Lange Amplicon-Analyse (LAA)

CD Genomics bietet einen professionellen und kosteneffizienten LAA-Service mit einer Sequierungstiefe von <500 bis 10K CCSs pro Probe, um Ihre spezifischen Forschungsanforderungen zu erfüllen.

Die Einführung der Lang-Amplikon-Analyse

Die Long Amplicon Analyse (LAA) ist eine molekularbiologische Technik, die entwickelt wurde, um erweiterte DNA-Sequenzen zu untersuchen und zu analysieren. Diese Strategie amplifiziert hauptsächlich lange Fragmente genomischer DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bevor eine anschließende Sequenzierung und Dateninterpretation erfolgt. Diese Methode hat bedeutende Anwendungen in der Genomik, Evolutionsbiologie, Krankheitsforschung sowie in anderen Bereichen, die Forschung zu komplexen Genstrukturen und Variationen erfordern.

Basierend auf den PacBio Circular Consensus Sequences (CCSs) kann die Polymerase denselben DNA-Bereich mehrere Male kopieren, was hochpräzise, lange Reads (>99,9% Genauigkeit bei Einzelmolekül-Reads) erzeugt. Die Long Amplicon Analyse (LAA) unter Verwendung von Einzelmolekül, Echtzeit (SMRT) Sequenzierung und das Sequel-System produziert hochgenaue und phasierte CCSs aus langen Amplicons.

Abbildung 1. Übersicht über die SMRT-Sequenzierungstechnologie. (Simon Ardui, u. a.., 2018)

Im Vergleich zu den Plattformen für Kurzlesesequenzierung ermöglicht die Langlesesequenzierung von PacBio eine unkomplizierte Sequenzierung von Ampliconen oder erfassten Fragmenten, die von mehreren hundert Basenpaaren bis zu 10 Kb reichen. Diese langen Sequenzen sind sehr nützlich für die Visualisierung von Varianten, einschließlich SNPs, CNVs und anderen strukturellen Varianten, die typischerweise keine Assemblierung erfordern.

Was sind die Vorteile der Langampliconanalyse?

• Hohe Genauigkeit: Durch den Einsatz von hochpräzisen Polymerasen reduziert die Long Amplicon Analyse Fehler während des Amplifikationsprozesses und verbessert die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.
• Komplexe Regionenauflösung: LAA kann komplexe und sich wiederholende Regionen im Genom abdecken und erläutern, wodurch ein umfassenderes Set an genomischen Informationen bereitgestellt wird.
• Breite Anwendbarkeit: Die Technik ist nicht nur für nukleare Genome anwendbar, sondern auch nützlich für die Analyse verschiedener DNA-Typen, einschließlich mitochondrialer DNA und chloroplastischer DNA.
• Hohe Nachweisempfindlichkeit: Die Analyse langer Ampliconen kann große Insertionen/Löschungen, Inversionen und Translokationen identifizieren und nachweisen, wodurch die Empfindlichkeit für die Erkennung komplexer genomischer Variationen erhöht wird.
• Hohe haplotypische Auflösung: Langzeit-Sequenzierung kann verschiedene Haplotypen desselben Individuums innerhalb eines einzelnen Amplicons identifizieren und unterscheiden und liefert detaillierte Informationen über die Haplotypstruktur und -variationen.
• Vollständige Genlängenabdeckung: Bei Mutationen, die mehrere Exons oder ganze Gene betreffen, kann LAA gesamte Genregionen abdecken, um sicherzustellen, dass keine wichtigen Mutationen übersehen werden.
• Vereinfachter Assemblierungsprozess: Die Long-Read-Fähigkeit deckt größere genomische Regionen ab, reduziert Fehlanpassungen und Redundanzen während des Assemblierungsprozesses und macht die Ergebnisse der Assemblierung präzise und zuverlässig.

Was sind die Anwendungen der Lang-Amplikonanalyse?

• Vollständige 16S/18S/ITS Gen-Sequenzierung
• Vollformat HLA-Typisierung
• Alternative Haplotypisierung
• De novo Zusammenstellung des gezielten Gens
• Benutzerdefiniert Amplicon-Sequenzierung

Lang-Amplikon-Analyse-Workflow

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen 2 µg oder mehr von Amplicons (d.h. gereinigte PCR-Produkte) mit einer Konzentration von ~50 ng/µl oder höher sollten in Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8) gelöst und auf Trockeneis verpackt versendet werden. Wir bieten auch einen Dienst zur Vorbereitung von Ampliconen an, aus Ausgangsmaterialien wie genomischer DNA, Zellpellets und Geweben.
	Sequenzierung PacBio-Sequenzierung Plattform 3 kb bis >10 kb Amplicons >99,999% Genauigkeit
	Bioinformatische Analyse Für die vollständige Sequenzierung der 16S/18S/ITS-Gene: OTU-Clustering und -Filterung OTU-Analyse und Artenannotation Alpha-Diversität, Beta-Diversität, Metaanalyse Multivariate statistische Analyse Für andere Anwendungen bitten wir um Anfrage.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Langampliconanalyse für Ihr Schreiben (Anpassung)

Referenzen:

1. Simon Ardui, u. a.(2018) Die Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung (SMRT) erreicht ihren Höhepunkt: Anwendungen und Nutzen für medizinische Diagnostik. Nukleinsäurenforschung. 46(5) 2159–2168.
2. Joshua P. Earl, u. a.(2018) Artenebene bakterielle Gemeinschaftsprofilierung des gesunden sinonasalen Mikrobioms unter Verwendung von Pacific Biosciences-Sequenzierung vollständiger 16S rRNA-Gene. Mikrobiom. 6.
3. Henk P.J. Buermans, u. a.(2017) Flexible und skalierbare Voll-Längen CYP2D6 Long Amplicon PacBio-Sequenzierung. Menschliche Mutation38(3) 310–316.
4. Frans, Glynis, u. a.(2018) Konventionelle und Einzelmolekül-Target-Sequenzierungsmethode zur spezifischen Variantenerkennung in IKBKG unter Umgehung des IKBKGP1-Pseudogens. Das Journal für Molekulare Diagnostik 20(2): 195-202.

(Französisch) u. a.., 2018)

1. Was sind die Hauptanwendungsbereiche der Long Amplicon Analyse?

Die Analyse langer Amplicons findet umfangreiche Anwendung in einer Vielzahl von Forschungsbereichen, zu denen gehören:

• Studien zu genomischen strukturellen Variationen: Sie werden verwendet, um komplexe Variationen zu analysieren, die bedeutende Einsätze, Löschungen, Inversionen und wiederholte Sequenzen umfassen.
• Forschung zu genetischen Erkrankungen: Dieses Werkzeug unterstützt bei der Identifizierung komplexer Mutationen, die mit verlängerten genomischen Regionen verbunden sind, die mit der klinischen Diagnose in Zusammenhang stehen.
• Studien zur Evolution und Phylogenie: Die Analyse langer Amplicons ermöglicht die Untersuchung genetischer Variationen zwischen Arten und beleuchtet somit evolutionäre Beziehungen.
• Forschung zur mikrobiellen Vielfalt: Sie wird verwendet, um die Struktur des gesamten Genoms mikrobieller Gemeinschaften in verschiedenen Umweltproben zu untersuchen.

2. Was ist der grundlegende Arbeitsablauf der Long Amplicon Analyse?

Die Kernprozesse, die der Long Amplicon Analyse zugrunde liegen, beginnen mit der DNA-Extraktion und -Reinigung. Der Vorgang umfasst die Isolierung von DNA höchster Qualität aus den gegebenen Proben. Darauf folgt ein PCR-Amplifikationsprozess, bei dem spezifische Primer in Verbindung mit hochfidelity Polymerasen verwendet werden, um Zielsegmente zu verstärken.

Anschließend erfolgt der Prozess der Ampliconreinigung, bei dem verbleibende nicht amplifizierte DNA und Primer-Dimere entfernt werden. Dies führt zum Schritt der Bibliotheksvorbereitung und einer Qualitätskontrolle. Hier werden Bibliotheken, die mit Sequenzierungsplattformen kompatibel sind, vorbereitet und eine strenge Qualitätskontrolle durchgeführt, um ihre Eignung für nachfolgende Verfahren sicherzustellen.

Hochdurchsatz-Sequenzierung ist die nächste Schlüsselphase, die Plattformen wie PacBio nutzt und Oxford Nanopore geeignet für Langzeit-SequenzierungNach dem Sequenzierungsschritt wird eine umfassende Datenanalyse durchgeführt. Diese Analyse umfasst Qualitätskontrolle, Ausrichtung, Variantenentdeckung und funktionale Annotation.

Bevor die Daten gespeichert und für die Verteilung bereitgestellt werden, gibt es eine wichtige Phase der Ergebnisvalidierung und -berichterstattung. Wichtige Erkenntnisse werden experimentell überprüft, und umfassende Analyseberichte werden erstellt. Als abschließender Schritt werden die Daten sicher in Datenbanken gespeichert, wonach sie gemäß den Forschungsanforderungen für die gemeinsame Nutzung zugänglich gemacht werden.

3. Welche häufig verwendeten Werkzeuge gibt es in der Datenanalyse von langen Amplicon-Analysen?

Werkzeuge, die in der Datenanalyse verwendet werden, umfassen:
Qualitätskontrolle: FastQC, Trimmomatic, Cutadapt.
Ausrichtung und Zusammenstellung: BWA, Bowtie2, Minimap2, Canu, Flye.
Variantenerkennung: GATK, FreeBayes, Manta, LUMPY.
Funktionale Annotation: ANNOVAR, SnpEff.

4. Wie kann die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Long Amplicon Analyse sichergestellt werden?

Mehrere methodische Protokolle können implementiert werden, um Genauigkeit und Zuverlässigkeit zu stärken, wie zum Beispiel:

• DNA-Extraktion und -Reinigung: Die Verwendung von ausgeklügelten Kits in Verbindung mit einer sorgfältigen Durchführung der Verfahren kann eine hochwertige DNA-Extraktion und -Reinigung ermöglichen.
• Optimierung der PCR-Bedingungen: Das Feintuning spezifischer Bedingungen im Polymerase-Kettenreaktionsprozess (PCR), wie z.B. der Annealing-Temperatur und der Verlängerungszeit, kann helfen, eine effiziente Segmentamplifikation zu gewährleisten.
• Hochfidelity-Polymerase-Nutzung: Die Anwendung von Hochfidelity-Polymerasen spielt eine wichtige Rolle bei der Minimierung von Amplifikationsabweichungen.
• Aufmerksame Qualitätskontrolle: Strenge Qualitätskontrollmaßnahmen sollten an kritischen Punkten während der Sequenzierung und der Datenanalysephasen beachtet werden.
• Experimentelle Validierung: Entscheidende Ergebnisse sollten experimentell validiert werden. Dies könnte Methoden wie umfassen Sanger-Sequenzierung oder quantitative PCR (qPCR).

Definition von Referenzallelen für Blutgruppengene durch Langzeit-Sequenzierung: Machbarkeitsnachweis in der ACKR1 Gen, der die Duffy-Antigene kodiert

Journal: Transfusionsmedizin und Hämostaseologie
Impactfaktor: 2,283
Veröffentlicht: 11. Dezember 2019

Hintergrund

Im aufstrebenden Bereich der Blutgruppengenomik stellen die Definition und Neudefinition von Referenzgenen oder Allelsequenzen für verschiedene Blutgruppengene bedeutende Ziele dar, sowohl für diagnostische Anwendungen als auch für wissenschaftliche Erkundungen. Angesichts des Aufkommens innovativer, leistungsstarker Sequenzierungstechnologien haben wir uns bemüht, die Variabilität der drei prominentesten Allele von ACKR1 - das Gen, das klinisch kritische Duffy-Antigene kodiert - auf Haplotyp-Ebene, unter Verwendung eines Langzeit-Sequenzierung Methodologie.

Methoden

Ergebnisse

Die Autoren erhielten hochwertige Sequenzierungsdaten für die 162 Allele (Genauigkeit >0,999). Insgesamt wurden zweiundzwanzig Nukleotidvariationen identifiziert, die in renommierten Datenbanken verzeichnet sind. Diese Variationen definierten 19 Haplotypen: bestehend aus vier in 46. ACKR1*01acht in 63 ACKR1*02und sieben in 53 ACKR1*02N.01 Allele jeweils.

Abb. 1. Langstrecken-PCR (LR-PCR) Amplifikation des gesamten ACKR1 Genlocus.

Tabelle 1. ACKR1 Varianten und Haplotypen, die durch Langzeit-Sequenzierung identifiziert wurden

Fazit

Entsprechend wurde ein Kader spezifischer Referenzallele etabliert, der die Sequenzierungstechnologie der dritten Generation nutzt und eine umfassende longitudinale Untersuchung von Genloci über mehrere tausend Basenpaare hinweg ermöglicht. Diese neuartige Technik ergänzt die Sequenzierungstechniken der zweiten Generation oder Kurzlesetechniken und erweist sich als entscheidend für die Entschlüsselung neuartiger, seltener und null Allele.

Referenz:

1. Fichou, Y., Fichou, Y., Berlivet, I., Richard, G., u. a.Definition von Referenzallelen für Blutgruppengene durch Langsequenzierung: Machbarkeitsnachweis in der ACKR1 Gen, der die Duffy-Antigene kodiert. Transfusionsmedizin und Hämatotherapie, 2020, 47(1): 23-32.