Gesamt-RNA-Sequenzierung

Die Total RNA-Seq-Analysen bieten einen umfassenden Überblick über das Transkriptom. Eine Reihe von Lösungen, die auf Ihr Studienziel zugeschnitten sind, ist bei CD Genomics verfügbar. Wir können einen schnellen, zuverlässigen und kosteneffizienten Service anbieten.

Die Einführung der Total-RNA-Sequenzierung

Da nicht-kodierende RNA (ncRNA) weiterhin als biologisch wichtig anerkannt wird, analysiert die totale RNA-Seq sowohl kodierende als auch mehrere Formen von nicht-kodierender RNA für einen umfassenden Blick auf das Transkriptom. Die globale Analyse der RNA-Expression kann unser Verständnis aller transkriptionalen Aktivitäten verbessern. Die totale RNA-Seq ermöglicht die Analyse von kodierender und nicht-kodierender RNA mit der hochzuverlässigen Entdeckung von Merkmalen wie alternativen Transkripten, Genfusionen, allelspezifischer Expression und der Erkennung neuartiger Transkripte in sowohl kodierenden als auch nicht-kodierenden RNA-Arten.

CD-Genomik kombiniert bewährte Chemien zur Vorbereitung von Ribosomen-Reduktionsbibliotheken mit Illumina. NGS Technologie in ein einziges, optimiertes Protokoll. Die Ribo-Zero-Ribosomen-RNA-Reduktionschemie minimiert die ribosomale Kontamination und maximiert den Prozentsatz der eindeutig zugeordneten Reads. Mit der konstanten robusten Leistung deckt das totale RNA-seq sowohl ab mRNA und eine breite Palette von ncRNA-Spezies von Interesse, einschließlich lange nicht-kodierende RNA (lncRNA)kleine nukleare (snRNA), kleine nucleoläre (snoRNA) und andere RNA-Spezies.

Vorteile der Total-RNA-Sequenzierung

• Präzise Messung der Faserorientierung und gleichmäßige Abdeckung.
• Kompatibel mit mehreren Probenarten, einschließlich niedrigqualitativer, formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) Proben.
• Schnelle Bearbeitungszeit und höchste Datenqualität
• Niedrigere Kosten und breite Verfügbarkeit.
• Effektive Transkriptomanalyse
• Die Forschung zur Transkriptomsequenzierung, die Genfusionen, Indels, SNPs und andere umfasst, führt zu höheren Nachweisraten und verbesserter Zuverlässigkeit.
• Entdeckung neuer Transkripte und Spleißvarianten.
• Allelspezifische Genexpressionsanalyse.

Gesamt-RNA-Sequenzierungs-Workflow

Unsere umfassenden RNA-Seq-Dienstleistungen bieten den RNA-Sequenzierungs-Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse und ermöglichen eine schnelle Profilierung sowie tiefgehende Einblicke in die RNA.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen Gesamt-RNA ≥ 2 μg, Mindestmenge: 500 ng, Konzentration ≥ 50 ng/µL Zellen ≥ 2×106 Gewebe ≥ 500 mg, Mindestmenge: 100 mg Der A260:A280-Wert sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. OD A260/A280-Verhältnis ≥ 1,8, A260/230-Verhältnis ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Alle totalen RNA-Proben sollten DNA-frei sein. RNA sollte in nukleasefreiem Wasser oder RNA Stable aufbewahrt werden. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie 250~300 bp Insert cDNA-Bibliothek Illumina HiSeq 150 bp Paar-End Sequenzierungsdatenmenge: 10 Gb Über 40 Millionen Aufrufe
	Bioinformatische Analyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Datenvorverarbeitung Karte zum Referenzgenom Identifizierung von kleinen/zirkulären RNAs Sequenzanalyse Differenzielle Ausdrucksanalyse miRNA-Zielgenanalyse GO-Anreicherungsanalyse KEGG-Anreicherungsanalyse …und mehr Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Total-RNA-Sequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

Unterstützt von unserem Team erfahrener Wissenschaftler und modernster Technologie bietet CD Genomics Total RNA-Sequenzierungsdienste an. Wir wenden strenge Qualitätskontrollmaßnahmen und fortschrittliche bioinformatische Analysen an, um genaue und umfassende Ergebnisse zu gewährleisten. Wenn Sie spezifische Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns für weitere Unterstützung zu kontaktieren.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Verteilung der Sequenzierungsqualität

A/T/G/C-Verteilung

IGV-Browser-Oberfläche

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA-Score-Diagramm

Venn-Diagramm

Vulkan-Plot

Statistiken der Ergebnisse der GO-Annotation

KEGG-Klassifikation

1. Welche Methode wählen: totale RNA-Sequenzierung oder mRNA-Sequenzierung?

Bei der Überlegung, ob man sich für total RNA-seq oder mRNA-Seq für RNA-SequenzierungDie Wahl hängt hauptsächlich von den experimentellen Zielen ab, da es mehrere entscheidende Unterschiede zwischen den beiden Ansätzen gibt. Total RNA-seq, auch bekannt als Whole Transcriptome Sequencing, ist die umfassendste Methode, die typischerweise das Sequenzieren aller Arten von RNA-Molekülen, sowohl kodierenden als auch nicht-kodierenden, umfasst. Die Entfernung von rRNA während des Total RNA-seq ermöglicht die Erzeugung von hochwertigen Sequenzierungsdaten und erleichtert die Charakterisierung und Identifizierung verschiedener nicht-rRNA-Spezies.

Wenn der Forschungsschwerpunkt auf Eukaryoten liegt und hauptsächlich die kodierenden Regionen betrifft, ist mRNA-seq die bevorzugte Wahl. Die mRNA-seq-Methodik verwendet Selektionsverfahren, um poly(A)-RNA anzureichern. Da mRNA nur einen kleinen Teil der gesamten RNA-Moleküle darstellt, ist mRNA-seq die effektivste und kostengünstigste Methode, wenn die Sequenzierung von mRNA allein für die experimentellen Ziele ausreicht.

2. Was für eine Art von Sequenzierung ist die gesamte Transkriptom-Sequenzierung?

Die gesamte Transkriptomsequenzierung verwendet überwiegend Plattformen für die Kurzlesesequenzierung der zweiten Generation wie Illumina HiSeq X und Illumina NovaSeq 6000. Während die dritte Generation Langzeit-Sequenzierung Es wurden Methoden berichtet, die vorherrschende Wahl für RNA-Seq Experimente bleiben Technologien der zweiten Generation.

3. Was ist das Hauptmerkmal der Whole Transcriptome Sequencing, das sie von anderen Sequenzierungsansätzen unterscheidet?

Das Hauptmerkmal der gesamten Transkriptom-Sequenzierung liegt in der Verwendung von strangspezifischen Bibliotheksvorbereitungstechniken, insbesondere der strangspezifischen RNA-Bibliotheksvorbereitung. Diese Methodik stellt sicher, dass die resultierenden cDNA-Bibliotheken die richtungsabhängige Information der ursprünglichen RNA-Stränge bewahren. Dieses Merkmal ist entscheidend für die genaue Bestimmung der transkriptionalen Richtung, wodurch eine präzise Quantifizierung der Genexpression, eine robuste Genannotation, die Entdeckung neuer Gene und eine zuverlässige Identifizierung von Antisense-Transkripten und alternativen Spleißereignissen ermöglicht wird.

4. Wie trägt die Ganztranskriptomsequenzierung zum Verständnis der Genregulation und der funktionellen Genomik bei?

Die gesamte Transkriptom-Sequenzierung revolutioniert unser Verständnis von Genregulation und funktioneller Genomik, indem sie eine ganzheitliche Perspektive des Transkriptoms bietet. Diese hochmoderne Technologie taucht in die komplexen Dynamiken der Genexpression ein, untersucht die Feinheiten des alternativen Spleißens und deckt die vielfältigen Signaturen nicht-kodierender RNAs auf, die in verschiedenen biologischen Kontexten vorhanden sind. Die Integration von strangspezifischen RNA-Seq-Daten mit genomischen und epigenomischen Landschaften ausgestattet Forscher mit den Werkzeugen, um die Komplexität regulatorischer Netzwerke zu entschlüsseln und kritische molekulare Akteure in zellulären Prozessen, Krankheitsentstehung und Entwicklungsabläufen zu enthüllen. Durch die Förderung eines tiefen Verständnisses biologischer Systeme treibt dieser Ansatz Durchbrüche an der Spitze der biomedizinischen Forschung voran und fördert Innovationen sowie bedeutende Entdeckungen.

Die gesamte Transkriptom-Sequenzierung zeigt die transkriptionale Landschaft von Neutrophilen, die mit aktiver Tuberkulose assoziiert ist.

Zeitschrift: Frontiers in Immunologie
Impact-Faktor: 8,786
Veröffentlicht: 18. August 2022

Zusammenfassung

Neutrophile spielen eine doppelte Rolle bei Tuberkulose: Sie tragen zur angeborenen Immunität gegen M. tuberculosis bei, können jedoch auch Entzündungen und Pathogenese verschärfen. Transkriptom-Sequenzierung Die Untersuchung von Neutrophilen liefert Einblicke in ihre komplexen Reaktionen, was das Verständnis der TB-Pathogenese unterstützt und potenzielle Biomarker für die Diagnose identifiziert.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

In dieser Studie zeigte die PCA unterschiedliche Genexpressionsprofile zwischen aktiver Tuberkulose (ATB), latenter Tuberkuloseinfektion (LTBI) und gesunden Kontrollgruppen (HC). Die Analyse der differentiellen Genexpression identifizierte signifikante Unterschiede, mit 183 DEGs in ATB vs. HC und 271 DEGs in ATB vs. LTBI. Geschlechtsspezifische Ausdrucksmuster wurden für ATB-herunterregulierte Gene in den Gruppen beobachtet.

Abbildung 1 Analyse der differentiellen Expression von Neutrophilen in drei Gruppen von Proben.

Die Autoren führten funktionelle Pfadanreicherungs- und GSEA-Analysen durch, um die Rollen der DEGs zu untersuchen. Die Anreicherungsanalyse ergab, dass Pfade wie die Signalübertragung durch NOD-ähnliche Rezeptoren, die NF-kappa B-Signalübertragung und die Signalübertragung der Immunantwort im Vergleich zu den Gruppen LTBI und HC signifikant in ATB angereichert waren. GSEA hob zusätzliche Pfade wie die Reaktion auf Lipopolysaccharide und die Chemokin-Signalübertragung hervor. Die Analyse des Protein-Interaktionsnetzwerks identifizierte zentrale Subnetzwerke, die die Signalübertragung der Immunantwort und das mRNA-Spleißen betreffen, die insbesondere in den Vergleichen zwischen ATB und LTBI deutlich unterschiedlich waren.

Abbildung 2 Funktionelle Anreicherungsanalyse der differentially exprimierten Gene.

Die KEGG-Analyse zeigte eine signifikante Anreicherung des NF-κB-Signalwegs in der ATB-Gruppe, mit einer Herunterregulierung von TNFSF14 und einer Hochregulierung von NF-kappa B-Inhibitoren (IκBs) wie NFKBIA, NFKBID und NFKBIZ. Darüber hinaus wurden TNFAIP3 und NFKB1A hochreguliert, was möglicherweise die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs hemmt. BCL2A1 und CXCL8, die mit dem Überleben von Zellen assoziiert sind, wurden ebenfalls signifikant hochreguliert. Im Gegensatz dazu waren RNA-Spleißungs-bezogene Signalwege in LTBI im Vergleich zu HC herunterreguliert, wie durch GO-, KEGG- und Reactome-Anreicherungsanalysen angezeigt. Die WGCNA-Analyse identifizierte Module, die positiv und negativ mit ATB korreliert sind, und hob unterschiedliche Muster der Gen-Co-Expression hervor, die mit den Infektionsstatus von TB in Verbindung stehen, insbesondere in Neutrophilen.

Abbildung 3 Die Hochregulation von NFKB-Inhibitoren in ATB könnte zur Hemmung der Aktivierung des NFKB-Signalwegs führen.

Abbildung 4 GO- und Reactome-Pfad-Anreicherungsanalyse in LTBI vs. HC im GSEA-Anreicherungsdiagramm.

Abbildung 5 (A) Die Heatmap der Modul-Eigenschaften-Korrelationsmatrix von WGCNA.

Neun Zielgene wurden in 76 Proben durch qPCR validiert, wobei eine signifikant höhere Expression von GBP5, SRSF5, CSRNP1, RBM3 und CCNL1 bei ATB festgestellt wurde. Die ROC-Analyse von GBP5, SRSF5, CSRNP1 und RBM3 in 143 Proben bestätigte ihr diagnostisches Potenzial für ATB, wobei GBP5 die stärkste diskriminative Fähigkeit aufwies (AUC>0,9).

Abbildung 6 Blasendiagramme der funktionellen Anreicherungsanalyse von Genen in blauen Modulen, die nur die 15 am stärksten angereicherten Wege anzeigen.

Fazit

Diese Studie verwendet Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie in Verbindung mit umfassender Analyse, um die Rolle von Neutrophilen als eine der häufigsten Zellen des angeborenen Immunsystems im aktiven Tuberkulose-Infektionsprozess zu beleuchten. Durch die Erkennung von pathogenassoziierten molekularen Mustern über eine Reihe von Mustererkennungsrezeptoren lösen Neutrophile nachgelagerte zelluläre Ereignisse in der Wirtabwehr aus, insbesondere unter Einbeziehung von immunantwortinduzierten Signalwegen. Mycobacterium tuberculosis kann jedoch die antibakterielle Funktion von Neutrophilen stören, indem es den NF-kB-Signalweg hemmt, wodurch Entzündungen und Zellapoptose abgeschwächt und ihr Überleben innerhalb der Neutrophilen gefördert wird. Durch RT-qPCR-Analysen wurden drei neuartige transkriptionale Marker-Gene, RBM 3, CSRNP 1 und SRSF 5, identifiziert, die das Potenzial haben, zwischen aktiver Tuberkulose, latenter Tuberkulose-Infektion und gesunden Kontrollen zu unterscheiden.

Referenz

1. Geng X, Wu X, Yang Q, et al. Die gesamte Transkriptomsequenzierung zeigt die transkriptionale Landschaft von Neutrophilen, die mit aktiver Tuberkulose assoziiert ist. Grenzen der Immunologie, 2022, 13: 954221.