Reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung

CD Genomics bietet einen Service für die reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (RRBS) mit Einzel-Nukleotid-Auflösung an, indem die benötigte Sequenzierungsmenge reduziert wird, während die Mehrheit der Promotoren und anderer relevanter genomischer Regionen erfasst wird. RRBS ist vorteilhaft für die Entdeckung von Biomarkern durch die Identifizierung und Analyse von unterschiedlich methylierten Regionen (DMRs) zwischen Proben.

Die Einführung von RRBS

Die DNA-Methylierung von Cytosin ist eine epigenetische Modifikation, die an der Regulierung der Genexpression beteiligt ist. Die DNA-Methylierung tritt überwiegend in CpG-Kontexten auf, und diese CpG-Dinukleotide sind in bestimmten Regionen des Genoms häufiger anzutreffen. RRBS ist ein leistungsstarker Ansatz zur genomweiten Analyse der DNA-Methylierung, der die Verdauung mit Restriktionsenzymen mit Bisulfit-Sequenzierung kombiniert, um einen CpG-dichten Anteil des Genoms anzureichern. Diese Kombination verbessert die Effizienz der Nutzung von Proben und bietet eine ideale Plattform für Pilotstudien und klinische Anwendungen.

RRBS sequenziert nur die Fragmente, die zu CpG-reichen Regionen gehören, zu deutlich reduzierten Kosten im Vergleich zu Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS)RRBS ist sehr kosteneffektiv, da etwa 1-5% des Genoms sequenziert werden, was etwa 12% der genomweiten CpG-Stellen und etwa 84% der CpG-Inseln in Promotoren abdeckt. Pflanzen zeigen eine andere CpG-Verteilung: (i) es fehlen charakteristische CpG-Inseln in Promotoren; (ii) sie treten an Cytosinbasen innerhalb aller Sequenzkontexte auf. Daher wird das Enzym MspI häufig bei Tieren und Menschen verwendet, während die Enzyme SacI/MseI oft bei Pflanzen eingesetzt werden.

Vorteile von RRBS

• Geringer DNA-Bedarf
• Methylierungsmuster von CpG-reichen Regionen im gesamten Genom
• Abdeckung von bis zu 5 Millionen CpG-Stellen im Menschen
• Gleichzeitige Erkennung von DNA-Methylierung und SNPs.
• Entdeckung epigenetischer Biomarker
• Einzel-Nukleotid-Auflösung und Kosten-Effizienz

Anwendungen von RRBS

Die reduzierte Repräsentation von Bisulfit-Sequenzierung kann für, aber nicht beschränkt auf, die folgenden Forschungsbereiche verwendet werden:

KrebsforschungDie Forschung zu Krebs nutzt die RRBS-Technologie, um DNA-Methylierungsprofile über verschiedene Krebsarten hinweg sorgfältig zu kartieren. Durch die Analyse der Unterschiede in den Methylierungsmustern zwischen krebsartigem und gesundem Gewebe hilft RRBS, krebs-spezifische Methylierungsmarker zu identifizieren. Dies beleuchtet die epigenetischen Prozesse, die an der Entstehung und Entwicklung von Krebs beteiligt sind. Darüber hinaus deckt RRBS spezifische Veränderungen in der DNA-Methylierung auf, die potenziell als frühe Indikatoren für innovative Diagnosestrategien genutzt werden könnten. Dieser Ansatz unterstreicht die entscheidende Rolle der Epigenetik in der Krebsforschung und betont die Suche nach neuartigen Biomarkern für eine frühzeitige Erkennung und Intervention.

EntwicklungsbiologieDie RRBS-Technologie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der vielschichtigen Veränderungen der DNA-Methylierung, die während der embryonalen Entwicklung auftreten. Sie ermöglicht eine umfassende Analyse von stadien- und zellspezifischen Methylierungsmustern und beleuchtet die komplexen Dynamiken der epigenetischen Regulation. Darüber hinaus erlaubt RRBS die Beobachtung von DNA-Methylierungsmodifikationen während der Differenzierung von Stammzellen und entschlüsselt die epigenetischen Mechanismen, die die Bestimmung des Zellschicksals und die Genexpression komplex orchestrieren.

NeurowissenschaftenIn der Neurowissenschaft untersucht RRBS die DNA-Methylierungsprofile bei neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer und Autismus, enthüllt deren epigenetische Grundlagen und verbessert diagnostische sowie therapeutische Strategien. Darüber hinaus erforscht RRBS DNA-Methylierungsänderungen, die mit der Gedächtnisbildung und Lernprozessen verbunden sind, und fördert das Verständnis der epigenetischen Regulation in der neuronalen Funktion und im Verhalten.

Evolutions- und Ökologische StudienDie RRBS-Technologie dient als leistungsstarkes Werkzeug für vergleichende Studien zu DNA-Methylierungsmustern unter verschiedenen Arten oder Populationen im Bereich der evolutionären und ökologischen Forschung. Durch diese Methodik können Forscher die Auswirkungen der Epigenetik auf evolutionäre Dynamiken und adaptive Reaktionen untersuchen. Darüber hinaus beleuchtet RRBS die Auswirkungen von Umweltfaktoren wie Verschmutzung und Nährstoffvariationen auf die komplexe Modulation der DNA-Methylierung und deckt somit das komplexe Zusammenspiel zwischen epigenetischen Veränderungen und Umwelteinflüssen auf.

AgrarwissenschaftenIm Bereich der Agrarwissenschaften dient RRBS als entscheidendes Werkzeug zur Untersuchung von DNA-Methylierungsprofilen innerhalb von Pflanzensystemen, die für wichtige Merkmale wie Krankheitsresistenz, Ertragskapazität und Produktqualität relevant sind. Solche Analysen bieten entscheidende Hinweise für Zuchtinitiativen, die darauf abzielen, die Eigenschaften von Pflanzenvarianten zu verbessern. Darüber hinaus erkennt RRBS im Bereich der Tierzucht epigenetische Indikatoren, die mit begehrten Produktionsmerkmalen und dem allgemeinen Wohlbefinden verbunden sind, und liefert somit Erkenntnisse, die strategische Zuchtentscheidungen informieren und die Effizienz von Zuchtprogrammen steigern.

RRBS-Workflow

Der allgemeine Arbeitsablauf für RRBS-Sequenzierung ist unten skizziert. RRBS nutzt das Restriktionsenzym MspI, um an CCGG-Stellen im Genom zu schneiden und so CpG-dichte Regionen anzureichern. Die Regionen, die CpGs enthalten, werden dann durch Gelreinigung zurückgewonnen. Nach der Ligatur von methylierte Adaptern, Endreparatur und dA-Tailing werden diese Fragmente dann durch Bisulfit umgewandelt, amplifiziert und sequenziert. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt Qualitätsmanagement durch und überwacht jeden Schritt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten.

Dienstleistungsspezifikation

	Musteranforderungen Genomisches DNA ≥ 1 μg, Mindestmenge: 20 ng, Konzentration ≥ 20 ng/µl Zellen ≥ 5×106Mindestmenge: 3×103 Gewebe ≥ 30 mg OD 260/280=1,8~2,0 Alle DNA-Proben sollten mit RNase behandelt werden und keine Zersetzung oder Kontamination aufweisen. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an kontaktieren Sie uns mit Ihren individuellen Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien RRBS-Bibliotheksvorbereitung Illumina HiSeq X Ten, paired-end 150 bp Sequenzierungstiefe > 50M saubere Reads Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Ausrichtung gegen das Referenzgenom Analyse der Abdeckung von Promotoren und CpG-Inseln Analyse des Methylierungsniveaus von Promotoren und CpG-Inseln DMR (differenziell methyliertes Gebiet) Analyse Funktionelle Annotation von differentiell exprimierten Genen Beziehung zwischen dem Methylierungsgrad und der Länge funktioneller Elemente Verteilung der CpG-Regionen Regionale Verteilung von Genen Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in reduzierter Darstellung der Bisulfit-Sequenzierung für Ihre Schreibweise (Anpassung)

Durch die Kombination von Enzymverdau, Bisulfitumwandlung und NGS-TechnologieCD Genomics kann RRBS als alternative Methode anbieten, um genomweite Methylome kostengünstiger zu erstellen und zu profilieren. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Guo H, Zhu P, Guo F, u. a.Profilierung der DNA-Methylom-Landschaften von Säugetierzellen mit Einzelzell-reduzierter Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung. Naturprotokolle, 2015, 10(5): 645.
2. Meissner A, Gnirke A, Bell G W, u. a.Reduzierte Repräsentation Bisulfite-Sequenzierung für vergleichende hochauflösende DNA-Methylierungsanalyse. Nukleinsäureforschung, 2005, 33(18): 5868-5877.

Demonstrationsergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Häufig gestellte Fragen zur reduzierten Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung

1. Was ist der Workflow für RRSB?

Der Arbeitsablauf von RRBS wird in Abbildung 1 unten dargestellt. Kurz gesagt, wird die DNA zunächst verdaut, typischerweise mit MspI, das methylierungsunempfindlich ist und an CCGG-Stellen schneidet, wodurch CpG-reiche Regionen des Genoms angereichert werden. Die Fragmentenden werden dann repariert und mit dA versehen, und Adapter werden ligiert. Anschließend werden die Fragmente nach Größe ausgewählt, durch Bisulfit umgewandelt, amplifiziert und sequenziert.

Abbildung 1. Der schematische Arbeitsablauf für RRBS.

2. Was sind die Anforderungen für die Sequenzierung von Proben?

Sie können Zellen einreichen (mindestens 5*10).⁶), frisches Gewebe (mindestens 2~3 g) oder DNA (mindestens 5 μg; Konzentration ≥ 100 ng/µl; OD = 1,8~2,0; ohne Degradation oder RNA-Kontamination oder schwere Degradation). Vor dem Versand sollten die Zellen bei -80°C gelagert werden, und die DNA sollte in Wasser gelöst und bei -20°C aufbewahrt werden. Bitte vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen. Beim Versand sollten die Proben mit Parafilm versiegelt und wahrscheinlich mit Kühlakkus gefroren gehalten werden.

3. Welche Arten sind für die reduzierte Repräsentation von Bisulfit-Sequenzierung geeignet?

Die Arten, die RRBS unterzogen werden, sollten drei Anforderungen erfüllen: (i) Eukaryoten; (ii) ihr Referenzgenom sollte mindestens auf Scaffold-Ebene assembliert sein; (iii) relativ vollständige Genomanalysen.

Reduzierte Repräsentation Bisulfite-Sequenzierung Fallstudien

DNA-Methylierungsänderungen, die durch lange und kurze Photoperioden induziert werden in Nasonia

Journal: Genomforschung
Impact-Faktor: 11,922
Veröffentlicht: 15. Dezember 2015

Zusammenfassung

Wespe Nasonia vitripennis ist ein aufkommendes Modellorganismus, das eine starke photoperiodische Reaktion zeigt und verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der photoperiodischen Zeitmessung zugrunde liegen. Die Autoren versuchten herauszufinden, wie Weibchen Nasonia die Entwicklungsbahn ihrer Nachkommen zu steuern, um den Winter zu überstehen, indem sie die RRBS-Methode nutzen. Es wurde gezeigt, dass das Herunterregulieren von DNA-Methyltransferasen oder das Blockieren der DNA-Methylierung die photoperiodische Diapause-Reaktion der Wespen erheblich stört, was auf die Rolle von hinweist. DNA-Methylierung in der photoperiodischen Zeitmessung von Insekten.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

1. Der Nasonia Methylom

Die Autoren profilierten die DNA-Methylierung in genomischer DNA, die aus weiblichen Proben extrahiert wurde. N. vitripennis unter Lang- oder Kurztagbedingungen gehalten, indem RRBS genutzt wurde. Die CpG-Methylierung erklärt einen großen Teil der Überlappung zwischen den beiden Proben im Gegensatz zu anderen Sequenzkontexten (Abbildung 1B), was darauf hindeuten könnte, dass die Nicht-CpG-Methylierung größtenteils experimentelles Rauschen darstellt. CpGs scheinen entweder stark oder schwach methyliert zu sein (Abbildung 1C). Die Mehrheit der methylierten CpGs befand sich in Exons, und die Mehrheit war in Introns, Promotorregionen und intergenen Regionen lokalisiert (Abbildung 1D, E).

Abbildung 1. Die Nasonia Methylom.

2. Identifizierung von differentiell methylierten Genen

Die Autoren identifizierten 51 unterschiedlich methylierte CpG-Stellen (DMCs), die auf 37 Gene kartiert wurden. Etwa die Hälfte der DMCs (23/51) zeigte eine Hypomethylierung bei langen Tagen im Vergleich zu kurzen Tagen, während die anderen den entgegengesetzten Trend aufwiesen. qPCRs wurden durchgeführt, um die RRBS-Analyse zu validieren.

Abbildung 2. Differenzielle DNA-Methylierung im Zusammenhang mit Photoperioden in Nasonia.

3. Funktionelle Assays, die eine ursächliche Rolle der DNA-Methylierung nachweisen

Die Autoren schalteten Dnmt1a-c und Dnmt3 aus, indem sie dsRNA in weibliche Puppen der N. vitripennis Stamm AsymC. Der Knockdown wurde durch qPCR verifiziert. Der Knockdown von Dnmt1a führte dazu, dass Weibchen unabhängig von der Tageslänge Diapause-Nachkommen produzierten. Das Stummschalten von Dnmt3 ergab einen nicht signifikanten (aber nahe an der Signifikanz) Unterschied in der Diapause-Reaktion, was darauf hindeutet, dass der Effekt von Dnmt3 viel schwächer oder schwerer zu erfassen ist.

Sie testeten auch den Einfluss der DNA-Methylierung pharmakologisch, indem sie den DNA-Methylierungshemmer 5-Aza-2'-deoxy-cytidin (5-aza-dC) verwendeten, und beobachteten eine Verringerung der Diapause bei den Nachkommen von Wespen, die in kurzen Tagen gehalten wurden, sowie eine Zunahme bei den Nachkommen in langen Tagen.

Abbildung 3. DNA-Methylierung ist erforderlich für die photoperiodisch vermittelte Diapause-Reaktion.

Abbildung 4. Pharmakologische Tests mit 5-aza-dC.

Fazit

Die Autoren fanden heraus, dass die DNA-Methylierung in Nasonia vitripennis Änderungen mit dem saisonalen Photoperiod. Die Störung wichtiger Methylierungsenzyme (Dnmt1a oder die Verwendung von 5-aza-dC) verändert, wie Weibchen auf Photoperioden reagieren. Ihre hochauflösenden Methylomdaten zeigen, dass die Methylierungsmuster von Nasonia genkörperzentriert sind, ähnlich wie bei anderen Insekten. Dies bestätigt die Rolle der DNA-Methylierung bei der Photoperiodenreaktion und deutet darauf hin, dass verschiedene Methyltransferasen unterschiedliche Funktionen in diesem Prozess haben.

Referenz:

1. Pegoraro M, Bafna A, Davies N J, u. a.DNA-Methylierungsänderungen, die durch lange und kurze Photoperioden induziert werden in Nasonia. Genomforschung, 2016, 26(2): 203-210.