Exosomale RNA-Sequenzierung

CD Genomics bietet Exosomenforschern einen umfassenden Service zur Untersuchung von exosomenassoziierten RNA-Informationen.

Die Einführung der Exosomalen RNA-Sequenzierung

Exosomen sind zellabgeleitete Vesikel, die in vielen und vielleicht allen eukaryotischen Flüssigkeiten vorhanden sind, einschließlich Blut, Urin und dem Kulturmedium von Zellkulturen. Nach ihrer Freisetzung reisen Exosomen durch den Körper, fusionieren mit anderen Zellen und übertragen ihre Fracht auf die empfangende Zelle. Jüngste Forschungen haben Beweise dafür geliefert, dass Exosomen eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation und der Krankheitsübertragung spielen.

Abbildung 1. Biogenese und Identifizierung von Exosomen. (Kalluri et al., 2020)

CD Genomics bietet Kunden einen umfassenden Service für die Sequenzierung von exosomaler RNA an. Exosome enthalten verschiedene Untergruppen von Mikro-RNAs, mRNAs, lncRNAs und anderen ncRNAs. Es gibt zunehmend Beweise dafür, dass die Übertragung von miRNA über exosomale Transmission zu vollständig funktionalen oder translatierten langen RNAs in einer empfangenden Zelle führen kann. Exosomale miRNAs könnten wichtige Funktionen in der Zell-Zell-Kommunikation haben und haben das Potenzial, als Biomarker zur Erkennung und Überwachung von Krankheiten eingesetzt zu werden. Die Profilierung exosomaler RNA bietet Einblicke in die Funktion der exosomalen RNA und ermöglicht die Anwendungen, die unten aufgeführt sind.

• Die Identifizierung von Veränderungen in exosomalen miRNA unter Krankheitszuständen gilt als eine zuverlässige Methode, um Sequenzsignaturen für die Diagnose und Prognose von Krankheiten zu entdecken.
• Die Identität und der Expressionsgrad von exosomalen mRNA wurden als wertvoller Ansatz zur Entdeckung von Biomarkern aus blutbasierten, Speichel- und Urin-Biofluidproben betrachtet.
• Lange nicht kodierende RNAs (lncRNA) sind ebenfalls in Exosomen vorhanden und können Ausdrucksmuster aufweisen, die sich von denen auf zellulärer Ebene unterscheiden.

Vorteile der Exosomalen RNA-Sequenzierung

• Nicht-invasive ProbenentnahmeRNA-Proben werden aus extrazellulären Vesikeln in Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und Speichel gewonnen, wodurch invasive Eingriffe entfallen. Dieser Ansatz verringert das Unbehagen der Patienten, minimiert Risiken und verbessert die Compliance der Patienten.
• Robuste StabilitätRNA, das in extrazellulären Vesikeln eingeschlossen ist, wird durch die Membranen der Vesikel geschützt, was es stabiler macht im Vergleich zu frei schwebendem RNA und es somit weniger anfällig für den Abbau durch RNA-Enzyme. Diese erhöhte Stabilität vereinfacht die Probenhandhabung und -lagerung und stärkt letztendlich die Zuverlässigkeit der Daten.
• Vielfalt und ReichtumExosomale RNA umfasst verschiedene RNA-Molekültypen, einschließlich mRNA, miRNA und lncRNA, und bietet eine Fülle von genetischen Ausdrucksdaten, die die tatsächlichen physiologischen Zustände und pathologischen Veränderungen der Zellen widerspiegeln.
• Echtzeit-ZellularreflexionAus lebenden Zellen stammend, bieten extrazelluläre Vesikel Echtzeiteinblicke in zelluläre physiologische und pathologische Zustände. Folglich kann das RNA-Sequencing von Exosomen genutzt werden, um den Krankheitsbeginn, den Verlauf und die Behandlungsergebnisse zu überwachen.
• Hohe Sensitivität und SpezifitätExosomale RNA-Sequenzierungstechniken zeichnen sich durch bemerkenswerte Sensitivität aus und sind in der Lage, RNA-Moleküle mit geringer Häufigkeit nachzuweisen. Darüber hinaus ermöglicht die Spezifität der Vesikel, die aus verschiedenen Zellursprüngen stammen, eine frühe Krankheitsdiagnose und präzise Subtypisierung durch RNA-Sequenzierung.
• Umfangreiche AnwendungenDie Exosomale RNA-Sequenzierung birgt ein enormes Potenzial in verschiedenen Krankheitsstudien, die Krebs, neurodegenerative Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und mehr umfassen. Ihre Nützlichkeit erstreckt sich über die frühe Krankheitsdiagnose, die Beurteilung der Prognose, das Monitoring von Behandlungen und die Entdeckung neuer Biomarker.
• Personalisierte Gesundheitsversorgung ermöglichenDurch die Sequenzierung von exosomaler RNA können personalisierte Genexpressionsprofile gewonnen werden. Wenn dies mit anderen molekularen Informationen kombiniert wird, kann dies den Weg für die Anpassung individueller Behandlungsstrategien ebnen, die therapeutische Wirksamkeit erhöhen und unerwünschte Reaktionen minimieren.

Exosomale RNA-Sequenzierungs-Workflow

CD Genomics bietet die umfassende exosomale RNA. NGS Dienstleistungen einschließlich der Isolierung von Exosomen aus Serum, Plasma, Urin, Gewebekulturmedien oder anderen Proben sowie der Extraktion ihrer zugehörigen RNA mit kommerziellen Kits. Der exosomale NGS-Service von CD Genomics kombiniert Illumina NGS mit Barcode-Bibliotheken und Next-Generation-Sequenzierung Plattformen, die tiefgehende Sequenzierungsdaten von höchster Qualität anbieten, um Ihre Forschung zu exosomaler RNA zu beschleunigen.

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen Gesamt-RNA ≥ 100 ng, Konzentration ≥ 20 ng/µL Zellüberstände ≥ 15 mL Serum, Plasma ≥ 1 mL OD A260/A280-Verhältnis ≥ 1,8, A260/230-Verhältnis ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Alle totalen RNA-Proben sollten DNA-frei sein. RNA sollte in nukleasefreiem Wasser oder RNA Stable aufbewahrt werden. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien Flexible Serviceoptionen umfassen HiSeq 4000, HiSeq X ten und NextSeq 500, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Sequenzierungsdatenvolumen: 10 Gb
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Rohdaten-QC Ausrichtung und TPM/RPKM/FPKM-basierte Quantifizierung Ausdrucksanalyse Statistiken zu SNPs/Indels Analyse des alternativen Spleißens GO- und KEGG-Annotation Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur exosomalen RNA-Sequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

Die Konferenz zur Exosomalen RNA-Sequenzierung von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und erläutert weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, sich zu melden. Kontaktieren Sie uns.

Referenz:

1. Kalluri R, LeBleu V S. Die Biologie, Funktion und biomedizinischen Anwendungen von Exosomen. Science, 2020, 367(6478): eaau6977.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Sequenzierungsqualitätsverteilung

A/T/G/C-Verteilung

IGV-Browser-Oberfläche

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA-Score-Diagramm

Venn-Diagramm

Volcano-Diagramm

Statistik Ergebnisse der GO-Anmerkung

KEGG-Klassifikation

1. Was ist die Funktion des Exosoms in der RNA?

Das Exosom fungiert als ein zentraler Akteur im RNA-Stoffwechsel und ist intricately in RNA-Abbau- und Verarbeitungsmechanismen involviert. Als RNA-Exoribonuklease-Komplex in eukaryotischen Zellen widmet sich das Exosom der Überwachung und dem Abbau einer Vielzahl von RNA-Spezies. Diese zentrale Rolle ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der zellulären RNA, die Orchestrierung von Genexpressionsmustern und die Reaktion auf zelluläre Stressoren. Darüber hinaus beteiligt sich das Exosom an RNA-Überwachungswegen und überwacht sorgfältig die Qualitätssicherung von RNA-Transkripten vor der Translation.

2. Welche RNA-Spezies sind in Exosomen enthalten?

Was die RNA-Spezies betrifft, die in Exosomen eingeschlossen sind, so umfasst sie eine reiche Auswahl, einschließlich Messenger-RNA (mRNA), Mikro-RNA (miRNA), lange nicht-kodierende RNA (lncRNA), Transfer-RNA (tRNA) und verschiedene minoritäre nicht-kodierende RNAs. Geschützt durch die Lipid-Doppelschichtmembran der Vesikel befinden sich diese RNA-Moleküle innerhalb der Exosomen, abgeschirmt vor schneller Zersetzung. Das Vorhandensein bestimmter RNA-Spezies in Exosomen hängt von Variablen wie Zelltyp, physiologischem Milieu und pathologischen Zuständen ab. Bedeutend ist, dass diese exosomalen RNAs die Fähigkeit haben, an Empfängerzellen übertragen zu werden, wo sie Einfluss auf Genexpressionsmuster und zelluläre Funktionen sowohl in normalen als auch in pathologischen Kontexten ausüben.

3. Welche Bibliotheksvorbereitungsmethode sollten wir wählen: Low-Input oder Standard?

Wenn die extrahierte RNA-Menge 100 ng überschreitet, ist es ratsam, die Standardmethode zur rRNA-Depletion anzuwenden und 100 ng RNA für die Vorbereitung der gesamten Transkriptom-Bibliothek zu verwenden. Im Allgemeinen führt eine größere Menge an Template während der Bibliotheksvorbereitung zu einer höheren Abdeckung genetischer Informationen. Der Ansatz zur Vorbereitung von Bibliotheken mit niedrigem Input wird verwendet, wenn die Probenmenge begrenzt ist; jedoch werden, wann immer möglich, konventionelle Methoden zur Bibliotheksvorbereitung für experimentelle Verfahren bevorzugt.

4. In Bezug auf Exosomenstudien, sollten wir Plasma oder Serum verwenden?

Die Empfehlung neigt dazu, Plasma zu verwenden, da die Neigung zur Aktivierung von Thrombozyten während der Gerinnung bei der Serumgewinnung zu einer signifikanten Anzahl von Exosomen und anderen Vesikeln führt. Folglich sind die aus Serum gewonnenen Vesikel konstant zahlreicher im Vergleich zu denen im Plasma, wobei über 50 % der Vesikel von Thrombozyten stammen. Daher dient Plasma als überlegenes Medium zur Untersuchung von Exosomen unter pathologischen physiologischen Bedingungen. Die Mehrheit der zirkulierenden Exosomenforschungsproben nutzt Plasma.

5. Was sind die wichtigsten Überlegungen für die RNA-Sequenzierung von Exosomen?

Im Kontext der Exosomen-RNA-Sequenzierung sind mehrere wichtige Überlegungen zu beachten:

ProbenqualitätSicherstellung der Qualität der Probenquelle und Einhaltung standardisierter Entnahmeverfahren.

ExosomenreinheitImplementierung effizienter Extraktionsmethoden zur Gewährleistung der Reinheit und Integrität von Exosomen.

RNA-QualitätExtrahierte RNA sollte eine hervorragende Integrität und Reinheit aufweisen, um eine Zersetzung zu verhindern.

Technologische PlattformAuswahl einer geeigneten Sequenzierungsplattform zur Gewährleistung der Datengenauigkeit und -zuverlässigkeit.

DatenanalyseEngagement eines kompetenten Teams für bioinformatische Analysen, um die wissenschaftliche Strenge und Robustheit der Datenanalyse sicherzustellen.

6. Was ist die Methode des Bibliotheksbaus?

CD Genomics bereitet typischerweise strand-spezifische, rRNA-depletierte cDNA-Bibliotheken aus der DNA-freien Gesamt-RNA vor.

Gekochte, aus Schweinefleisch stammende Exosomen-Nanovesikel vermitteln Stoffwechselstörungen – Mikro-RNA könnte der Übeltäter sein.

Journal: Zeitschrift für Nanobiotechnologie
Impactfaktor: 11,509
Veröffentlicht: 09. März 2023

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs), einschließlich Exosomen und Ektosomen, stellen lipidumhüllte Strukturen dar, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Exosomen, die typischerweise einen Durchmesser von 40 bis 160 nm aufweisen, fungieren als entscheidende Mediatoren der interzellulären Kommunikation und bieten vielversprechende Ansätze als diagnostische Marker für Krankheiten wie Krebs, Parkinson und Alzheimer. Exosomale miRNAs, die aus diätetischen Quellen stammen, enthalten Lipide, Proteine und mikroRNAs (miRNAs) und können absorbiert werden, um wesentliche biologische Funktionen innerhalb von Organismen auszuüben. Diese Untersuchung hat zum Ziel, Exosomen und miRNA-Profile zu charakterisieren, die aus gekochtem Schweinefleisch extrahiert wurden. Hochdurchsatz-Sequenzierung, die ihre Auswirkungen auf die murine Physiologie erläutern. Es hebt die Widerstandsfähigkeit von Exosomen und miRNAs unter erhöhten thermischen Bedingungen hervor und unterstreicht die diätetische Bedeutung von Schweinefleisch als primäre Nahrungsquelle.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Das Forschungsteam unterzog zunächst verschiedene Schweinegewebe (Fettgewebe, Muskel, Leber) einer gründlichen Kochbehandlung in Wasser, gefolgt von der Extraktion ihrer Exosomen mittels differenzieller Ultrazentrifugation. Die Untersuchung des Extrakts unter Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) ergab exosomähnliche Nanovesikel. Weitere Analysen mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) zeigten, dass 80 % der Partikel einen Durchmesser von 20-200 nm aufwiesen, mit einer durchschnittlichen Größe von 70,29 nm. Die anschließende Durchflusszytometrie ergab positive Raten von 84,5 % für die exosomspezifischen Marker CD63 und 95,9 % für CD81. Diese Charakterisierungsbefunde bestätigen die erfolgreiche Extraktion von Exosomen aus gekochten Schweinegeweben.

Abb. 1. Identifizierung von Exosomen, die aus gekochtem Fleisch isoliert wurden.

Bei der Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierungen wurde beobachtet, dass Exosomen, die aus verschiedenen Geweben stammen, Unterschiede in den Arten und Mengen der enthaltenen miRNAs aufweisen. Im exosomalen Inhalt von gekochtem Schweinemuskelfleisch (PMEx) machen miR-1, miR-133a-3p und miR-206 zusammen 80 % der gesamten miRNAs aus. Interessanterweise dominiert in Exosomen aus gekochter Schweineleber (PLEx) miR-122, das 37,8 % der gesamten miRNAs repräsentiert, während in Exosomen aus gekochtem Schweinefettgewebe (PFEx) miR-125b auffällig reichlich vorhanden ist.

Abb. 2. Mäusen wurde Trinkwasser mit PME zugesetzt.

Nach der Fütterung der extrahierten Exosomen an Mäuse über einen bestimmten Zeitraum wurden mehrere bemerkenswerte Beobachtungen gemacht: (1) Es wurde ein signifikanter Anstieg des Körpergewichts festgestellt; (2) die Spiegel von miR-1, miR-133a-3p, miR-206 und miR-99a im Blut stiegen merklich an, wobei während des Experiments zur Umkehrung der intestinalen Zotten eine anhaltende Erhöhung beobachtet wurde; (3) das Vorhandensein von Vakuolen und Lipidtropfen in Lebergewebe; (4) die Nüchternblutzuckerwerte stiegen signifikant an und die Verbrauchsrate verlangsamte sich nach einer Glukoseinjektion auf nüchternen Magen. Die experimentellen Ergebnisse bestätigen, dass CM-Exo von den Därmen in die Körper der Mäuse aufgenommen werden kann, was das Körpergewicht, die Blut-miRNA-Spiegel beeinflusst und an biologischen Regulationsprozessen wie der Glukosetoleranz, der endokrinen Glukosesignalgebung und dem Leberlipidstoffwechsel beteiligt ist.

Abb. 3. Übersicht über die transcriptomischen Veränderungen in der Leber von Mäusen.

Die Transkriptomanalyse von Mausleberproben identifizierte 446 differentially expressed genes (DEGs), davon 292 hochregulierte und 174 herunterregulierte Gene. GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen zeigten, dass diese DEGs überwiegend am Steroidstoffwechsel beteiligt sind. Anschließend wurde ein potenzielles miRNA-mRNA-Lipidstoffwechsel-Regulationsnetzwerk konstruiert, das eine signifikante Verbindung zwischen exosomalen miRNA und hepatischen Lipidstoffwechselwegen aufdeckte.

Abb. 4. Die 100 wichtigsten Hub-Gene, die aus dem PPI-Netzwerk identifiziert wurden; regulatorisches Netzwerk der miRNA–mRNA–Lipidstoffwechselwege.

Fazit

Extrazelluläre Vesikel, oder Exosomen, haben in der Zellbiologie erhebliche Aufmerksamkeit erregt, aufgrund ihrer potenziellen therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Ursprünglich als bloßer Zellabfall betrachtet, verstehen wir jetzt, dass ihre Funktionen weit über die Abfallentsorgung hinausgehen. Exosomen stellen eine neuartige Form der zellulären Kommunikation dar und tragen zu einer Vielzahl biologischer Prozesse bei, die für Gesundheit und Krankheit relevant sind.

Durch differenzielle Ultrazentrifugation gelang es dem Forschungsteam, Exosomen aus gekochtem Schweinefleisch (Fettgewebe, Muskel, Leber) erfolgreich zu isolieren. Die transkriptomische Analyse zeigte deutliche Unterschiede im miRNA-Gehalt, der in Exosomen aus verschiedenen Geweben eingeschlossen ist. Die Verabreichung von Exosomen an Mäuse und die Durchführung von Darm-Schleifen-Experimenten bestätigten, dass CM-Exo vom Darmtrakt aufgenommen werden kann, was das Körpergewicht und die miRNA-Spiegel im Blut beeinflusst und zu endokrinen Glukosesignalen sowie Störungen im hepatischen Lipidstoffwechsel führt. Insgesamt scheinen die Mikro-RNAs innerhalb von CM-Exo als wichtige regulatorische Faktoren bei der Induktion von Stoffwechselstörungen bei Mäusen zu fungieren.

Referenz:

1. Shen L, Ma J, Yang Y, u. a.Gekochte, aus Schweinefleisch stammende Exosomen-Nanovesikel vermitteln metabolische Störungen – MikroRNA könnte der Übeltäter sein. Journal für Nanobiotechnologie, 2023, 21(1): 83.