Virale Metagenomische Sequenzierung

Als erfahrener Anbieter von NGS-Diensten und Partner von Illumina verpflichtet sich CD Genomics, beispiellose Mengen an Sequenzdaten anzubieten, die schnelle und innovative Analyseansätze mit kosteneffizienten Lösungen ermöglichen. Wir verfügen über umfassende Expertise in der Bereitstellung eines zuverlässigen und unvoreingenommenen viralen metagenomischen Sequenzierungsdienstes, indem wir modernste Hochdurchsatz-Sequenzer, Sequenzierungsstrategien und Bioinformatik Pipelines.

Einführung in die virale Metagenom-Sequenzierung

Viren sind die zahlreichsten biologischen Entitäten der Welt, die in den meisten Umgebungen mikrobielle Zellen im Verhältnis 10:1 übertreffen. Viren bewohnen ständig unseren Körper, und asymptomatische Wirte sind keine Ausnahme. Diese aufkommende Sichtweise erhöht die Notwendigkeit, das Virom zu erforschen. Virale Metagenomik kann Einblicke in die Zusammensetzung und Struktur viraler Gemeinschaften bieten. Die Profilierung der taxonomischen Zusammensetzung viraler Gemeinschaften ist nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für die klinische Wissenschaft und Praxis wichtig.

Viralgemeinschaften sind jedoch schwer zu charakterisieren, da es kein einzelnes Gen gibt, das von allen viralen Genomen geteilt wird, was die Anwendung analoger Methoden, die bei Bakterien für das ribosomale DNA-Profiling verwendet werden, einschränkt. Die geringe Menge an freier und zellulärer DNA stellt eine weitere Herausforderung dar. Metagenomisches Shotgun-Sequencing und RNA-Seq Es gibt zwei Ansätze zur Charakterisierung von viralen Gemeinschaften. Die direkte Sequenzierung kann zu einem hohen Hintergrund genetischer Materialien führen. Daher sind zusätzliche Verfahren erforderlich, um virale Partikel (VPs) zu konzentrieren und zu reinigen. Es wurden mehrere praktikable Anreicherungsmethoden vorgeschlagen, darunter Filtration, Ultrazentrifugation, Nucleasenbehandlung, multiple Displacementsverstärkung (MDA), linker-verstärkte Shotgun-Bibliothek (LASL) und zufälliger PCR-Ansatz.

Vorteile der viralen Metagenom-Sequenzierung

• Keine Notwendigkeit für Kultivierung oder Antikörperlaboruntersuchungen.
• Umfassende Informationen über die Biodiversität, Taxonomie und Funktion von Gemeinschaften
• Vielversprechende Anwendungen umfassen die Entdeckung von Viren und die Identifizierung viraler Krankheitserreger, die mit der Gartenbau-, Veterinärmedizin und der menschlichen Gesundheit verbunden sind, insbesondere bei schwer zu diagnostizierenden Fällen.

Anwendung der viralen Metagenom-Sequenzierung

(1) Krankheitsbehandlung: Das Studium der viralen Vielfalt, die Entdeckung unbekannter Viren, die Detektionsanalyse spezifischer Viren/Bakteriophagen und die Interaktion zwischen Bakterien und Bakteriophagen (in Aspekten wie dem Darm, der Haut, der Umwelt usw. und in Bezug auf die Gesundheit) sind entscheidende Elemente, die angegangen werden müssen. Die Untersuchung der Beziehungen zwischen Viren und Krankheiten (wie Stoffwechselerkrankungen, gastrointestinalen Erkrankungen, Atemwegserkrankungen, Allergien, Infektionskrankheiten, Mundkrankheiten und Tumoren) kann unser Verständnis erheblich erweitern. Techniken wie die Bakteriophagentherapie und die Sensibilisierung von antibiotikaresistenten Bakterien könnten potenziell Immunantworten stimulieren.

(2) Lebensmittelsicherheit: Die Überwachung von Viren in Lebensmitteln, das Verständnis der viralen Vielfalt in Lebensmitteln, die Untersuchung von über Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern und die Überwachung von Viren während der Lebensmittelverarbeitung sind entscheidende Maßnahmen. Die Rückverfolgung von Vorfällen viraler Kontamination und das Studium des Zusammenhangs zwischen Viren und dem Lebensmittelmikrobiom können erheblich zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit beitragen.

(3) Viehzuchtindustrie: Das Management von Krankheiten in der Tierzucht, wie der Umgang mit Durchfall, Schweinepest, Maul- und Klauenseuche, zoonotischen Krankheiten und die Analyse von Kot von Wildtieren, ist entscheidend für die Erhaltung der Gesundheit von Nutzvieh.

(4) Überwachung von Infektionskrankheiten: Die Überwachung von Umweltviren kann frühzeitige Erkennung und Hinweise auf Krankheitsausbrüche liefern und somit erheblich zu öffentlichen Gesundheitsinitiativen beitragen.

(5) Umwelttechnik: In der Umwelttechnik, wie z.B. bei der Abwasserbehandlung und der Schadstoffkontrolle, hilft das Verständnis von viralen Gemeinschaften in Gewässern, die Wirksamkeit von Behandlungen und die Umweltauswirkungen zu bewerten. Dies gilt für verschiedene Umgebungen wie öffentliche Verkehrssysteme, Krankenhäuser, Ozeane, Süßwasserquellen, Luft und Gletscher.

(6) Arzneimittelentdeckung: Die Erforschung des Viroms kann Viren aufdecken, die mit Wirten interagieren könnten, und Hinweise für die Entdeckung neuer Medikamente liefern.

(7) Landwirtschaft: Das Studium der viralen Vielfalt von Pflanzen und Böden könnte die Entwicklung von Biopestiziden im Agrarsektor unterstützen.

Viral Metagenomische Sequenzierungs-Workflow

Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch, indem es jedes Verfahren befolgt, um umfassende und genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Der allgemeine Arbeitsablauf für virale metagenomische Shotgun-Sequenzierung ist unten skizziert. Kurz gesagt, die grundlegenden Schritte, die an der viralen Metagenomik beteiligt sind, umfassen die Isolation und Reinigung von viralen Partikeln durch Größenfiltration oder dichtebasierte Zentrifugation, sequenzunabhängige Amplifikation von viraler Nukleinsäure, Shotgun-Sequenzierung oder RNA-Seq und abgestimmte Analysen zu Vielfalt, Taxonomie und Funktion durch eine Reihe zuverlässiger bioinformatischer Werkzeuge.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenquellen einschließlich Umwelt- und klinischer Proben Musterqualitätskontrolle Isolation und Reinigung von VPs und sequenzunabhängige Amplifikation
	Sequenzierungsplattformen HiSeq-Plattformen, paired-end 150 bp, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 Mehr als 2 GB Rohdaten pro Probe Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert PacBio's SMRT Technologie ist auch für die Sequenzierung langer Fragmente verfügbar, die genauere und zusammenhängende Sequenzen liefert.
	BioinformatikanalyseWir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Die Beseitigung von wirts- und bakterienbezogener Kontamination Nukleotid-Ausrichtung (VirFinder, VirusFinder und BLAST) Protein-Ausrichtung (RefSeq) De novo Assemblierung, Taxonomieidentifikation, Abdeckungsdiagramm und phylogenetische Analyse …und mehr

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Qualitätskontrolle und Hostentfernung
• Analyse der Lesespezies
• Versammlung
• Analyse der zusammengebauten Arten
• Funktionalanalysis
• Vorhersage von Phagen-Wirten

Neben der qualifizierten viralen Metagenom-Sequenzierung bieten wir Unterstützung an, einschließlich des experimentellen Designs, der Bestimmung der geeigneten Sequenzierungsplattform, Softwaretools und Analysemethoden, um Ihr Projekt zu unterstützen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren. Unsere erfahrenen Spezialisten helfen Ihnen gerne, Ihre Fragen zu lösen.

Referenzen:

1. Li Y, et al. VIP: eine integrierte Pipeline für die Metagenomik zur Identifizierung und Entdeckung von Viren. Wissenschaftliche Berichte, 2016, 6: 3774
2. Rampelli, S. et al. ViromeScan: ein neues Werkzeug zur metagenomischen Profilierung viraler Gemeinschaften. BMC Genomik2016, (17):165.
3. Lewandowska D W, Zagordi O, Geissberger F D, et al. Optimierung und Validierung der Probenvorbereitung für die metagenomische Sequenzierung von Viren in klinischen Proben. Mikrobiom, 2017, 5(1): 94.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Pro Basissequenzinhalt.

Pro Sequenz GC-Gehalt.

Vereinigte_Fülle.

Abundanz-Hitzekarte auf Familienebene.

KEGG-Klassifikation.

CAZy-Funktionsklassifikation.

Boxplot-Analyse basierend auf Bray-Curtis (A), binärem Jaccard (B), ungewichteten Unifrac (C) und gewichteten Unifrac (D).

PCoA-Analyse basierend auf Bray-Curtis (A), binärem Jaccard (B), ungewichteten Unifrac (C) und gewichteten Unifrac (D).

UPGMA-Baum.

1. Welche Ansätze gibt es für die Ganzgenomsequenzierung von Krankheitserregern?

Derzeit gibt es drei Hauptansätze zu Whole-Genome-Sequenzierung von Krankheitserregern, d.h., metagenomische SequenzierungPCR-Amplicon-Sequenzierung und Target-Enrichment-Sequenzierung (Abbildung 1). Die direkte metagenomische Sequenzierung bietet eine genaue und integrierte Darstellung der Sequenzen innerhalb einer Probe. Die PCR-Amplicon-Sequenzierung führt PCR-Reaktionen durch, um das virale Genom anzureichern, was die Arbeitslast für große Genome erheblich erhöht, aber die Kosten senkt. Die Target-Enrichment-Sequenzierung verwendet virus-spezifische Nukleotid-Sonden, die an eine feste Phase gebunden sind, um das virales Genom In einer einzigen Reaktion, die die Arbeitslast verringert, aber die Kosten im Vergleich zur PCR-Amplikon-Sequenzierung erhöht. Die Vor- und Nachteile sind in Tabelle 1 aufgeführt. Sie zeigt, dass die virale metagenomische Sequenzierung die einzigartigen Vorteile bietet, Pathogene zu untersuchen und die virale Vielfalt in Umwelt- und klinischen Proben zu charakterisieren.

Abbildung 1. Die Hauptansätze zur Sequenzierung viraler Genome (Houldcroft et al. 2016).

Tabelle 1. Vor- und Nachteile verschiedener Methoden zur Sequenzierung viraler Genome (Houldcroft et al. 2016).

2. Was ist der allgemeine Bioinformatik-Workflow für die virale Metagenom-Sequenzierung?

Nach der Sequenzierung werden die Roh-NGS-Reads zunächst durch die Entfernung von Adaptern, niedrigqualitativen und niedrigkomplexen Sequenzen vorverarbeitet, gefolgt von einer rechnergestützten Subtraktion der hostbezogenen Reads. Im Schnellmodus werden Viren durch Alignment an die ViPR/IRD Nukleotid-Datenbank identifiziert. In einem sensibleren Modus werden Bakterien und verwandte ribosomale RNA-Reads entfernt, bevor das Alignment an die Virusdatenbank erfolgt. Nicht zugeordnete Reads werden weiter an eine virale Proteindatenbank (NCBI RefSeq DB) ausgerichtet. Anschließend erfolgt die Taxonomie-Identifikation (Taxl), das Abdeckungsdiagramm (Covplot), von Neuem Die Assemblierung (mehrere k-Mer) und die phylogenetische Analyse (PhyGo) können durchgeführt werden.

Referenzen:

1. Houldcroft C J, Beale M A, Breuer J. Klinische und biologische Erkenntnisse aus der viralen Genomsequenzierung. Nature Reviews Microbiology, 2017, 15(3): 183-192.
2. Li Y, Wang H, Nie K, et al. VIP: eine integrierte Pipeline für die Metagenomik zur Identifizierung und Entdeckung von Viren. Scientific Reports, 2016, 6.

Erkennung und Sequenzierung des Zika-Virus aus Fruchtwasser von Föten mit Mikrozephalie in Brasilien: Eine Fallstudie

Journal: The Lancet Infektiöse Krankheiten

Impactfaktor: 19,864

Veröffentlicht: 17. Februar 2016

Hintergründe

Die Fälle von Mikrozephalie in Brasilien im Jahr 2015 waren 20-mal höher als in den Vorjahren. Epidemiologische Daten deuten darauf hin, dass die Inzidenz von Mikrozephalie in Brasilien mit dem Zika-Virus in Verbindung stehen könnte. Die Autoren entnahmen Fruchtwasserproben von zwei schwangeren Frauen in Brasilien, deren Föten mit Mikrozephalie diagnostiziert wurden, um die Ursache der Mikrozephalie zu untersuchen.

Methoden

Ergebnisse

1. Zika-Virus-Genomassemblierung

Nach der Entfernung zellulärer Kontamination wiesen 288.904 Sequenzen Ähnlichkeiten mit Virusgenomen auf, und 683 Sequenzen stimmten mit dem Genom des Zika-Virus überein. Abbildung 1 zeigt das gesamte Zika-Virus-Genom, das aus Patient 1 isoliert wurde, mit Genannotationen.

Abbildung 1. Vergleichendes Genom-BLAST-Atlas-Diagramm des Zika-Virus. Der grüne Kreis entspricht dem vollständigen brasilianischen Zika-Virus, das von Patient 1 isoliert wurde. Der rote Kreis entspricht dem senegalesischen Stamm des Zika-Virus. Der blaue Kreis entspricht dem ugandischen Stamm.

2. Phylogenetische Analyse

Die phylogenetischen Analysen wurden mit dem kodierenden Bereich für die Hüllgene (Abbildung 2) und NS5-Gene (Abbildung 3) durchgeführt. Die geografische Region des brasilianischen Zika-Virus-Stammes konnte aufgrund von Probenbeschränkungen nicht bestimmt werden, schien jedoch enger mit dem Stamm aus Französisch-Polynesien als mit afrikanischen Stämmen verwandt zu sein.

Die geografischen und chronologischen Verteilungen der Zika-Virus-Linien deuteten darauf hin, dass der südostasiatische Stamm genetisch von den afrikanischen Stämmen seit etwa 50 Jahren isoliert sein könnte. Dieses Muster wurde durch die genetische Distanz zwischen den neuen brasilianischen Zika-Virus-Sequenzen und dem ugandischen Zika-Virus-Genom weiter bestätigt (Abbildung 4).

Abbildung 2. Maximum-Likelihood-Topologien des Hüllengenombereichs des brasilianischen Zika-Virus.

Abbildung 3. Maximum-Likelihood-Topologien der NS5-Genomregion des brasilianischen Zika-Virus.

Abbildung 4. Maximum-Likelihood-Phylogenie des brasilianischen Zika-Virus, anderer Flaviviridae-Genome und eines Alphavirus-Genoms. DENV = Denguevirus, JEV = Japanisches Enzephalitisvirus. YFV = Gelbfiebervirus. ZIKA = Zika-Virus.

3. Eine Zika-Virus-Infektion könnte durch die transplacentare Übertragung auftreten.

Dieser Artikel war der erste, der das gesamte Genom des Zika-Virus aus Fruchtwasser isolierte, was darauf hindeutet, dass eine Zika-Virus-Infektion durch transplacentare Übertragung erfolgen könnte.

Referenz:

1. Calvet G, Aguiar R S, Melo A S O, et al. Nachweis und Sequenzierung des Zika-Virus aus Fruchtwasser von Föten mit Mikrozephalie in Brasilien: eine Fallstudie. The Lancet Infektionskrankheiten, 2016, 16(6): 653-660.