MeRIP-Sequenzierung (m6A-Analyse)

CD Genomics bietet die transkriptomweite Analyse der Position von m6A in mRNA-Transkripten und anderen RNAs durch methylierte RNA-Immunpräzipitation-Sequenzierung (MeRIP-seq) an. MeRIP-seq verwendet einen Antikörper, der spezifisch N6-Methyladenosin (m6A) in RNA erkennt und charakterisiert. Da die 3'UTR von mRNA eine wichtige Rolle bei der Stabilität, Lokalisierung und Translation von mRNA spielt und die Bindung von RNA-regulatorischen Proteinen an diese Regionen beeinflussen kann, deutet eine Anreicherung von m6A in diesem Bereich darauf hin, dass m6A den RNA-Stoffwechsel und die Genexpression beeinflussen könnte. Die Hemmung der Enzyme, die an der RNA-Methylierung beteiligt sind, hat ebenfalls Hinweise auf die potenziellen biologischen Rollen dieser Modifikation geliefert. Daher kann die Identifizierung und Charakterisierung von modifizierten Basen in RNA zu einem besseren Verständnis biologischer Signalwege führen.

Was ist MeRIP-Sequenzierung?

N6-Methyladenosin (m6A), die am weitesten verbreitete Form der Methylierungsmodifikation innerhalb des mRNA-Sequenzen Eukaryoten haben die Fähigkeit, das eukaryotische Transkriptom funktionell zu regulieren und somit die Prozesse der mRNA-Spleißung, des nukleären Exports, der Lokalisation, der Translation und der Stabilität zu beeinflussen. Das Vorhandensein von m6A-RNA in verschiedenen wichtigen zellulären Lebensprozessen zeigt, dass die mRNA-Methylierung an zahlreichen biologischen Prozessen beteiligt ist, wie z.B. der Differenzierung von Stammzellen und dem zirkadianen Rhythmus, und in die Pathogenese verschiedener Krankheiten verwickelt ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Karzinogenese, Fettleibigkeit und Unfruchtbarkeit.

Die primäre Technik für die Transkriptomforschung zu N6-Methyladenosin (m6A) ist MeRIP-seq (Methylierte RNA-Immunpräzipitation-Sequenzierung). Das zugrunde liegende Prinzip dieser Methode besteht darin, m6A-spezifische Antikörper zu verwenden, um RNA-Fragmente mit m6A-Modifikationen innerhalb der Zelle zu immunpräzipitieren, gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung dieser angereicherten RNA-Fragmente. In Kombination mit bioinformatischer Analyse kann eine umfassende systematische Forschung zu m6A-Modifikationen auf transkriptomweiter Ebene durchgeführt werden.

Vorteile unseres MeRIP-Sequenzierungsdienstes

• Hohe Flexibilität: In der Lage, hochmethylierten Fragmenten des Transkriptoms aus jeder Art direkt zu sequenzieren, ohne dass Informationen über die bekannte Genomsequenz erforderlich sind.
• Hohe Präzision: In der Lage, innerhalb eines Bereichs von 100-200 Nukleotiden um die tatsächliche Bindungsstelle genau zu lokalisieren.
• Digitales Signal: Ermöglicht die quantitative und sequenzielle Analyse direkt an methylierten Fragmenten und beseitigt Probleme mit Kreuzreaktivität und Hintergrundgeräuschen, die mit traditionellen Chip-Hybridisierungs-fluoreszenten Analogsignalen verbunden sind.
• Umfassende Plattform: MeRIP-Experiment—Bibliothekskonstruktion, Sequenzierungsanalyse—MeRIP qPCR-Validierung, die einen echten Rundum-Service bietet.
• Flexible Auswahl: Optionen für Bibliothekskonstruktionsmethoden und Fragmentgrößen.
• Gute Reproduzierbarkeit: Umfangreiche Projekterfahrung gewährleistet die experimentelle Reproduzierbarkeit, wobei vergleichende Analysen zwischen mehreren Proben durchgeführt werden.

Anwendung von MeRIP-Sequenzierung

• Verteilung der RNA-Methylierung in eukaryotischen Organismen;
• mRNA-Methylierung in Tieren und Pflanzen und ihre Reaktionsmechanismen auf Umweltstress;
• Mechanismen des Widerstands gegen mRNA-Abbau;
• Mechanismen, die der Tumorinitiierung und -proliferation zugrunde liegen;
• Biologische Funktionsstudien verschiedener Pflanzen;
• Krebsentstehung und Metastasierung; Krankheitsbeginn und -fortschritt;
• Zellendifferenzierung, embryonale Entwicklung und Stressreaktion.

MeRIP-Sequenzierungs-Workflow

CD Genomics führt den m6A-Mapping-Ansatz unter Verwendung von Immunpräzipitation mit m6A-spezifischen Antikörpern durch, gefolgt von NGS (MeRIP-Seq). Poly(A)-selektierte RNA wurde in 100-Nukleotid-lange Oligonukleotide (Input) fragmentiert und mit einem anti-m6A affin gereinigten Antikörper immunpräzipitiert, bevor sie einer Illumina-Nächste-Generation-Sequenzierung unterzogen wurde. Da immunpräzipitierte RNA-Fragmente m6A an beliebigen Stellen entlang ihrer Länge enthalten können, erzeugen mehrere verschiedene m6A-haltige Fragmente überlappende Reads. m6A-Stellen wurden bioinformatisch vorhergesagt, indem ein Peak-Erkennungsalgorithmus verwendet und nach dem Vorhandensein einer Teilmenge von DRACH-Motiven in der Nähe des Punktes mit der höchsten Read-Abdeckung gesucht wurde.

Abb. 1 MeRIP-Sequenzierungsprotokoll

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Gesamt-RNA ≥ 10 μg, Konzentration ≥ 1 ng/µL RIN-Wert ≥ 7,0 Zelle ≥ 1×107 Gewebe ≥ 500 mg
	Sequenzierung Flexible Serviceoptionen umfassen HiSeq X und NextSeq 500.
	Bioinformatikanalyse Identifizierung von m6A-Resten in RNA Die Verteilung von m6A-Spitzen entlang der Transkripte Differenzielle Spitzenanalyse

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur MeRIP-Sequenzierung für Ihre Schrift (Anpassung)

Die MeRIP-Sequenzierungskonferenz von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und beleuchtet weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Dominissini D, et al. Topologie der m6A-RNA-Methylome von Mensch und Maus, enthüllt durch m6A-seq. Natur, 2012 Apr 29; 485(7397):201-6.
2. Jesus D F D, et al. m6A mRNA-Methylierung reguliert die Biologie menschlicher β-Zellen in physiologischen Zuständen und bei Typ-2-Diabetes. Nature Metabolism2019,1, 765–774.

m6A mRNA-Methylierung reguliert die menschliche β-Zellbiologie in physiologischen Zuständen und bei Typ-2-Diabetes. (Jesus et al., 2019)

Könnte MeRIP-seq unter Artenbeschränkungen stehen?

Für Arten mit Referenzgenomen, die auf chromosomaler Ebene assembliert sind, und solche mit umfassenden gtf-Annotationsdateien ist diese Methodik anwendbar. Es gibt unterschiedliche Methoden und Parameter, die in der Peak-Detektionssoftware für Eukaryoten, Prokaryoten oder Viren verwendet werden. Daher ist es ratsam, dass Projekte, die sich auf Prokaryoten oder Viren konzentrieren, vorläufige Bewertungen durchführen.

2. Warum ist es notwendig, Input- und IP-Proben gleichzeitig in MeRIP-Experimenten zu messen?

Das MeRIP-Projekt ist durch zwei Komponenten gekennzeichnet: das Input und das IP. Im experimentellen Verfahren nutzt die IP-Probe einen m6A-Antikörper, um spezifisch die methylierten RNA-Fragmente anzureichern. Im Gegensatz dazu besteht das Input, das ausschließlich aus fragmentierter RNA besteht, als Kontrolle, um Hintergrundgeräusche zu minimieren. Sowohl die IP- als auch die Input-Komponenten werden parallel für die Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung verarbeitet. Für die Peak-Erkennungsanalyse müssen die Daten beider Proben integriert werden, wobei die Input-Daten verwendet werden, um Peaks auszuschließen, die hohen basalen Expressionsniveaus oder unspezifischen Bindungsereignissen entsprechen, um die Präzision der Peak-Bestimmung zu maximieren.

3. Was sind die Stärken und Einschränkungen der MeRIP-Sequenzierung?

Die MeRIP-Sequenzierungstechnik bietet mehrere Vorteile:
Hochdurchsatz: Es ermöglicht die gleichzeitige Analyse einer beträchtlichen Anzahl von RNA-Proben. Hohe Empfindlichkeit: Es ist in der Lage, m6A-Modifikationen mit geringer Häufigkeit nachzuweisen. Räumliche Auflösung: Diese Technik kann den Standort von m6A-Modifikationen genau bestimmen.

Die MeRIP-Sequenzierungstechnik hat jedoch auch ihre Einschränkungen:
Antikörperabhängig: Die Auswahl und Qualität der Antikörper kann potenziell die experimentellen Ergebnisse beeinflussen.
Präzision: Während die Sequenzierungsdaten einen allgemeinen Standort von m6A-Modifikationen liefern können, sind sie nicht in der Lage, die genaue Base zu bestimmen.
Komplexe Datenanalyse: Ein hohes Maß an spezialisierten Fähigkeiten in der Datenanalyse ist erforderlich, um Sequenzierungsdaten zu interpretieren und m6A-Modifikationsstellen zu identifizieren.

4. Was ist das Prinzip der MeRIP-Sequenzierung?

Das Prinzip der Merip-Sequenzierung basiert auf der MeRIP-Technologie und hochdurchsatzfähiger RNA-Sequenzierung. Zunächst werden RNA-Proben MeRIP-Experimenten unterzogen, bei denen spezifische Antikörper eingesetzt werden, um RNA-Moleküle zu binden, die mit m6A modifiziert sind. Anschließend werden m6A-modifizierte RNA-Moleküle aus der Gesamt-RNA durch Immunpräzipitation angereichert. Nach der Anreicherung wird die RNA einer reversen Transkription und der Bibliotheksvorbereitung für die DNA-Sequenzierung unter Verwendung hochdurchsatzfähiger Sequenzierungstechnologie unterzogen. Schließlich erfolgt die Analyse der Sequenzierungsdaten, um die Positionen und relativen Häufigkeiten von m6A-Modifikationen zu bestimmen.

RNA-Methylome zeigen die m6A-vermittelte Regulation des DNA-Demethylase-Gens SlDML2 bei der Reifung von Tomatenfrüchten.

Journal: Genomik Biologie
Impactfaktor: 14,028
Veröffentlicht: 06. August 2019

Hintergründe

Es ist gut etabliert, dass die Modifikationen von DNA 5mC und mRNA m6A eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression spielen. Die Erhaltung der DNA 5mC-Modifikation unterstreicht ihre grundlegende Rolle bei der Modulation mehrerer biologischer Prozesse. Diese Studie hebt ihre Verbindung zur Reifung von Früchten hervor. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Mutagenese des DNA-Demethylase-Gens SlDML2 in Tomaten eine Hypermethylierung im gesamten Genom auslöst und die Fruchtreifung erheblich hemmt. Die Rolle, die m6A in diesem Prozess spielt, sowie die potenziellen Wechselwirkungen zwischen 5mC und m6A bleiben jedoch unklar. Es ist bereits bekannt, dass die m6A-Modifikation, vermittelt durch die RNA-Demethylase SlALKBH2, das homologe Gen der DNA-Demethylase SlDML2 in Arabidopsis regulieren kann.

Methoden

Ergebnisse

1. Die m6A-Modifikation zeigt während des Reifungsprozesses der Früchte eine dynamische Verschiebung, wobei der gesamte m6A-Spiegel allmählich abnimmt, während die Früchte reifen, was den Mustern der DNA-Methylierung entspricht. Bei Mutationen mit Reifungsdefekten wie Cnr ist der gesamte m6A-Spiegel neben der DNA-Hypermethylierung ebenfalls höher.

Abbildung 1 Dynamik der DNA-Methylierung (5mC) und der mRNA m6A-Methylierung beim Reifen von Tomatenfrüchten.

2. Die Methylierungsmodifikation m6A ist weit verbreitet in der mRNA von Tomatenfrüchten und zeigt eine umgekehrte Beziehung zu den Transkriptionsniveaus der Gene.

Die gesamten m6A-Spiegel während der Fruchtreifung und im Cnr-Mutanten entsprechen der Expression des m6A-Demethylase-Gens SlALKBH2, das der DNA-Methylierungsregulation unterliegt. SlALKBH2, eine m6A-Demethylase, hat die Fähigkeit, an die mRNA des DNA-Demethylase-Gens SlDML2 zu binden, um dessen m'6A-Modifikation und Stabilität zu regulieren. Bei einer Mutation des SlALKBH2-Gens steigen die m6A-Spiegel in SlDML2, während der mRNA-Gehalt sinkt, was die normale Fruchtreifung behindert.

Abbildung 2. SlALKBH2 ist notwendig für die normale Reifung von Tomatenfrüchten.

Fazit

Diese Studie bestätigt vorläufig die Verbindung zwischen DNA-Methylierung und RNA-Methylierung, wodurch ein neuer Mechanismus der Regulierung des Fruchtreifungsprozesses aufgedeckt wird, der neue Einblicke in das Kontrollnetzwerk der Fruchtreife bietet. Angesichts der Multifunktionalität von DNA-Methylierung und RNA-Methylierung wird der in dieser Studie demonstrierte Rückkopplungsregulationsmechanismus auch auf andere biologische Prozesse anwendbar sein.

Referenz:

1. Zhou L, Tian S, Qin G. RNA-Methylome zeigen die m 6 A-vermittelte Regulation des DNA-Demethylase-Gens SlDML2 bei der Reifung von Tomatenfrüchten. Genombiologie, 2019, 20: 1-23.