Dual-RNA-Seq

Dual-RNA-Seq hat sich als Möglichkeit erwiesen, alle Klassen von kodierenden und nicht-kodierenden Transkripten sowohl des Wirts als auch des Erregers gleichzeitig zu überwachen. CD Genomics bietet einen hochauflösenden, erschwinglichen und unkomplizierten Dual-RNA-Seq-Service an, um direkte Einblicke in das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger zu ermöglichen.

Was ist Dual-RNA-Seq?

Es gibt eine Vielzahl von Interaktionen zwischen Arten, wie Parasitismus, Symbiose, Konkurrenz usw. Die konventionelle Transkriptom-Sequenzierung kann nur die Informationen einer einzelnen Art untersuchen, was nicht nur einen Teil der Daten verschwendet, sondern auch das Probenmaterial selbst während der Trennung von zwei Arten beeinträchtigt.

Die Sequenzierungstechnologie Dual RNA-seq wurde genau entwickelt, um solche Anfragen zu beantworten. Durch den Aufbau nur einer Transkriptom-Bibliothek ermöglicht Dual RNA-seq von total gemischter RNA nach doppelter rRNA-Depletion oder Poly(A)-Capture die Sequenzierung und Analyse von zwei (oder mehr) Arten zur gleichen Zeit, ohne die Arten trennen zu müssen, wodurch die dynamischen Veränderungen der Genexpression zwischen ihnen offengelegt werden. Gleichzeitig dient das Interaktionsmodell-Diagramm dazu, die regulatorischen Beziehungen von Genen und den Interaktionsmechanismus zwischen zwei Arten zu erfassen; um das Regulierungsnetzwerk im Interaktionsprozess, den Mechanismus der Pathogeninfektion und die Wirtsresistenz gegen Krankheiten zu untersuchen; und um die evolutionäre Beziehung von Pathogenen zwischen verschiedenen Arten zu erforschen und weiter die positive Selektion verwandter Gene basierend auf homologen Genen zu untersuchen.

CD Genomics kann mit verschiedenen Invasionsmodellen umgehen – Pathogene wie Bakterien, Pilze, Protozoen usw., der Wirt kann ein Säugetier oder eine Pflanze sein. Wir streben an, umfassende Dual-RNA-Seq-Dienstleistungen von der experimentellen Planung bis zur biokomputationalen Analyse anzubieten, um Ihre Forschungsbedürfnisse zu unterstützen.

Vorteile unseres Dual RNA-seq-Services

• Verfügbar für verschiedene Invasionsmodelle
• Flexibilität des Proben Typs: total gemischte RNA, infizierte Wirtszellen usw.
• Die Technologie der molekularen Barcodes ermöglicht kleine Mengen an Eingangs-Templates.
• Umfassende Analyse, hohe Stabilität: Nutzung der fortschrittlichen Illumina-Plattform-Sequenzierung in Kombination mit Hochleistungsrechnen (HPC), um eine schnelle und stabile Analyse und Bereitstellung von Sequenzierungsdaten zu erreichen.
• Strenge Qualitätskontrolle, vielfältige Analysepipelines: Implementierung strenger Qualitätskontrollmaßnahmen und Angebot vielfältiger Analysepipelines. Nicht nur Bereitstellung von Transkriptomanalysen für Arten, sondern auch Konfiguration fortgeschrittener Analysen wie Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), Annotation von Virulenzfaktoren, Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken usw., um die interspezifischen Beziehungsinformationen tiefgehend zu erkunden.
• Wissenschaftliches und sorgfältiges Design: Von der Probenauswahl über die Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung bis hin zur Datenanalyse durchläuft jeder Schritt ein wissenschaftliches und sorgfältiges Design, um qualitativ hochwertige Forschungsergebnisse zu gewährleisten.

Anwendungen von Dual-RNA-Seq

• Pflanzenkrankheiten und Mechanismen der Resistenz-Anfälligkeit.
• Physiologische Anpassung und molekulare Reaktionen.
• Pathogene und Wirtsimmunität.
• Interspezies-Symbiose und evolutionäre Mechanismen.
• Parasitismus in Schädlingen und Wirtabwehr.
• Ko-Kultivierung von Bakterien/Fungi.
• Forschung zu Infektionskrankheiten.
• Vergleichende Genomik und pathogenetische Mechanismen.

Workflow von Dual-RNA-Seq

Bei der Vorbereitung Ihrer Probe bietet CD Genomics eine umfassende Palette von Sequenzierungs- und bioinformatischen Analyse-Dienstleistungen an.

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen: Gesamt-RNA ≥ 1 μg, Konzentration ≥ 10 ng/µL, OD260/280 = 1,8-2,0 Zellen ≥ 5×106 Gewebe ≥ 500 mg, Mindestmenge: 100 mg
	Sequenzierung: Illumina-Plattform PE150 Sequenzierung 12-24 GB
	Datenanalyse Transkriptomanalyse Gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) Virulenzfaktor-Annotierung Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken ….und mehr

Analyse-Pipeline

Generische Pipeline zur Analyse von Dual-RNA-seq-Daten (Abbildung von V. Arluison et al., 2018)

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details im Dual-RNA-Seq für Ihr Schreiben (Anpassung)

Dual-RNA-Sequenzierung (Dual RNA-seq) ist eine hochmoderne Sequenzierungstechnik, die entwickelt wurde, um solche Herausforderungen zu bewältigen. CD Genomics, spezialisiert auf die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen, nutzt eine fortschrittliche Analyse von Dual-RNA-seq-Daten, um wissenschaftliche Fortschritte in diesem Bereich voranzutreiben. Unsere maßgeschneiderten Lösungen, unsere Bioinformatik-Expertise und unser unerschütterliches Engagement für Qualität gewährleisten, dass Forscher genaue, zuverlässige und bedeutungsvolle Einblicke in die komplexe Welt der Wirt-Pathogen-Interaktionen gewinnen. Für weitere Informationen über unsere Dienstleistungen laden wir Sie ein, mit uns in Kontakt zu treten.

Referenzen:

1. Alexander J. Westermann et al., Dual-RNA-Seq enthüllt die Funktionen von nicht-kodierenden RNAs in Wirt-Pathogen-Interaktionen. Natur2016, Bd. 000.
2. Alexander J. Westermann et al., Auflösung von Wirt-Pathogen-Interaktionen durch duales RNA-Sequencing. PLoS Pathog2017, 13(2).
3. Véronique Arluison und Claudio Valverde (Hrsg.), Bakterielle regulatorische RNA: Methoden und Protokolle. Methoden in der Molekularbiologie2018, Bd. 1737.
4. Pisu et al., Dual-RNA-Sequenzierung von Mtb-infizierten Makrophagen in vivo zeigt ontologisch unterschiedliche Wirt-Pathogen-Interaktionen. Cell Reports2020, Bd. 30.
5. Nuss A M, Beckstette M, Pimenova M, et al. Die Gewebe-Dual-RNA-Sequenzierung ermöglicht eine schnelle Entdeckung von infektionsspezifischen Funktionen und Riboregulatoren, die die Transkriptome von Wirt und Pathogen formen. Sitzungsberichte der Nationalen Akademie der Wissenschaften, 2017, 114(5): E791-E800.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Sequenzierungsqualitätsverteilung

A/T/G/C-Verteilung

IGV-Browser-Oberfläche

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA-Score-Diagramm

Venn-Diagramm

Volcano-Diagramm

Statistik Ergebnisse der GO-Anmerkung

KEGG-Klassifikation

1. Sind Referenzgenome für alle Arten erforderlich, die Dual-RNA-Seq durchlaufen?

Idealerweise würde die Verfügbarkeit von Referenzgenomen für beide interagierenden Arten genauere Ergebnisse ermöglichen. Die Literatur dokumentiert jedoch auch Verfahren, bei denen nur eine einzige Art über ein Referenzgenom verfügt. Der Analyseworkflow in solchen Fällen besteht zunächst darin, die Sequenzierungsdaten auf die Art mit einem Referenzgenom abzubilden. Die transkriptomischen Daten, nach Ausschluss der Abbildungsdaten, können für die Informationen der anderen Art durch Abbildung mit einem nahen Verwandten oder durch eine de-novo-Assemblierung untersucht werden, was nachfolgende Analysen erleichtert. Insbesondere für den prokaryotischen Abschnitt in einer interagierenden Probe ist das Vorhandensein eines Referenzgenoms unerlässlich. In dessen Abwesenheit kann jedoch eine bakterielle 'Pan-Genom'-Profilierung durchgeführt werden.

2. Was sind die Vorteile von interagierenden Transkriptomen im Vergleich zu gewöhnlichen Transkriptomen?

Dual-RNA-Seq ist eine spezialisierte Sequenzierungstechnik, die entwickelt wurde, um Interaktionen zwischen Arten zu untersuchen, die im Allgemeinen symbiotische, parasitäre, wettbewerbliche und räuberische Beziehungen umfassen. Traditionelle Transkriptomik die Trennung dieser interagierenden Arten erforderlich macht, ein Ansatz, der zwar nützlich ist, aber zu einem Verlust relevanter Informationen führen und potenzielle Artefakte im Zusammenhang mit dem Trennungsprozess einführen kann. Im krassen Gegensatz dazu steht der duale RNA-seq-Ansatz, der gleichzeitige Untersuchungen von zwei oder mehreren interagierenden Arten ermöglicht, ohne dass eine Trennung erforderlich ist. Dadurch wird der mögliche schädliche Einfluss vermieden, der durch die Trennung der Arten entstehen könnte. Darüber hinaus ist diese Methodik kosteneffektiv, da nur eine Transkriptom-Bibliothek erstellt werden muss, die eine gleichzeitige Analyse aller einbezogenen Arten ermöglicht.

3. Welche verschiedenen Arten von RNA-Sequenzierung gibt es?

Darüber hinaus kann RNA-Seq, abhängig von den Forschungszielen und den Besonderheiten der Probe, in mehrere Typen unterteilt werden, wie zum Beispiel: Gesamt-RNA-seq, mRNA-Seq, miRNA-seq, Lange nicht-kodierende RNA-seq, Vollständige Transkriptom-Sequenzierung, Zirkuläre RNA-Sequenzierungund Ganz Exom RNA-Seq.

Dual-RNA-Seq enthüllt die metabolische Abhängigkeit von Aminosäuren des intrazellulären Bakteriums Piscirickettsia salmonis, das Atlantischen Lachs infiziert.

Zeitschrift: Frontiers in Mikrobiologie
Impact-Faktor: 6,064
Veröffentlicht: 27. November 2018

Zusammenfassung

Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien, die in der transkriptomischen Forschung angewendet werdenRNA-Seq), haben die Möglichkeit eröffnet, komplexe molekulare Reaktionen in verschiedenen biologischen Kontexten zu verstehen. Kürzlich hat sich das synchrone Sequenzieren der Transkriptome eines Pathogens und des Wirts während einer Infektion - bekannt als dual RNA-seq - als vielversprechende Methode herausgestellt, um die Feinheiten der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu enthüllen. In dieser speziellen Studie analysierten die Forscher durch duale rRNA-Depletion und RNA-Sequenzierungsansatz gleichzeitig die Transkriptome des intrazellulären Bakteriums. Piscirickettsia bei Lachsen und ihren W Wirtsarten, Atlantischer Lachswährend des Verlaufs der Infektion.

Methoden

Ergebnisse

Erforschung des Transkriptoms von Wirt und Pathogen während der Pathogenese

Die Dual-RNA-Seq-Analyse delineierte die Regulation der Transkriptome von P. salmonis und S. salar im Verlauf der Infektion. Bezüglich des Transkriptoms von S. salar wurden im Milzgewebe 771 und 829 Gene bei 7 und 14 dpi unterschiedlich exprimiert (Abb. 1B). Gleichzeitig wurden an denselben Zeitpunkten im Kopfniere 412 und 467 Gene unterschiedlich reguliert. Speziell im Kopfniere modulierte Gene umfassten solche, die für MATE-Effluxfamilienproteine, das DNA-Reparaturprotein RecN, das Chaperonprotein HtpG und verschiedene Membranproteine kodieren (Abb. 2). Unter den gemeinsamen Genen wurden unterschiedliche Proteinphosphatasen 1, ribosomale Proteine, molekulare Chaperone und Asn/Gln-Transamidosom-Untereinheiten identifiziert (Abb. 2).

ABBILDUNG 1. (A) Globale Transkriptomanalyse von Piscirickettsia salmonis (blau) und S. salar (rot) bei 3, 7 und 14 Tagen nach der Infektion (dpi) in Milz- und Kopfniere-Geweben. Die Expressionswerte wurden als Transkripte pro Million Reads (TPM) geschätzt und für die Heatmap-Klusterung Log2-transformiert. (B) Differenziell exprimierte Gene in Milz und Kopfniere bei 7 und 14 dpi unter Verwendung der Expressionswerte bei 3 dpi als Kontrolle. Drei Tage nach der Infektion wurden als Basislinie für die Genexpression verwendet, da in keiner Art von Kontrollgruppe bakterielle Reads vorhanden wären.

ABBILDUNG 2. Venn-Diagramm, das die Anzahl der exklusiven und gemeinsamen Gene im Transkriptom von zeigt P. salmonis während der Infektion in der Milz (blau) und den Kopfniere (rot) Geweben von Atlantischem Lachs. Die Heatmaps zeigen eine Teilmenge von exklusiven und gemeinsamen Genen, die exprimiert werden von P. salmonis in beiden Geweben.

Aminosäurestoffwechsel: Eine gemeinsame Reaktion zwischen P. salmonis und S. salar

Die GO-Anreicherungsanalyse zeigte, dass ein großer Anteil der differentiell exprimierten Gene in P. salmonis waren mit den Stoffwechselprozessen von Proteinen und Stickstoffverbindungen assoziiert. Eine Anreicherung von Genen, die mit dem Proteinmetabolismus in Verbindung stehen, wurde ebenfalls durch KEGG-Annotation entdeckt. Allerdings, obwohl der Aminosäuremetabolismus nicht die Hauptantwort auf transkriptomischer Ebene innerhalb des Wirts war, sowohl P. salmonis und S. salar zahlreiche Gene nachgewiesen, die mit der biologischen Synthese und dem Abbau von Aminosäuren verbunden sind.

ABBILDUNG 3. Genontologie-Anmerkung (A) und KEGG-Pfad-Anmerkung (B) der unterschiedlich exprimierten Gene in Lachs und P. salmonis während der Infektion.

Fazit

Über die standardmäßigen Immunantworten des Wirts und die Virulenzfaktoren von Krankheitserregern hinaus zeigen sowohl Bakterien als auch der Wirt eine Fülle von Genen, die mit Stoffwechselprozessen verbunden sind, insbesondere solchen, die mit dem Aminosäurestoffwechsel in Zusammenhang stehen. Unsere Ergebnisse deuten auf eine Abhängigkeit von P. salmonis über den Aminosäurestoffwechsel von S. salar, was auf einen neuartigen Pathogenese-Mechanismus hindeuten könnte, der auf der Fähigkeit basiert, Nährstoffe vom Wirt aufzunehmen. Im weitesten Sinne ermöglicht die duale Transkriptom-Sequenzierung eine vielfältige Perspektive auf die Interaktion zwischen Wirt und Pathogen, die über die biologischen Prozesse hinausgeht, die mit der Immunität verbunden sind.

Referenz:

1. Valenzuela-Miranda D, Gallardo-Escárate C. Dual-RNA-Seq enthüllt die metabolische Abhängigkeit von Aminosäuren des intrazellulären Bakteriums Piscirickettsia salmonis, das Atlantischen Lachs infiziert. Grenzen der Mikrobiologie, 2018, 9: 418416.