TaqMan SNP-Genotypisierung

CD Genomics bietet maßgeschneiderte Taqman-Assays an, um durchzuführen SNP-Genotypisierung, die die Identifizierung und Amplifikation von Polymorphismen ermöglichen.

Die Einführung der TaqMan SNP-Genotypisierung

TaqMan ist ein häufig verwendetes SNP-Genotypisierung Die von Life Technologies entwickelte Methode ist eine fortschrittliche, ausgereifte, validierte und weit verbreitete Technologie. Der TaqMan SNP-Genotypisierungsassay wird auch als "50-Nuklease-allelische Diskriminierungsassay" bezeichnet. Jeder TaqMan-Genotypisierungsassay enthält zwei Primer zur Amplifikation der interessierenden Sequenz und zwei allelspezifische, unterschiedlich markierte TaqMan Minor Groove Binder (MGB)-Sonden zur Alleldetektion. Jede allelspezifische MGB-Sonde ist am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden Reporterfarbstoff (entweder einem FAM- oder einem VIC-Reporter-Molekül) markiert und am 3'-Ende mit einem Fluoreszenzquenching-Molekül verbunden. Solange die Sonde intakt ist, unterdrückt die Nähe des Quencherfarbstoffs zum Reporterfarbstoff die Reporterfluoreszenz. Während des PCR-Amplifikationsschrittes, wenn die allelspezifische Sonde perfekt komplementär zum SNP-Allel ist, hybridisiert sie an das Ziel-DNA-Segment und wird dann durch die 5'-Nukleaseaktivität der Taq-Polymerase abgebaut. Der Abbau der Sonde führt zur Trennung des Fluorophors vom Quencher-Molekül, was ein nachweisbares fluoreszierendes Signal erzeugt. Wenn aufgrund eines SNP eine einzelne Punktmutation zwischen der Sonde und dem Ziel-DNA-Strang vorliegt, wird die Bindung der Sonde an die DNA während der Strangverschiebung in der PCR destabilisiert, was die Effizienz des Sondenabbaus und das Quenching des fluoreszierenden Reporterfarbstoffs verringert.

Der Test kann mit einem ABI Prism 7900HT Sequenzdetektionssystem bei hoher Durchsatzrate und niedrigen Betriebskosten durchgeführt werden. Das ABI Prism 7900HT System kann die beiden Farben (FAM oder VIC) unterscheiden und quantifizieren, und Genotypen können für viele Proben in wenigen Minuten erstellt werden.

Vorteile der TaqMan SNP-Genotypisierung

• Einfach und unkompliziert: TaqMan SNP-Genotypisierung umfasst das einfache Mischen von Proben und Reaktionskomponenten in einem geschlossenen System, das keine komplexen Verfahren erfordert und leicht umzusetzen ist.
• Echtzeitdetektion: Durch die Erkennung von Fluoreszenzänderungen während der PCR-Reaktion ermöglicht das TaqMan SNP-Genotyping eine Echtzeitüberwachung von SNP-Genotypen und liefert schnelle Ergebnisse.
• Vermeidung der Nachbearbeitung nach der PCR: Da keine Nachbearbeitungsverfahren erforderlich sind, entfallen Arbeitskosten und das Risiko von Kreuzkontaminationen, die mit der Nachbearbeitung nach der PCR verbunden sind, was experimentelle Fehler reduziert.
• Niedrige Probenanforderung: Aufgrund der Empfindlichkeit von PCR-Reaktionen erfordert das TaqMan SNP-Genotyping minimale Probenmengen, was es für die Analyse begrenzter Proben geeignet macht.
• Hochdurchsatz-Probenanalyse: Mit dem Fortschritt der fluoreszenzquantitativen PCR-Geräte können große Probenmengen gleichzeitig in einer einzigen Reaktionsplatte nachgewiesen werden, was die Nachweiseffizienz und den Durchsatz verbessert.
• Hohe Sensitivität und Spezifität: TaqMan SNP-Genotypisierung bietet hohe Sensitivität und Spezifität, identifiziert SNPs genau und vermeidet Fehlurteile und Verwirrung.
• Niedrige Probenanforderung mit ~10ng/Genotyp
• Vernünftig für große Stichprobengröße
• Individuelles Projektdesign
• Erfahrene Wissenschaftler mit umfangreicher PCR-Erfahrung

Anwendung der TaqMan SNP-Genotypisierung

• Besonders vorteilhaft für SNP-Analyse-Szenarien mit einer relativ bescheidenen Anzahl von Loci, jedoch mit Stichprobengrößen von über 1500 Fällen, da größere Stichprobengrößen niedrigere Kosten verursachen.
• Genetische Forschung: TaqMan SNP-Genotypisierung ist in verschiedenen Bereichen der genetischen Studien anwendbar, die SNP-Analysen umfassen, einschließlich Bereiche wie Humangenetik und die genetische Züchtung von Pflanzen und Tieren.
• Ganzgenom-SNP-Assoziationsstudien: Besonders gut geeignet zur Validierung anfänglicher positiver Loci, die aus umfassenden Ganzgenom-SNP-Assoziationsstudien gewonnen wurden. Dieser Ansatz hilft dabei, SNPs zu identifizieren, die mit bestimmten Merkmalen oder Krankheiten assoziiert sind, und erleichtert so ein umfassendes Verständnis ihrer genetischen Grundlagen.
• Validierung der vorläufigen Mutationsstellen von Whole-Genome-SequenzierungIm Rahmen von Studien zur Ganzgenomsequenzierung werden typischerweise eine beträchtliche Anzahl vorläufiger Mutationsstellen identifiziert. TaqMan SNP-Genotypisierung dient als wertvolles Werkzeug zur weiteren Validierung dieser Stellen mit großen Stichprobengrößen, um deren Häufigkeiten innerhalb spezifischer Populationen oder Arten sowie deren Korrelationen mit phänotypischen Merkmalen zu klären.

TaqMan SNP-Genotypisierungs-Workflow

Die experimentellen Verfahren umfassen zahlreiche Phasen, einschließlich DNA-Extraktion, Qualitätsinspektion der Proben, Entwurf und Synthese von Sonden, Vorversuchen, Detektion mittels fluoreszenzquantitativer PCR-Geräte und anschließender Datenanalyse. Zentral für die PCR-Reaktion ist der Prozess der Identifizierung der in den Proben vorhandenen SNP-Genotypen, der durch die Detektion von fluoreszierenden Signalen erreicht wird.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen und Vorbereitung Genomisches DNA ohne schwere Degradation DNA-Menge ≥ 1 µg, Konzentration ≥ 25 ng/µl Die Reinheit sollte OD260/280 = 1,7~2,0 betragen.
	Erkennung ABI Prism 7900HT Sequenzdetektionssystem Geeignet für Projekte mit ~ 1-10 SNPs und 100-1000 Proben.
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Rohdatenstatistiken Qualitätskontrollinformationen Genotyp-Informationen SNP-Häufigkeit Assoziationsanalyse … (mehr auf Anfrage)

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

Experimentelle Bedingungen einschließlich Informationen zu Primer- und Sonden-Sequenzen, Reagenzbezeichnungen, Gerätemodellen, Protokollen, Cluster-Diagrammen und Genotypisierungstabellen jedes SNP-Lokus in einzelnen Proben.

CD Genomics bietet hochgradig vertrauenswürdige und flexible TaqMan-Technologie, um Ihren spezifischen Anforderungen gerecht zu werden. SNP-Genotypisierung Bedürfnisse.

Referenz:

1. Ziller M. J. et al. Zielgerichtete Bisulfid-Sequenzierung des dynamischen DNA-Methyloms. Epigenetik & Chromatin, 2016, 9(1): 55.

TaqMan-Sondenbasierte Genotypisierungsergebnisse Diagramm

1. Was ist das Arbeitsprinzip der TaqMan SNP-Genotypisierung?

Diese Technologie bezieht sich auf die Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) Genotypisierung Ansatz, der vom ABI-Forschungsteam sorgfältig entwickelt wurde. Das Betriebsprinzip wurde wie folgt erläutert:

Während der PCR-Reaktion wird ein Paar spezifischer Minor Groove Binder (MGB) Sonden, mit einzigartigen fluoreszierenden Markierungen an beiden Enden, hinzugefügt, um verschiedene allelische Gene (Allele1 und Allele2) zu unterscheiden. Das 5'-Ende trägt eine fluoreszierende Reportergruppe, während das 3'-Ende mit einer quenching fluoreszierenden Gruppe ausgestattet ist. Während des PCR-Prozesses haben beide Sonden die Fähigkeit, selektiv zu annealen und sich mit den komplementären Sequenzen zwischen den Vorwärts- und Rückwärtsprimern zu verbinden.

Wenn diese Sonden in ihrem intakten Zustand verbleiben, bewirkt der Energie-Resonanztransfer, dass die fluoreszierenden Moleküle eine schwache Fluoreszenz emittieren. Sobald die spezifische Sonde ausschließlich an ihr entsprechendes allelisches Gen bindet, übt die DNA-Polymerase ihre Exonukleaseaktivität von 5' nach 3' aus; sie spaltet das reporterfluoreszierende Molekül und befreit es von der Quenching-Wirkung der quenching-fluoreszierenden Moleküle am 3'-Ende – dies führt zu einer Fluoreszenzemission.

Die beiden Sonden sind deutlich gekennzeichnet: Das 5'-Ende trägt unterschiedliche Fluoreszenz (entweder FAM oder VIC), während das 3'-Ende an eine MGB-Quenching-Einheit gebunden ist. Unterschiede in den detektierten Fluoreszenzen können somit genutzt werden, um das SNP-allele Genotyp der jeweiligen Proben abzuleiten.

2. Was sind die Vorteile der TaqMan SNP-Genotypisierung?

TaqMan SNP-Genotypisierung bietet Einfachheit, vermeidet Kreuzkontamination während der Nachbearbeitung nach der PCR; Echtzeitnachweis von SNP-Loci, der schnelle Ergebnisse liefert; minimaler Probenbedarf, geeignet für begrenzte Proben; gleichzeitige Analyse großer Probenmengen, die die Nachweiseffizienz und den Durchsatz erhöht.

3. In welchen Forschungsbereichen ist die TaqMan SNP-Genotypisierung anwendbar?

TaqMan SNP-Genotypisierung ist in verschiedenen Bereichen der genetischen Forschung anwendbar, die sich mit SNP-Genotypisierung, einschließlich der Humangenetik sowie der Tier- und Pflanzenzucht. Es eignet sich besonders gut für weitere Validierungsstudien zu anfänglich positiven Loci, die aus genomweiten SNP-Assoziationsstudien gewonnen wurden, und einer großen Anzahl von vorläufigen Screening-Mutationsloci, die aus Whole-Genome-Sequenzierung.

4. Was trägt die TaqMan SNP-Genotypisierung zur klinischen Diagnose bei?

Die praktischen Anwendungen der TaqMan SNP-Genotypisierung im Bereich der klinischen Diagnostik sind erheblich. Durch die effektive Nutzung dieses Verfahrens sind Kliniker in der Lage, genetische Variationen zu identifizieren, die spezifisch für bestimmte Krankheiten sind. Diese Erkenntnisse werden anschließend genutzt, um durchdachte Behandlungspläne zu entwickeln, die auf die Bedürfnisse einzelner Patienten zugeschnitten sind. Darüber hinaus kann die TaqMan SNP-Genotypisierung potenziell die Schaffung proaktiver Präventionsmaßnahmen ermöglichen und somit Türen zur Präventivmedizin öffnen.

5. Welche Maßnahmen sind erforderlich, um falsch-positive Ergebnisse in TaqMan SNP-Genotypisierungsversuchen zu vermeiden?

Die Angelegenheit der falsch-positiven Vorkommen in TaqMan SNP-Genotypisierungsexperimenten ist von erheblichem Interesse. Es ist entscheidend, verschiedene Kontrollmaßnahmen durchzusetzen, um die Präzision und Zuverlässigkeit der erzielten Ergebnisse zu erhöhen. Beispiele für umsetzbare Kontrollen und Überprüfungen sind das Einbeziehen negativer Kontrollproben und die Durchführung mehrerer reproduzierbarer Experimente. Solche Strategien dienen dazu, die Häufigkeit von Ungenauigkeiten in den Forschungsergebnissen zu verringern.

6. Wie vergleicht sich die TaqMan SNP-Genotypisierung mit anderen Genotypisierungsverfahren?

Im Vergleich zu Alternativen SNP-Genotypisierung Techniken, TaqMan SNP-Genotypisierung bietet erhöhte Sensitivität, Spezifität und Schnelligkeit, verbunden mit einfacher Implementierung. Folglich hat sie eine weitverbreitete Anwendung in der Praxis gefunden.

7. Wie sollten Fehler in TaqMan SNP-Genotypisierungsversuchen behandelt werden?

Bei Fällen von experimentellem Versagen ist ein systematischer Ansatz erforderlich. Dies umfasst eine sorgfältige Überprüfung der experimentellen Verfahren, um die Verfahrensgenauigkeit sicherzustellen, die Bewertung der Frische und Qualität der Reagenzien, die Überprüfung auf mögliche Kontaminationen und technische Probleme sowie die Untersuchung von Anpassungen der experimentellen Bedingungen, die darauf abzielen, die Ergebnisse zu verbessern.

SNP-Genotypisierung mit TaqMan®-Technologie: die CYP2D6*17 Analyse-Rätsel

Journal: Wissenschaftliche Berichte

Impactfaktor: 4,746

Veröffentlicht: 19. März 2015

Hintergrund

CYP2D6 ist ein kritisches Enzym im Arzneimittelstoffwechsel, das an der Metabolisierung eines erheblichen Teils der klinisch verwendeten Medikamente beteiligt ist. Seine Aktivität variiert stark zwischen den Populationen, was die Wirksamkeit von Medikamenten und unerwünschte Ereignisse beeinflusst. Über 100 allelische Varianten wurden identifiziert, die die Phänotypen des Arzneimittelstoffwechsels beeinflussen. TaqMan-Assays werden häufig verwendet für CYP2D6 Genotypisierung, aber Herausforderungen bestehen aufgrund der Komplexität der Gene. Unerwartete Ergebnisse in TaqMan-Assays führten zu weiteren Untersuchungen der Genauigkeit der Genotypbestimmungen und unterstrichen die Notwendigkeit einer rigorosen Validierung der Assays sowie des Verständnisses der Genotyp-Phänotyp-Korrelationen für die personalisierte Medizin.

Methoden

Ergebnisse

TaqMan-Assays wurden verwendet, um Fälle zu genotypisieren für CYP2D6 Varianten, die Inkonsistenzen bei den Aufrufen für den SNP 1023C>T aufdeckten. Kontamination und DNA-Qualitätsprobleme wurden ausgeschlossen. Weitere Untersuchungen gruppierten die Probanden in diejenigen, die tragen CYP2D6*17 und 4 Allele. Fälle zeigten homozygote Aufrufe für 1023C>T, die später als Träger einer CYP2D64-Subvariante mit einem spezifischen SNP-Trio identifiziert wurden. Andere zeigten konsistente Aufrufe oder Gen-Duplikationen. Diese Ergebnisse heben die Komplexität hervor von CYP2D6 Genotypisierung und der Bedarf an präzisen Analysemethoden.

Abbildung 1. CYP2D6*4-Subvarianten.

CYP2D6 Die Genotypisierung über drei Institutionen identifizierte 16 Probanden afrikanischer Abstammung mit heterozygoten Schlüssel-SNPs, aber homozygot für 1023T/T. Ihnen wurde vorgeschlagen, ein neuartiges zu haben. CYP2D6*4 Subvariante mit dem SNP 1023C>T. Eine RFLP-Analyse widersprach jedoch den TaqMan-Ergebnissen und deutete auf Heterozygotie für 1023C>T hin. Die Genresequenzierung bestätigte die RFLP-Ergebnisse und zeigte häufige SNPs auf. CYP2D6*4 Varianten. Dies hebt die Komplexität von CYP2D6 Genotypisierung und der Bedarf an umfassenden Analysemethoden.

Abbildung 2. CYP2D6*17 (1023C>T) TaqMan-Assay Genotyp-Ergebnisse.

Die Zusammenarbeit mit Thermo Fisher führte zur Prüfung einer Alternative. CYP2D6*17 Assay-Design. Dieses neue Design korrigierte die Fehldiagnosen, die in vorherigen Assays beobachtet wurden, und identifizierte Heterozygotie für CYP2D6*17 SNP in zuvor homozygoten Proben. Proben mit CYP2D6*4/4 Genotypen wurden genau bestimmt. Die Analyse der sekundären Struktur des PCR-Produktes des Assays deutete auf Unterschiede hin zwischen CYP2D6*17 und *4 Varianten, die möglicherweise die Leistungsfähigkeit des Tests beeinflussen.

Abbildung 3. Sequenzvergleich von CYP2D6 Varianten, CYP2D7 und CYP2D8

Abbildung 4. Echtzeitverstärkung für das Original und die Alternative CYP2D6*17 TaqMan-Assays.

Fazit

Der Mechanismus hinter dem Allel-Ausfall bleibt unklar und könnte möglicherweise mit den Eigenschaften der Taq-Polymerase oder sekundären Strukturen zusammenhängen. Dieses unerwartete Phänomen unterstreicht die Notwendigkeit einer gründlichen Validierung von Tests und Wachsamkeit bei der Interpretation von Ergebnissen, insbesondere bei hochpolymorphen Genen wie CYP2D6.

Referenz:

1. Gaedigk A, Freeman N, Hartshorne T, et al. SNP-Genotypisierung mit TaqMan®-Technologie: die CYP2D6* 17 Analyse-Rätsel. Wissenschaftliche Berichte, 2015, 5(1): 9257.