MeDIP‑Seq / hMeDIP‑Seq (DNA-Methylierungs- und Hydroxymethylierungs-Profilierung)

CD Genomics bietet MeDIP‑seq für die genomweite Methylierungsprofilierung und hMeDIP‑seq zur selektiven Erfassung von 5‑Hydroxymethylcytosin (5hmC) an, was eine parallele Analyse mehrerer Cytosinmodifikationen ermöglicht.

Einführung in MeDIP-seq und hMeDIP-seq

DNA-Methylierung bezieht sich auf die postreplikative Erhaltung oder die de novo Hinzufügung einer Methylgruppe an die Kohlenstoff-5-Position des Cytosin-Pyrimidinrings durch DNA-Methyltransferasen. Bei Säugetieren tritt DNA-Methylierung typischerweise in CG (mCG) und nicht-CG (mCHG oder mCHH, gemeinsam als mC bezeichnet) Kontexten auf. mCG allein macht ungefähr 60–80 % aller CG-Dinukleotide aus. Neben 5-Methylcytosin (5mC) wurden mehrere Cytosinmodifikationen identifiziert, darunter 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin. Unter ihnen ist 5hmC strukturell ähnlich zu 5mC, jedoch viel seltener und wird durch die Oxidation von 5mC durch die TET-Familie der Dioxygenasen erzeugt.

DNA-Methylierung und Hydroxymethylierung sind beide entscheidende epigenetische Marker, die an der Genregulation, der embryonalen Entwicklung, der zellulären Differenzierung und der Genomstabilität beteiligt sind. Die genomweite Analyse sowohl von 5mC als auch von 5hmC liefert wichtige Einblicke in die epigenetische Dynamik, insbesondere in Studien zur Entwicklung und zur Stressreaktion.

MeDIP‑seq koppelt Immunpräzipitation mit Hochdurchsatz-Sequenzierung um 5mC im gesamten Genom anzureichern und zu profilieren. Es nutzt Anti-5mC-Antikörper, um DNA-Fragmente, die methyliertes Cytosin (in mCG- und mCH-Kontexten) enthalten, selektiv zu erfassen. Diese angereicherten Fragmente werden sequenziert, und ihre Leseverteilung kann verwendet werden, um relative Methylierungsniveaus zu schätzen.

Um 5hmC zu unterscheiden und spezifisch zu profilieren, bietet CD Genomics auch hMeDIP‑seq an, das 5hmC-spezifische Antikörper verwendet, um hydroxymethylierte DNA-Fragmente anzureichern. Dieser ergänzende Ansatz ermöglicht es Forschern, 5mC- und 5hmC-Modifikationen parallel getrennt zu profilieren, was die Auflösung der epigenetischen Kartierung über verschiedene Probenarten hinweg verbessert. Sowohl MeDIP‑seq als auch hMeDIP‑seq sind nicht-destruktive, umwandlungsfreie Methoden, die nicht auf Bisulfidbehandlung oder uracil-tolerante Polymerasen angewiesen sind und mit Proben mit niedrigem Input kompatibel sind.

Vorteile von MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Kann mC, mCG oder hmC anvisieren.
• Ganzes Genom oder bestimmte Interessensregionen
• Nahezu unbeeinflusst und Hypothese
• Entdeckung epigenetischer Biomarker
• Einzel-Nukleotid-Auflösung und Kosten-Effizienz
• Niedriger DNA-Eingangswert

Anwendungen von MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Epigenetische Heterogenität
• Umwelt und Epigenetik
• Regulation der genetischen Expression
• Krankheitsforschung
• Genetische Prägung
• Embryonale Entwicklung
• Erkennung von DNA-Methylierungs-angereicherten Regionen in Krankheitsproben und Ableitung von Kandidatengen-Sets, deren Expression in den Proben unterdrückt ist.
• Überwachung der dynamischen DNA-Methylierungsmuster in verschiedenen Phasen des Auftretens und der Entwicklung von Krankheiten, insbesondere an Läsionsstellen, um epigenetische Marker zu identifizieren, die helfen, das Ausmaß des Krankheitsfortschritts zu definieren.
• Vergleichende Analyse der Unterschiede in der Signal- und Standortverteilung von DNA-Methylierungsregionen zwischen Krankheits- und Normalproben, Identifizierung von krankheitsspezifischen DNA-Methylierungsregionen und Beobachtung der Gene in der Umgebung dieser Regionen, um die Liste der Kandidatengene, die mit der Krankheit in Zusammenhang stehen, einzugrenzen.
• Kartierung von Hydroxymethylierungs-(5hmC)-Landschaften in Geweben, Zell-Differenzierungs- oder Stressreaktionsmodellen unter Verwendung von hMeDIP-seq.

MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq Arbeitsablauf

Der allgemeine Arbeitsablauf für MeDIP-Sequenzierung ist unten skizziert. Kurz gesagt, wird die extrahierte DNA fragmentiert, denaturiert, mit Adaptern ligiert und mithilfe von Antikörpern, die gegen 5-Methylcytosin (für MeDIP-seq) oder 5-Hydroxymethylcytosin (für hMeDIP-seq) gerichtet sind, eingefangen, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung auf Illumina-Plattformen.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Genomisches DNA ≥ 2 μg, Mindestmenge: 1 μg, Konzentration ≥ 100 ng/µl OD 260/280=1,8~2,0 Alle DNA-Proben sollten mit RNase behandelt werden und keine Zersetzung oder Kontamination aufweisen. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien MeDIP/hMeDIP Bibliotheksvorbereitung Illumina HiSeq4000, PE150 50M Lesevorgänge oder 10 G Daten pro Probe Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Ausrichtung gegen das Referenzgenom Ausrichtung gegen das Referenzgenom Verteilung der gesamten Genomregion Spitzenverteilungsstatistiken Genscreening im Zusammenhang mit Spitzenereignissen Funktionelle Annotation mit GO/KEGG-Analyse Differenzielle Expressionsanalyse von mit Peaks assoziierten Genen Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq für Ihre Schreibanpassung.

Mit professionellen bioinformatischen Fähigkeiten bietet CD Genomics hochwertige MeDIP-Seq als einen umfassenden, genomweiten epigenetischen Service an, um unterschiedlich methylierten Regionen zu identifizieren und letztendlich die epigenetische Forschung zu beschleunigen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, sich zu melden. Kontaktieren Sie uns.

Referenz:

1. Taiwo O, Wilson G A, Morris T, u. a.Methylom-Analyse mit MeDIP-seq bei niedrigen DNA-Konzentrationen. Naturprotokolle, 2012, 7(4): 617.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Im Vergleich zu anderen Methoden, welche Vorteile bietet die MeDIP-Sequenzierung?

Derzeit kann der sequenzierungsbasierte Ansatz zur Methylom-Analyse in bisulfitkonversionsbasierte und anreicherungsbasierte Ansätze unterteilt werden. Zu den bisulfitkonversionsbasierten Methoden gehören Ganzgenom oder gezielt Bisulfit-Sequenzierung oder reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (RRBS)Obwohl Methoden auf Bisulfitkonversion als der Goldstandard der DNA-Methylierungsanalyse mit Einzelbasenauflösung gelten, können sie zwischen mC und hmC nicht unterscheiden. Darüber hinaus, Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung ist teuer für Anwendungen mit großen Stichprobengrößen und für kleinere Forschungsgruppen. Und RRBS kann nur eine begrenzte Genomabdeckung (5-10%) bieten und konzentriert sich auf CpG-Inseln und Promotorregionen.

Neben der MeDIP-Sequenzierung umfassen anreicherungsbasierte Technologien auch MBD-seq, das die methylbindenden Proteine MBD2 und MDB3L1 verwendet, sowie methylCap-seq, das die methylbindende Domäne von MECP2 zur Methylcapture nutzt. MBD-seq und methylCap-seq sind jedoch auf die Analyse von mCG beschränkt, und Protokolle für das gesamte Genom erfordern oft hohe Konzentrationen an genomischer DNA (mehr als 1.000 ng). Daher ist MeDIP eine vielseitige, präzise und kostspielige Methode mit einem geringen DNA-Eingangsbedarf und ist auf eine breite Palette von Proben und Studien anwendbar.

2. Was sind die Anforderungen an Proben für MeDIP-Sequenzierung?

MeDIP-Sequenzierungsproben benötigen ein Referenzgenom oder Sequenzen für die Ausrichtung, und die zusammengefügten Ergebnisse beeinflussen direkt die Genauigkeit der Datenanalyse. Ein Referenzgenom von eng verwandten Arten oder zusammengefügte Ergebnisse aus dem Transkriptom können ebenfalls verwendet werden, obwohl dabei teilweise Methylierungsinformationen verloren gehen.

3. Welche Faktoren können die Ergebnisse von MeDIP-seq beeinflussen?

Jeder Prozess, der an MeDIP-seq beteiligt ist, kann die Ergebnisse beeinflussen, insbesondere die Immunpräzipitation und die PCR. Die Immunpräzipitation ist der Prozess zur Anreicherung von methylierten Regionen, und die Reaktionsbedingungen können die Anreicherungsresultate beeinflussen. Wenn nicht genügend DNA recycelt wird, wird PCR verwendet, um die Menge zu erhöhen, was die Ergebnisse verzerren kann. Darüber hinaus sollte Kontamination während des gesamten Prozesses vermieden werden.

Epigenetische Veränderungen bei TRAMP-Mäusen: Epigenom-DNA-Methylierungsprofilierung mittels MeDIP-seq

Journal: Zellen & Biowissenschaften
Veröffentlicht: 12. Januar 2018

Zusammenfassung

Die Autoren profilierten das Methylom des Mausprostatakrebsmodells (TRAMP) und analysierten die Wechselwirkungen zwischen den gezielten Genen und dem damit verbundenen funktionalen Weg. Durch die Nutzung von MeDIP-Sequenzierung analysierten sie DNA-Methylierung Profile und durchgeführte relevante Informatikanalysen, die Strategien für Präventions- und Behandlungsansätze bei Prostatakrebs liefern könnten.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

1. Vergleich der MeDIP-seq Ergebnisse

Insgesamt zeigten 2147 Gene zwischen TRAMP- und Kontrolltieren eine signifikante Veränderung in den methylierten Peaks. Im Vergleich zur Kontrolle wurden eine signifikant erhöhte Methylierung von 1042 Genen und eine signifikant verringerte Methylierung von 1105 Genen bei TRAMP beobachtet. Vier interessante Gene, DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 und TTR, wurden mit IGV analysiert. TRAMP-Mäuse zeigten ein erhöhtes Methylierungsverhältnis von DYNC1I1 und SLC1A4 sowie ein verringertes Methylierungsverhältnis von TTR und XRCC6BP1, was mit den Ergebnissen der MeDIP-seq übereinstimmte.

Abbildung 1. Visualisierung des integrativen Genomik-Viewers der Verteilung der ausgerichteten Reads gegen das Referenzgenom für vier Zielgene: DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 und TTR.

2. qPCR-Validierung der ausgewählten Genexpression

Die Expressionsniveaus von CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 und TTR wurden sowohl in der TRAMP- als auch in der Wildtyp-Gruppe gemessen (Abbildung 2). Unter ihnen war die TTR-Expression um das 9,05-Fache im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Die Expressionsniveaus von TTR waren in Prostatakrebsgewebe signifikant höher als in normalem Gewebe und in Gewebe mit benigner Prostatahyperplasie. Darüber hinaus fanden sie eine verringerte Methylierung im Promotorbereich von TTR, jedoch eine erhöhte Genexpression. Im Gegensatz dazu könnte die DNA-Methylierung im Genkörper oder downstream eine reziproke Beziehung aufweisen oder auch nicht.

Abbildung 2. Vergleich der miRNA-Expression von CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 und TTR zwischen Proben des Prostatagewebes von Wildtyp- und TRAMP-Mäusen.

3. Kanonischer Weg, Krankheiten und Funktionen sowie Netzwerkanalysen.

Die 2147 Gene mit signifikanten Veränderungen in der Methylierung wurden analysiert. Die krebsbezogenen Netzwerke machten den Großteil aus (Tabelle 2), was darauf hindeutet, dass der Unterschied zwischen TRAMP und der Kontrolle in der Organentwicklung und der Krebsentwicklung lag. Die am häufigsten assoziierten Krankheiten, Krebs, gastrointestinale Erkrankungen, Organismusanomalien, Erkrankungen des Fortpflanzungssystems und dermatologische Erkrankungen, belegten die ersten fünf Plätze (Abbildung 3).

Tabelle 1. Die zehn wichtigsten veränderten kanonischen Signalwegen.

Tabelle 2. Top analysierte Netzwerke.

Abbildung 3. Die fünf wichtigsten assoziierten Krankheitskategorien (a) und die fünf wichtigsten Krebsuntertypen (b), die analysiert wurden.

Diskussion

Die Analyse des kanonischen Weges würde Informationen für die Entwicklung neuer therapeutischer Ziele liefern. Wie in Abbildung 4 gezeigt, waren die Gene mit signifikanter Methylierung im wichtigsten kanonischen Weg der neuropathische Schmerzsignalweg, was mit der früheren Feststellung übereinstimmt, dass die häufigste Malignität bei TRAMP neuroendokrinen Ursprungs ist. Tabelle 3 listet die Gene auf, die an diesem Weg beteiligt sind und eine veränderte Methylierung zeigten. CREB wurde als eng mit Zellproliferation, Differenzierung und adaptiven Reaktionen im neuronalen System verbunden gefunden, und die Methylierung des CREB1-Gens wurde bei TRAMP um 2,274 verringert. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass CREB auch andere Karzinogenese-Wege reguliert. All diese Daten deuten darauf hin, dass CREB eng mit der Krebsbehandlung verbunden ist und eine neue Strategie zur Prävention und Therapie von Prostatakrebs darstellen könnte.

Abbildung 4. Gene, die auf den kanonischen Signalweg für neuropathische Schmerzen abgebildet sind.

Tabelle 3. Veränderte Methylierungsgene, die dem Signalweg der neuropathischen Schmerzen zugeordnet sind.

Referenz:

1. Li W, Huang Y, Sargsyan D, u. a.Epigenetische Veränderungen bei TRAMP-Mäusen: Epigenom-DNA-Methylierungsprofilierung mittels MeDIP-seq. Zell- und Biowissenschaften, 2018, 8(1): 3.