Richtlinien zur Einreichung von Proben
Warum PacBio HiFi — Genauigkeit, die kurze Reads und andere lange Reads nicht erreichen können
Wenn Sie mit Illumina-Daten arbeiten, kennen Sie den Kompromiss: hohe Genauigkeit pro Base, aber die Reads sind zu kurz, um Wiederholungen zu erfassen oder Isoformen zu unterscheiden. Wenn Sie mit Nanoporen-Sequenzierung experimentiert haben, haben Sie an Länge gewonnen – aber auf Kosten der Rohgenauigkeit. PacBio HiFi ist die einzige Plattform, die diesen Kompromiss beseitigt.
Was passiert in einem ZMW?
PacBio Einzelmolekül, Echtzeit (SMRT) Sequenzierung findet in Zero-Mode Wellenleitern statt - nanoskaligen Beobachtungskammern, in denen eine einzelne DNA-Polymerase fluoreszierende Nukleotide nacheinander einfügt. Im Gegensatz zur Nanoporen-Sequenzierung (die Basen aus ionischem Strom ableitet) oder Illumina (die Reads aus Clustern identischer Fragmente erstellt), beobachtet SMRT ein einzelnes Molekül in Echtzeit.
Der HiFi-Unterschied: SMRTbell-Adapter zirkularisieren jedes DNA-Molekül. Die Polymerase liest dann mehrfach um den Kreis. Diese mehrfachen Durchgänge werden zu einem HiFi-Konsenslese kombiniert – wodurch Sie sowohl die Länge eines langen Lesens als auch die Genauigkeit mehrerer unabhängiger Beobachtungen erhalten.
PacBio SMRTbell → ZMW → zirkuläre Konsens → HiFi-Lesung mit QV ≥30
Drei Funktionen, die Sie von einem SMRT-Cell erhalten.
- QV ≥30 lange Reads (~15–20 kb) — ausreichend genau für Variantenaufrufe, lang genug für Assemblierung und Phasierung.
- Simultane 5mC Methylierung — Polymerase-Kinetik zeigt modifizierte Basen während desselben Laufs. Kein Bisulfit. Keine separate Bibliothek.
- Vollständige Isoformen ohne Zusammenbau — Iso-Seq/Kinnex erfasst jedes Transkript vom Transkriptionsstartpunkt bis zum polyA-Schwanz als einen einzelnen Lesevorgang. Die Isoform wird gemessen, nicht rekonstruiert.
Wo HiFi die Alternativen übertrifft
- vs Illumina Kurzlesungen: Spans Wiederholungen, SVs und vollständige Isoformen. Stellt vollständige Genome anstelle von fragmentierten Contigs zusammen.
- vs Nanopore-LangleseEinzelmolekül-QV ≥30 Genauigkeit ohne Nachbearbeitung. Methylierungserkennung integriert, nicht nachgerüstet.
- vs mehrere Experimente durchführenEine SMRT-Zelle liefert Ihnen Varianten + Methylierung + Isoformen. Keine parallelen Arbeitsabläufe zu koordinieren.
Unsere PacBio SMRT-Sequenzierungsdienste
Jeder der unten aufgeführten Dienste läuft auf derselben HiFi-Plattform – gleiche Genauigkeit, gleiche Methylierungsfähigkeit, gleiche Datenqualität.
Whole Genome de novo Sequenzierung
Referenzfreie Genomassemblierung für mikrobielle, pflanzliche, tierische und menschliche Genome. HiFi-Lesungen überbrücken Wiederholungen und liefern zusammenhängende Assemblierungen mit einer BUSCO-Vollständigkeit von über 90 %.
Am besten für: Neuartige Organismen-Sequenzierung, Pan-Genom-Projekte, T2T-Finishing.
HiFi-basierte menschliche WGS zur umfassenden Variantenerkennung — SNVs, Indels, SVs und phasierte Haplotypen aus einem Datensatz.
Am besten für: Seltene Erkrankung, SV-Entdeckung, Pharmakogenomik, Bevölkerungsstudien.
Pflanzen-/Tier-Ganzgenom de novo
Multi-Plattform-Assemblierungen (HiFi + Hi-C + RNA-seq) für komplexe Genome, einschließlich Polyploide und große repetitive Genome.
Am besten für: Große Genome, polyploide Arten, Agrar-Genomik, Evolutionsbiologie.
Telomer-zu-Telomer (T2T) Sequenzierung
Lückenfreie Chromosomen-große Assemblierungen mit HiFi- und ultra-langen ONT-Reads. Erfasst Zentromere, Telomere und segmentale Duplikationen.
Am besten für: Referenzgenome, Zentromerbiologie, vollständige Assemblierungsverfeinerung.
Vollständige Transkript-Sequenzierung (Iso-Seq / Kinnex)
Vollständige Isoform-Kataloge von TSS bis polyA. Auflösung von Spleißvarianten, Fusionsgenen und APA – ohne Mehrdeutigkeit bei der Kurzleseassemblierung.
Am besten geeignet für: Isoform-Entdeckung, alternatives Spleißen, Fusionsdetektion, Transkriptannotation.
Vollständige 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung
Artenebene taxonomische Auflösung mit Voll-Längen rRNA-Gen-Ampliconen. Genau bis zur Stamm-Ebene, während kurze Ampliconen bei der Gattung enden.
Am besten geeignet für: Mikrobielle Ökologie, Umweltproben, Stammidentifikation.
Langzeit-Metagenom-Sequenzierung
HiFi-Metagenomik zur MAG-Wiedergewinnung, funktionalen Annotation und Profilierung von Gemeinschaften auf Stamm-Ebene. PacBio- oder Nanopore-Methoden verfügbar.
Am besten geeignet für: Komplexe Gemeinschaften, MAG-Binning, Entdeckung funktioneller Gene.
CiFi-Sequenzierung | Fertige Bibliothekssequenzierung | Lange Amplicon-Analyse (LAA)
Spezialisierte Arbeitsabläufe: CiFi für phasierte Variantenanalyse, Vorgefertigte Bibliothek für vom Kunden vorbereitete SMRTbell-Bibliotheken, LAA für gezielte Haplotypauflösung.
Wo PacBio HiFi den größten Mehrwert bietet
Nachfolgend sind die Forschungsbereiche aufgeführt, in denen HiFi-Langlese Probleme lösen, die mit Kurzlesungen oder weniger genauen Langlesungen nicht gelöst werden können. Jede Anwendung entspricht dem richtigen PacBio-Service.
De novo Genomassemblierung und -veredelung
Span-Wiederholungen und komplexe Regionen zur Erzeugung vollständiger, zusammenhängender Assemblies. Kombinieren Sie HiFi mit Hi-C für chromosomale Skafolds.
Empfohlene Dienstleistungen: De novo WGS, T2T-Sequenzierung, Pflanzen-/Tiere-WGS.
Erkennung von strukturellen Varianten und Umstellungen
Identifizieren Sie große Insertionen, Deletionen, Inversionen und Translokationen mit Auflösung auf Breakpoint-Ebene.
Empfohlene Dienstleistungen: Menschliche WGS, De-novo-WGS.
Haplotyp-Phasierung und allelspezifische Analyse
Lange HiFi-Lesungen bewahren die Verknüpfung über entfernte Varianten hinweg – erzeugen haplotypenaufgelöste Assemblierungen und Variantenaufrufe.
Empfohlene Dienstleistungen: Menschliches WGS, CiFi-Sequenzierung, LAA.
Vollständige Transkriptomik (Isoformen & Fusionen)
Erfassen Sie vollständige Isoformen-Kataloge vom TSS bis zum polyA-Schwanz – ohne rechnerische Zusammenstellungsraten.
Empfohlene Dienstleistungen: Iso-Seq/Kinnex Voll-Längen-Transkript-Sequenzierung.
DNA-Methylierung (5mC) — gleichzeitig mit der Sequenzierung
Genomweite 5mC-Profile aus SMRT-Kinetik — keine Bisulfid-Konversion. Ein Lauf = Varianten + Methylierung.
Empfohlene Dienstleistungen: Jeder WGS-Dienst (Methylierung extrahiert aus Standard-HiFi-Daten).
Mikrobiom & Metagenomik
Vollständige 16S/18S/ITS für die Taxonomie auf Artenebene. HiFi-Metagenomik für die MAG-Wiederherstellung und funktionale Profilierung.
Empfohlene Dienstleistungen: Vollständige Amplicon, Langzeit-Metagenomik.
Gezielte Sequenzierung und Validierung
Tiefgehende Abdeckung spezifischer Loci für die Phasierung von Varianten, Analyse von Wiederholungsdehnungen und allelspezifische Charakterisierung.
Empfohlene Dienstleistungen: LAA, CiFi-Sequenzierung, Fertigbibliothek.
Pan-Genom & Populationsgenomik
Erstellen Sie umfassende Pan-Genom-Referenzen mit HiFi-Assemblierungen, die strukturelle Varianten (SVs) über Populationen hinweg erfassen.
Empfohlene Dienstleistungen: De novo WGS, T2T-Sequenzierung, Pflanzen-/Tier-WGS.
Was Sie erhalten werden — Daten, die für die Veröffentlichung erstellt wurden
Jedes Projekt wird mit den Rohdaten, verarbeiteten Ergebnissen und der Dokumentation geliefert, die Sie benötigen, um direkt zur Analyse und direkt in Ihr Manuskript überzugehen.
| Datenkategorie | Was Sie erhalten | Warum es wichtig ist |
|---|---|---|
| HiFi-Lektüre | FASTQ/BAM, QV ≥30, per-Read-QC-Tags | Bereit für die Montage, Ausrichtung oder Variantenaufruf – kein Polierschritt erforderlich. |
| Subreads (BAM) | Rohe Polymerase-Lesungen mit kinetischen Informationen | Ermöglicht die Methylierungs-Neuanalyse und die Anpassung benutzerdefinierter CCS-Parameter. |
| QC-Bericht | Ertrag, Lese-Länge N50, Q-Score-Verteilung, CCS-Durchläufe, Barcode-Balance | Transparente Nachweise, dass Ihr Lauf die vereinbarten Ziele erreicht hat. |
| Versammlung | FASTA/GFA, N50/NG50, BUSCO Vollständigkeit | Veröffentlichungsbereites Genom mit Statistiken, die Gutachter erwarten |
| Varianten | VCF mit SNV/Indel/SV, phasiert wo anwendbar | Phasierte Varianten aus langen Reads — keine statistische Imputation erforderlich |
| Methylierung | bedMethyl/TSV, DMR-Zusammenfassungen, genomweite Tracks | 5mC-Anrufe aus demselben Lauf wie Ihre Varianten – keine zusätzliche Vorbereitung erforderlich. |
| Isoformen | GTF/GFF3 Isoformen-Katalog, Ausdruckstabellen, Fusionsliste | Vollständige Isoformen-Modelle, die durch vollständige Lesevorgänge unterstützt werden |
| Projektmemo | Protokoll, Kit/Chemie-Details, Softwareversionen, Laufparameter | Alles, was ein Gutachter benötigt, um Ihren Methodenteil zu bewerten. |
Wie Ihr Projekt abläuft — Der PacBio SMRT-Workflow
- Probenaufnahme & QualitätskontrolleQubit + Spektrophotometrie. gDNA: A260/280 1,8–2,0, ≥30 kb modale Länge. RNA: RIN ≥8 für Iso-Seq.
- SMRTbell BibliotheksvorbereitungAdapter-Ligation, Größenselektion je nach Anwendung. Kinnex-Verkettung für multiplexes Iso-Seq. Barcodierte Adapter für die Proben-Poolung.
- SMRT-ZellsequenzierungSequel II/IIe oder Revio Systeme. Laufzeiten von 10–30 Stunden, abhängig von der Zielausbeute und dem Typ der SMRT-Zelle (8M oder 25M).
- CCS → HiFi-GenerationSubreads aus jedem ZMW werden durch den CCS-Algorithmus verarbeitet. HiFi-Lesungen erfordern ≥3 vollständige Durchläufe und erfüllen den QV ≥30 Schwellenwert.
- Analyse & Qualitätssicherung: Assembly, Variantenaufruf, Methylierungsnachweis oder Isoformanalyse gemäß Ihrem gewählten Service. Nachanalyse-QC mit Mapping-Rate und Abdeckungsmetriken.
- LieferungStrukturierte Datenordner, vollständiges Projektmemo, QC-Bericht und optionale Ergebnisschulung mit unserem Bioinformatik-Team.
Beispielanforderungen
| Dienstleistung | Menge & Integrität | Reinheit | Versand | Notizen |
|---|---|---|---|---|
| WGS (Mikrobiell) | ≥1 μg gDNA, ≥30 kb | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | — |
| WGS (Pflanze/Tier) | ≥3–5 μg HMW gDNA, ≥30 kb | A260/280 1,8–2,0; A260/230 ≥2,0 | −20 °C | Breite Spitzen, kein Wirbeln |
| WGS (Mensch) | ≥1–3 μg gDNA, ≥30 kb | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | — |
| T2T-Genom | ≥3–5 μg HMW gDNA, ≥50 kb | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | Minimiere alle Scherungen. |
| Iso-Seq / Kinnex | ≥500 ng–1 μg Gesamt-RNA, RIN ≥8 | A260/280 ~2,0; A260/230 ≥2,0 | −80 °C (Trockeneis) | DNase falls erforderlich |
| 16S/18S/ITS Amplicon | ≥50–200 ng gepoolte Amplicons | Keine Primer-Dimere | 4 °C | Bitte geben Sie grundlegende Informationen an. |
| Metagenomik | ≥500 ng–1 μg gDNA | A260/280 1,8–2,0 | −20 °C | Hinweis zur Erschöpfung von Hosts |
| CiFi / LAA | ≥1–2 μg HMW gDNA / ≥100 ng Amplicons | Pro Anwendung | −20 °C / 4 °C | Zielregionen bereitstellen |
| Fertige Bibliothek | ≥50 ng SMRTbell-Bibliothek | QC-Bericht erforderlich | −20 °C | Wir führen bei Ankunft eine Qualitätskontrolle durch. |
- AllgemeinVermeiden Sie Phenol, Heparin, EDTA, Polysaccharide. Minimieren Sie das Einfrieren und Auftauen. Kontaktieren Sie uns für FFPE- oder Niedrig-Eingangsproben.
Bioinformatik — Von HiFi-Lesungen zu biologischen Erkenntnissen
Jedes Projekt umfasst standardmäßige Bioinformatik. Fortgeschrittene Analysen sind auf Ihre spezifische Forschungsfrage zugeschnitten.
- CCS und DemultiplexingSubread → HiFi-Generierung mit QV-Filterung. Per-Sample-Demux mit Barcode-QC.
- De Novo ZusammenstellungHifiasm oder Hicanu für Contig-Level-Assemblierungen. BUSCO-Vollständigkeitsbewertung. Optionale Hi-C-Scaffolding für Chromosomen-große Assemblierungen.
- VariantenaufrufDeepVariant / pbsv für SNV/indel/SV. Whatshap-basierte Phasierung mit HiFi-Reads für haplotypaufgelöste VCFs.
- 5mC Methylierungpb-CpG-Tools für die per-site 5mC-Bestimmung. DMR-Erkennung. Motiv-spezifische Methylierungsanalyse. Genomweite Tracks.
- Isoform-AnalyseIso-Seq-Pipeline zur Entdeckung von Isoformen, Quantifizierung, Fusionsdetektion und alternativer Polyadenylierung.
- MetagenomikTaxonomische Klassifikation, MAG-Binning, funktionale Annotation (KEGG, COG, CAZy).
Qualität & Studiengestaltung
- Replikate≥2 biologische Replikate pro Bedingung. Spike-in-Standards verfügbar zur Quantifizierung.
- Abdeckung30–60× HiFi für de novo Assemblierung. Benutzerdefinierte Abdeckungsmodellierung für Variantenerkennung und Iso-Seq basierend auf Ihren Zielen.
- QC-ToreHiFi-Ausbeute, Polymerase-Lese-N50, CCS-Passanzahl und On-Target-Anteil – alles wurde vor Beginn Ihres Laufs vereinbart.
- DNA-QualitätHMW gDNA ≥30 kb modale Länge. Wir überprüfen die Integrität vor der Bibliotheksvorbereitung und informieren Sie, wenn der Eingangswert unter den Schwellenwert fällt.
PacBio HiFi vs Nanopore vs Illumina
Die richtige Plattform für Ihr Projekt auswählen? So vergleichen sie sich in den Dimensionen, die für Forschungsergebnisse wichtig sind.
| Was zählt | PacBio HiFi | Nanopore (ONT) | Illumina |
|---|---|---|---|
| Lesegenauigkeit (Einzelmolekül) | QV ≥30 (≥99,9%) | Verbesserung; tiefenabhängig | ≥99,9% |
| Leseumfang | ~15–20 kb HiFi; Subreads länger | Bis zur Mb-Klasse | 2×300 bp max |
| Methylierungsnachweis | 5mC aus der Kinetik — derselbe Lauf, kein Bisulfit | 5mC/6mA aus Signal; Direkte RNA | Nicht muttersprachlich |
| Isoformauflösung | Vollständige Lesevorgänge, keine Montage erforderlich | Vollständig, aber niedrigere Basisgenauigkeit | Assemblierungsabhängig (fragmentiert) |
| Bester Anwendungsfall | Assemblies + Varianten + Methylierung aus einem Datensatz | Ultralangspanne; zeitkritische oder Feldarbeit | Tiefe SNV/Indel-Kohorten |
Schnelle Entscheidungsanleitung
- Benötige höchste Genauigkeit bei Langtexten. für Baugruppen und Varianten: wählen PacBio HiFi.
- Brauche die längsten Moleküle. (Telomere, massive Wiederholungen): hinzufügen Nanopore Ultra-Lang.
- Benötige Methylierung + Varianten aus einem Experiment.: PacBio HiFi — kein Bisulfid, keine zusätzliche Vorbereitung.
- Große SNV/Indel-Kohorten: Illumina für Tiefe; HiFi für SVs und Phasierung hinzufügen.
- Hybride DesignsHiFi + Short-Read oder HiFi + ONT balanciert Genauigkeit, Vollständigkeit und Kosten.
Die tatsächliche Leistung hängt von der Probenqualität, der Bibliotheksvorbereitung, der Sequenzierungstiefe und der Analysepipeline ab.
Warum CD Genomics für PacBio SMRT-Sequenzierung?
Sie haben die Wahl zwischen verschiedenen PacBio-Dienstleistern. Hier ist, was wir anders machen.
- Ein Lauf, mehr DatenUnsere HiFi-Workflows sind darauf ausgelegt, das Maximum aus jeder SMRT-Zelle herauszuholen — Varianten, Methylierung und Assemblierungsmetriken aus einem einzigen Experiment.
- QC, den Sie veröffentlichen können.Jedes Projekt beinhaltet einen detaillierten QC-Bericht mit Metriken, die die Prüfer erwarten. Keine Black Boxes.
- Analyse, die zu Ihrer Frage passtWir passen die Bioinformatik an Ihre Forschungsziele an – keine Einheitslösung für alle.
- Plattformübergreifende AnleitungWenn HiFi allein nicht optimal ist, werden wir es Ihnen sagen – und einen hybriden Entwurf vorschlagen, der Ihnen Geld und Zeit spart.
- SOP-gesteuert, nicht ad-hocJeder Schritt — Probenentnahme, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung, CCS, Analyse — folgt einem dokumentierten SOP mit definierten Akzeptanzkriterien.
- VeröffentlichungsunterstützungBenötigen Sie Unterstützung bei einem Methodenabschnitt, der Vorbereitung von Abbildungen oder der Beantwortung von Gutachterkommentaren? Wir haben das schon einmal gemacht.
- Keine InstrumentensperreWir betreiben PacBio Sequel II/IIe und Revio Systeme. Sie erhalten das passende SMRT Cell Format für die Größe Ihres Projekts – 8M oder 25M.
Demo-Ergebnisse
HiFi-Lese-Q-Score-Verteilung — Median-QV ≥30 über alle Durchgänge
HiFi-Leselängenverteilung — N50 typischerweise 15–20 kb pro SMRT-Zelle
De Novo Assembly-Metriken — Contig N50, Scaffold N50 und BUSCO-Vollständigkeit
PacBio SMRT-Sequenzierung FAQ
1. Was macht PacBio HiFi anders als andere Langzeit-Sequenzierung?
HiFi ist die einzige Long-Read-Technologie, die eine Genauigkeit von ≥30 bei der Einzelmolekül-QV liefert. Dies wird durch zirkuläre Konsenssequenzierung erreicht – jedes Molekül wird mehrfach gelesen und die Durchläufe werden kombiniert. Im Gegensatz dazu haben Nanoporen-Rohlesungen eine niedrigere Genauigkeit pro Base und erfordern typischerweise Konsens- oder Polier-Schritte. HiFi erkennt auch 5mC-Methylierung aus der Polymerase-Kinetik im selben Durchlauf, ohne dass zusätzliche Chemie erforderlich ist.
2. Wie vergleicht sich die HiFi-Genauigkeit mit der von Illumina?
HiFi-Lesungen entsprechen der Basisgenauigkeit von Illumina (≥99,9%) und sind dabei 50–100× länger. Das bedeutet, dass Sie SNVs mit der gleichen Zuversicht wie bei kurzen Lesungen aufrufen können – aber auch strukturelle Varianten erkennen, Haplotypen phasieren und Genome lückenlos assemblieren können. HiFi ist kein Kompromiss zwischen Genauigkeit und Länge; es bietet beides.
3. Kann ich Methylierung aus meinem PacBio-Lauf erkennen?
Ja – und Sie müssen nichts Zusätzliches tun. PacBio-Polymerasen verlangsamen sich an methylisierten Basen, was kinetische Signaturen erzeugt, die der Basenrufer als 5mC-Calls interpretiert. Diese Calls werden während der standardmäßigen CCS-Analyse erzeugt. Keine Bisulfit-Konversion, keine separate Bibliothek, kein paralleler Sequenzierungsdurchlauf. Sie erhalten Varianten und Methylierung aus einer SMRT-Zelle.
4. Was ist Iso-Seq und wann sollte ich es anstelle von Short-Read-RNA-Seq verwenden?
Iso-Seq (jetzt auch als Kinnex für höhere Durchsatzraten verfügbar) sequenziert vollständige cDNA-Moleküle vom Transkriptionsstartpunkt bis zum PolyA-Schwanz in Einzelreads. Verwenden Sie es, wenn Sie vollständige Isoformstrukturen identifizieren, Fusionstranskripte nachweisen oder die Nutzung von Isoformen quantifizieren müssen – Aufgaben, bei denen die Kurzlese-RNA-Seq Vermutungen über die Isoformzusammenstellung anstellt. Kinnex verknüpft mehrere Transkripte pro Read und erhöht den Durchsatz pro SMRT-Zelle um etwa das Fünffache.
5. Wie viel DNA benötige ich?
Standard WGS: ≥1–5 μg HMW gDNA bei ≥30 kb modaler Länge. T2T-Projekte: ≥3–5 μg bei ≥50 kb. Iso-Seq: ≥500 ng–1 μg Gesamt-RNA bei RIN ≥8. Geringere Eingaben sind möglicherweise möglich — kontaktieren Sie uns mit Ihren Probenbeschränkungen.
6. Wie lange dauert ein Projekt?
Die Projektzeitpläne hängen von der Bibliotheksvorbereitung, der Sequenzierungsanordnung und dem Umfang der Bioinformatik ab. Wir stellen während der Projektberatung einen detaillierten Zeitplan basierend auf Ihren spezifischen Anforderungen zur Verfügung.
7. Welche Instrumente verwenden Sie?
PacBio Sequel II/IIe und Revio Systeme, SMRT Cell 8M und 25M Formate. Alle Durchläufe werden von erfahrenen Technikern mit SOP-gesteuerten QC-Gates überwacht.
Kann ich meine eigenen SMRTbell-Bibliotheken senden?
Ja. Unser Pre-Made Library Sequencing-Service akzeptiert vom Kunden vorbereitete Bibliotheken. Wir führen eine Qualitätskontrolle bei Ankunft durch, laden sie auf das entsprechende SMRT Cell und liefern CCS-Daten sowie optionale Bioinformatik.
9. Wie unterscheidet sich das von den PacBio-Diensten, die ich anderswo erhalten kann?
Drei Unterschiede: (1) Wir optimieren jede SMRT-Zelle für mehrere Datentypen – Sie erhalten Varianten UND Methylierung UND Assemblierungsmetriken aus demselben Lauf. (2) Jedes Projekt enthält einen publikationsbereiten QC-Bericht mit Metriken, die Gutachter erwarten. (3) Wir bieten plattformübergreifende Beratung – wenn ein hybrides HiFi + ONT- oder HiFi + Illumina-Design Ihre Fragestellung besser beantworten würde, empfehlen wir es.
Fallstudie — Isoform-Auflösungsanalyse des nonsense-vermittelten mRNA-Abbaus
Veröffentlichte Forschung
Aufdeckung der Isoform-Auflösungs-Kinetiklandschaft des nonsense-vermittelten mRNA-Abbaus mit EZbakR
Methoden: PacBio Iso-Seq | Veröffentlicht: 2025 | PMC11952489
Hintergrund
Die Nonsense-vermittelte mRNA-Abbau (NMD) ist ein Qualitätskontrollweg, der mRNAs mit vorzeitigen Stopcodons eliminiert. Während die Zielmoleküle für den NMD auf Bulk-Ebene bekannt sind, sind die Dynamiken des NMD auf Isoform-Ebene — welche spezifischen Splice-Varianten gezielt werden und wie schnell sie abgebaut werden — noch wenig verstanden, da die Kurzlese-RNA-Sequenzierung keine vollständigen Isoformen auflösen kann.
Materialien & Methoden
Experimentelles Design
- Metabolische Kennzeichnung (EZbakR)
- Zeitverlaufssampling
- Biologische Replikate
Sequenzierung
- PacBio Iso-Seq
- Vollständiges cDNA
- Kinnex-Verkettung
Analyse
- Isoform-Entdeckung
- Kinetische Modellierung
- Differenzielle Zerfallsraten
Ergebnisse
- Isoform-spezifische NMD-Zielgerichtetheit
- Ein einzelnes Gen produziert je nach alternativem Spleißen sowohl NMD-sensible als auch NMD-resistente Isoformen.
- Die Isoform-aufgelöste kinetische Modellierung offenbarte eine Hierarchie von Zerfallsraten, die für Bulk-RNA-Seq-Methoden unsichtbar ist.
- Kinetische Landschaft der NMD
- Transkript-spezifische Zerfallsratenquantifizierung
- EZbakR + Iso-Seq ermöglicht die direkte Messung der Halbwertszeiten von Isoformen.
- Identifizierte NMD-Entkommensmechanismen auf Isoformebene, die durch die Analyse auf Genebene nicht erkannt werden können.
Fazit
Diese Studie zeigt, dass PacBio Full-Length Iso-Seq isoformauflösende kinetische Studien ermöglicht, die mit Short-Read RNA-Seq unmöglich sind. Für Forscher, die alternative Spleißung, posttranskriptionale Regulation oder die Genexpression auf Isoform-Ebene untersuchen, bietet Iso-Seq die molekulare Auflösung, um mechanistische Fragen zu stellen – und Antworten auf der Ebene einzelner Transkript-Isoformen zu erhalten.
Referenz
- Aufdeckung der Isoform-Auflösungs-Kinetiklandschaft des nonsense-vermittelten mRNA-Abbaus mit EZbakR. PMC11952489, 2025. Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von externen Links nicht abrufen oder übersetzen. Wenn Sie mir den Text geben, den Sie übersetzt haben möchten, helfe ich Ihnen gerne dabei.
Verwandte Veröffentlichungen
Hier sind Publikationen von Forschern, die unsere PacBio SMRT-Sequenzierungsdienste oder verwandte Plattformen genutzt haben:
Die erste hochqualitative Genomassemblierung und Annotation von Lantana camara, einer wichtigen Zierpflanze und einer bedeutenden invasiven Art.
Journal: Fortschritte in der Gartenbauwissenschaft
Jahr: 2024
DOI: 10.1007/s44281-024-00043-6
Vollständige Genomsequenz des lignocellulose-abbauenden Actinomyceten Streptomyces albus CAS922
Journal: Ankündigungen von Mikrobiologischen Ressourcen
Jahr: 2020
DOI: 10.1128/mra.00227-20
Eine chromosomengroße und haplotypaufgelöste Genomassemblierung der tetraploiden Brombeere (Rubus L. Subgenus Rubus)
Zeitschrift: Gartenbau Forschung
Jahr: 2025
DOI: 10.1093/hr/uhaf052
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