handelt, EM-seq liefert hochgenaue Methylierungsinformationen, selbst aus winzigen Proben.
• Pionierhafte Entdeckung von BiomarkernEM-seq ist entscheidend für die Auswahl und Validierung von Methylierungsmarkern, die mit spezifischen biologischen Prozessen in Verbindung stehen, und unterstützt zukünftige Forschungs- und Entwicklungsbemühungen.
• Genomische und epigenetische Einblicke in KrankheitenDurch die Entschlüsselung der Rolle der DNA-Methylierung trägt EM-seq erheblich zu unserem Verständnis biologischer Mechanismen bei und liefert Einblicke in komplexe Krankheitsprozesse.
• Verbesserung der ArzneimittelentwicklungDie Technologie wird genutzt, um zu untersuchen, wie Medikamente die DNA-Methylierungsmuster beeinflussen, und bietet wichtige molekulare Daten, die das Screening und die Optimierung von Arzneimitteln erleichtern.
• Erforschung der Biodiversität und EvolutionEM-seq analysiert Methylierungsmuster über verschiedene Arten oder Populationen hinweg und hilft dabei, adaptive Veränderungen und die genetischen Mechanismen, die sie steuern, aufzudecken.
• Analyse der Methylierung von TranskriptionsstartstellenEs bewertet genau den Methylierungsstatus an Transkriptionsstartstellen (TSS), insbesondere in GC-reichen Regionen, um deren regulatorische Rollen in der Genexpression aufzudecken.

Plattformvergleich für die DNA-Methylierungsanalyse

EM-seq Arbeitsablauf

Die Inanspruchnahme unserer Dienstleistungen bietet ein nahtloses Erlebnis, das darauf ausgelegt ist, hochwertige Ergebnisse für Ihre EM-seq-Projekte zu liefern. So stellen wir Exzellenz in jedem Schritt sicher:

Schritt 1: DNA-ExtraktionWir beginnen damit, hochwertiges genomisches DNA sorgfältig aus Ihren Proben zu extrahieren. Dieser entscheidende erste Schritt stellt sicher, dass die DNA intakt und frei von Verunreinigungen ist, und legt somit eine solide Grundlage für weitere Analysen.

Schritt 2: BibliotheksvorbereitungMit modernsten Technologien zur Bibliotheksvorbereitung bereiten wir Ihre DNA-Proben geschickt für die EM-seq-Sequenzierung vor. Dieser Prozess ist entscheidend, um sicherzustellen, dass Ihre Proben optimal für genaue Ergebnisse vorbereitet sind.

Schritt 3: SequenzierungIhre DNA-Bibliothek wird dann mit den neuesten Technologien der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) sequenziert. Diese Phase ermöglicht es uns, umfassende genomweite Methylierungsdaten zu erfassen und bietet einen umfassenden Überblick über die epigenetische Landschaft.

Schritt 4: DatenanalyseUnser Expertenteam für Bioinformatik erstellt einen detaillierten Datenanalysebericht für Sie. Dieser Bericht umfasst Methylierungslevels, die Identifizierung von unterschiedlich methylierten Regionen und die Erkennung von CpG-Inseln, sodass Sie umsetzbare Erkenntnisse aus Ihren Daten gewinnen können.

Abbildung 1. Die Methylierungsequenzierung umfasst enzymatische oder chemische Methoden.

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen Probenarten: Gewebe, Zellen und Körperflüssigkeiten von Krebspatienten. Unter den Körperflüssigkeitsproben wird Plasma gegenüber Serum empfohlen, um Störungen durch aus Lymphozyten stammende cfDNA zu minimieren. Probenvolumen: Gewebe > 50 mg; Zellen > 2×106; Plasma > 5 mL, Serum > 10 mL. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien Plattform: Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen wie die Illumina HiSeq-Serie. Deckungstiefe: ≥ 30x. Qualitätsbewertung: Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: 1. Genom-Ausrichtungsstatistiken 2. Gesamtbewertung des Methylierungsniveaus 2.1 Verteilung des CpG-Methylierungsniveaus 2.2 CpG-Methylierungsabdeckung 3. Methylierungsstellenstatistiken und Inter-Proben-Vergleich 3.1 Analyse der Korrelationslevel der Methylierung 3.2 Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Methylierungsniveaus 3.3 Clusteranalyse der Methylierungsniveaus 4. Analyse differenzieller Methylierungsstellen 4.1 Annotation von differentiell methylierten Stellen 4.2 Visualisierung von differentiellen Methylierungsstellen 4.3 Anreicherungsanalyse von differentiell methylierten Stellen 5. Analyse der differentiellen Methylierungsregionen 5.1 Annotation von differentiell methylierten Stellen 5.2 Visualisierung von differentiellen Methylierungsstellen 5.3 Anreicherungsanalyse von differentiell methylierten Stellen Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Originale Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Detaillierte Methylierungsprofilierung

EM-seq, als revolutionäre DNA-Methylierungssequenzierungstechnologie, übertrifft die traditionelle Bisulfit-Konversionsmethode mit ihren Vorteilen in Bezug auf niedrige DNA-Eingabe, hohe Sensitivität und gleichmäßige GC-Abdeckung und bietet hochwertigere und genauere Methylierungsdaten für verschiedene Forschungsbereiche. Bei CD Genomics sind wir bestrebt, unseren Kunden die fortschrittlichsten EM-seq-Dienste anzubieten, um Ihnen bei der eingehenden Erforschung der Genregulation, der Krankheitsmechanismen, der Krebsforschung und anderer Bereiche zu helfen.

Egal, ob Sie Grundlagenforschung betreiben oder fortschrittliche Diagnosetools entwickeln, EM-seq-Dienste können hervorragende Unterstützung für Ihre Forschung bieten. Zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren, um mehr über EM-seq zu erfahren oder ein Angebot anzufordern, und lassen Sie diese fortschrittliche Technologie Ihnen helfen, neue wissenschaftliche Durchbrüche zu erzielen.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

CpG-Methylierungsverteilungshistogramm

CpG-Abdeckungs-Histogramm

Korrelationsanalyse zwischen Proben

Vulkan-Plot von unterschiedlich methylierten Stellen

Heatmap der unterschiedlich methylierten Stellen

KEGG-Anreicherungsanalyse von unterschiedlich methylierten Regionen

Was sollte bei der Extraktion von gDNA oder cfDNA beachtet werden?

Beim Extrahieren von genomischer DNA (gDNA) oder zellfreier DNA (cfDNA) wird empfohlen, Folgendes zu erreichen:

• gDNA-AnforderungGesamt ≥20 ng, Konzentration ≥2 ng/μl
• cfDNA-AnforderungGesamt ≥20 ng, Konzentration ≥2 ng/μl

Darüber hinaus ist es entscheidend, EDTA oder EB nicht als Lösungsmittel für Ihr extrahiertes gDNA/cfDNA zu verwenden, da diese Komponenten die enzymatische Effizienz negativ beeinflussen können.

Welche Vorsichtsmaßnahmen sollten beim Trennen von Serum oder Plasma getroffen werden?

Beim Trennen von Serum oder Plasma:

• Vermeiden Sie das Einfrieren und AuftauenVollblutproben sollten keinen Frost-Tau-Zyklen unterzogen werden.
• Rechtzeitige VerarbeitungBereiten Sie Plasma oder Serum so schnell wie möglich nach der Blutentnahme vor.
• LagerbedingungenSerum oder Plasma können bei -80°C gelagert werden, um die Integrität zu erhalten. Wiederholte Gefrier- und Auftauzyklen sollten vermieden werden, um die Probenqualität zu bewahren.

Wie wird die Konversionsrate berechnet?

Während der Methylierungsbibliotheksvorbereitung geht die theoretische Umwandlung davon aus, dass alle unmethylierte Cytosine (C) in Thymin (T) umgewandelt werden (ursprünglich in Uracil (U) umgewandelt, dann während der PCR in T). Allerdings können nicht alle Stellen umgewandelt werden, und der Methylierungsstatus der DNA ist anfänglich unbekannt. Daher können die tatsächlichen Umwandlungsraten nicht direkt aus der Proben-DNA bestimmt werden.

Um dies zu adressieren, wird Lambda-DNA (Bakteriophagen-DNA), die nur unmethyliertes Cytosin enthält, als negativer Kontrollstandard mit bekanntem Methylierungsstatus verwendet. Durch die Einbeziehung von Lambda-DNA in die Bibliotheksvorbereitung, Verarbeitung und Sequenzierung zusammen mit der Proben-DNA wird die Umwandlungsrate der Lambda-DNA berechnet, um als Indikator für die Gesamtumwandlungsrate der Probe zu dienen.

Multimodale epigenetische Sequenzierungsanalyse (MESA) von zellfreier DNA zur nicht-invasiven Krebsdetektion

Journal: Genommedizin
Impactfaktor: 7,324
Veröffentlicht: 16. Januar 2024

Hintergrund

Die Methylierung von zellfreier DNA (cfDNA) hat sich als vielversprechender Biomarker für die frühe Krebsdiagnose herauskristallisiert und überwindet die Einschränkungen genetisch basierter Ansätze. Die enzymatische Methyl-sequenzierung (EM-seq) verbessert die traditionelle Bisulfit-Sequenzierung, indem sie die DNA-Integrität bewahrt und eine multimodale epigenetische Analyse ermöglicht, die die Genauigkeit der Krebsdiagnose erhöht.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

MESA (Multimodale Epigenetische Sequenzierungsanalyse) zeigte eine starke Leistung bei der Erkennung von kolorektalem Krebs durch die Integration mehrerer epigenetischer Merkmale aus cfDNA. Zu den wichtigsten Ergebnissen gehören:

1. Methylierungsanalyse:

• cfDNA-Methylierung allein unterschied Krebs- von Nicht-Krebs-Proben mit hoher Genauigkeit (AUC = 0,8663 für Kohorte 1 und AUC = 0,8293 für Kohorte 2).
• Krebsmuster zeigten höhere Methylierungsniveaus an den Ziel-CpG-Stellen, was mit einer Promotorhypermethylierung in Tumoren übereinstimmt.

Differenzielle cfDNA-Methylierung zwischen Krebs- und Nicht-Krebs-Proben ermöglicht eine genaue Krebsdiagnose.

2. Einblicke in die Nucleosomenorganisation:

• MESA erfasste effektiv die Nukleosomenbesetzung und -unschärfe und offenbarte wichtige strukturelle Unterschiede zwischen Krebs- und Normalproben.
• Polyadenylierungsstellen wurden erstmals in die Analyse einbezogen und lieferten neuartige Einblicke in die krebsbezogene Chromatinorganisation.

Nukleosomen-Organisationsinformationen aus gezieltem EM-seq von cfDNA.

3. Krebsdiagnose anhand von Nucleosomenmerkmalen:

• Die Nucleosomenbesetzung allein erreichte AUCs von 0,8494 (Kohorte 1) und 0,9213 (Kohorte 2).
• Die Einbeziehung von Daten zu Polyadenylierungsstellen verbesserte die Genauigkeit der Krebsdiagnose weiter.
• Die Nucleosomen-Unschärfe, eine neuartige Kennzahl zur Erfassung der Chromatin-Heterogenität, bot zusätzliche prädiktive Kraft.

4. Multimodale Integration für verbesserte Genauigkeit:

• Die Kombination von Methylierung, Nukleosomenbesetzung, Unschärfe und WPS verbesserte die Klassifikationsleistung.
• Das multimodale Modell übertraf konsequent Modelle mit einzelnen Merkmalen in verschiedenen Krebsstadien und Kohorten.

Genauigkeit der Krebsdetektion basierend auf Nukleosomenbesetzung und Unschärfe.

5. Kreuzvalidierung zwischen Kohorten:

• MESA war in verschiedenen Kohorten robust und hielt eine hohe prädiktive Genauigkeit aufrecht.
• Der Ansatz war anpassungsfähig an andere bisulfidfreie Sequenzierungsmethoden (z. B. cfDNA TAPS) und war effektiv bei der Erkennung von hepatozellulären und pankreatischen Krebsarten.

Fazit

MESA integriert mehrere epigenetische Modalitäten und verbessert die Erkennungsgenauigkeit für Kolorektal-, Leber- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, validiert in vier Kohorten. Es stellt einen bedeutenden Durchbruch bei der nicht-invasiven Krebsdiagnose dar, indem es umfassende epigenetische Profile von zirkulierender cfDNA nutzt.

Referenz:

1. Li, Y., Xu, J., Chen, C. u. a.Multimodale epigenetische Sequenzierungsanalyse (MESA) von zellfreier DNA zur nicht-invasiven Erkennung von Kolorektalkrebs. Genommedizin 16, 9 (2024). Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder DOI-Referenzen übersetzen. Bitte geben Sie den Text, den Sie übersetzen möchten, direkt hier ein.