Nanopore Voll-Längen-Transkript-Sequenzierung

Die Einführung von Nanoporen

Die Komplexität von Short-Reads Zweitgeneration-Sequenzierung Die Datenassemblierung und die Unfähigkeit, sich zuverlässig wiederholende Sequenzen oder große genomische Umstellungen zu erschließen, wurden durch die dritte Generation der Sequenzierung überwunden. Diese erzeugt alle sehr lange Reads (1–100 kb), was sich von Next-Generation-Sequenzierung.

Im Jahr 2014 veröffentlichte Oxford Nanopore Technologies Nanoporen-Sequenzierung in der Form des MinION, eines tragbaren Sequenziergeräts, das ein Raster aus in Membranen eingebetteten biologischen Nanoporen verwendet. Die Membran, in der sich die Nanoporen befinden, sorgt für die Trennung zweier ionischer Lösungen, wodurch ein elektrischer Strom durch die Nanoporen fließen kann. Lange DNA-Moleküle werden vorbereitet, indem ein Haarnadeladapter an ein Ende des doppelsträngigen Moleküls hinzugefügt wird, bevor eine Helikase und ein Motorprotein, die an der Vorlage befestigt sind, die DNA entwinden und einzelsträngige DNA durch den Nanoporenkanal fädeln. Die DNA kann durch die Pore einen Basen nach der anderen bewegt werden, wobei die Nukleotidbasen charakteristische Veränderungen im elektrischen Strom hervorrufen, der durch die Nanopore fließt und in Basenaufrufe übersetzt wird. Da der Sequenzierungsprozess sehr wenige erschöpfbare Reagenzien verwendet, kann der Lauf effektiv fortgesetzt werden, bis ein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wird.

Abbildung 1. Übersicht über die Nanoporen-Sequenzierung.

Vorteile der Nanopore-Sequenzierung von Voll-Längen-Transkripten

• Die etwas längere kartierbare Länge (> 2 Mb).
• ONT MinION bietet eine sehr hohe Durchsatzrate, da die Nanoporen mehrere Moleküle sequenzieren können.
• Die Kosten für die ONT-Datengenerierung sind geringer.
• Präzise Quantifizierung von Isoformen: Genaue Unterscheidung und Identifizierung von Isoformen und neuen Transkripten; es wird eine Korrelation von 98,9 % zwischen den quantitativen Bewertungen und den theoretischen Werten berichtet.
• Fehlen von GC- und PCR-Bias: Da der Bibliotheksvorbereitungsprozess keinen PCR-Schritt umfasst, wird der PCR-Bias eliminiert; zudem gibt es keinen GC-Bias.
• Breite Palette der Transkript-Erkennung: Transkripte, die in der Regel mehrere tausend Nukleotide umfassen, sind ohne Fragmentauswahl nachweisbar, was die Identifizierung von Transkripten von mehreren Dutzend bis zu mehreren Zehntausend Nukleotiden ermöglicht.
• Direkte Erkennung von strukturellen Varianten: Die direkte Entdeckung von variablen Spleiß- und Fusionsgenen wird möglich.

Da die Sequenzierungskosten ein erhebliches Hindernis für die Anwendung der TGS darstellen, macht die relativ hohe Durchsatzrate und Erschwinglichkeit ONT vielversprechend für viele Anwendungen.

Anwendung der Nanopore-Voll-Längen-Transkript-Sequenzierung

• Embryonale Entwicklung
• Zell-Differenzierung
• Zellproliferation
• Neuronale Aktivität
• Immunantwort
• Tumorbildung und Metastasenbildung

Die Nanopore-Voll-Längen-Transkriptom-Sequenzierung bietet vielfältige Anwendungen in verschiedenen biologischen Forschungsbereichen, einschließlich:

• Identifizierung neuer Transkripte: Diese Technologie hilft dabei, neue Transkripte und Spleißvarianten zu entdecken, ohne ein Referenzgenom zu benötigen.
• Genstruktur-Analyse: Sie ermöglicht eine präzise Untersuchung von Genstrukturen, einschließlich Exon-Intron-Grenzen, untranslatierten Regionen (UTRs) und polyadenylierten Schwänzen.
• Erkennung von Fusionsgenen und alternativer Spleißung: Die Voll-Längen-Transkriptom-Sequenzierung kann Fusionsgene und Spleißvarianten direkt identifizieren, was insbesondere für die Krebsforschung von Vorteil ist.
• Eukaryotische Transkriptanalyse: Die Technologie reichert selektiv eukaryotische Transkripte mit Poly-A-Schwänzen während der Bibliotheksvorbereitung an, was ihre Untersuchung verbessert.
• Studie von lncRNAs: Während hauptsächlich mRNA und poly-A-haltige lncRNAs angereichert werden, bietet sie auch Einblicke in die Struktur und Funktion von lncRNAs. Allerdings können lncRNAs ohne poly-A-Schwänze nicht angereichert werden und bleiben unentdeckt.

Nanopore Voll-Längen-Transkript-Sequenzierungs-Workflow

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen Beispiellspezies: Mensch, Ratte, Maus Gesamt-RNA ≥ 2 μg Stellen Sie sicher, dass Ihre RNA-Probe die folgenden Kriterien erfüllt: Durchschnittliche Fragmentgröße: ~2 kb Eingangsmasse, gemessen mit dem Qubit RNA HS Assay: 250 ng Ein Verhältnis von 260:280 von ~2,0 Ein Verhältnis von 260:230 von 2,0-2,2 Keine Detergenzien oder Tenside im Puffer
	Sequenzierungsstrategie ONT-Plattformen, Bibliothek: 8K, 2G/pro Probe
	Bioinformatische Analyse Oxford Nanopore Technologies Langzeitleseverarbeitung Entfernen Sie Überflüssiges. Finde Fusions-Transkript Strukturanalyse Vorhersage von Transkriptionsfaktoren lncRNA-Analyse Genfunktionelle Annotation SNP-Erkennung Quantifizierung von Gen-/Transkriptausdrucksniveaus und differenzielle Ausdrucksanalyse Funktionelle Anreicherungsanalyse PPI (Protein-Protein-Interaktion)

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Nanopore-Voll-Längen-Transkript-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Referenz:

1. Weirather J L, Cesare M D, Wang Y, u. a.Umfassender Vergleich von Pacific Biosciences und Oxford Nanopore Technologies und deren Anwendungen in der Transkriptomanalyse. F1000Research, 2017, 6:100.

Erfordert die vollständige Transkriptom-Sequenzierung Fragmentierung und Assemblierung?

Vollständige Transkriptom-Sequenzierung, basierend auf PacBio- oder Nanopore-Sequenzierungsplattformen der dritten Generation, erfordert keine Fragmentierung und Assemblierung. Es erzeugt direkt vollständige Transkripte, die 5'- und 3'-UTRs sowie Poly-A-Schwänze enthalten. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Analyse von alternativem Spleißen und Genfusionen in Arten mit einem Referenzgenom und adressiert die Herausforderungen kürzerer und unvollständiger Transkript-Assemblierungen in Arten ohne ein Referenzgenom.

2. Wie genau ist die Erkennung von vollständigen Transkripten?

Die Basisfehlerquote von Sequenzierungsplattformen der dritten Generation ist unvoreingenommen. Bei der Nanopore-Plattform kann die Verwendung von Referenzgenominformationen zur Sequenzkorrektur die Genauigkeit der Basiskorrektur erheblich verbessern.

Erfasst die vollständige Transkriptom-Sequenzierung alle lncRNAs?

Während des Bibliotheksbauprozesses werden RNA-Moleküle mit Poly-A-Strukturen identifiziert, die mRNAs und einige lncRNAs mit Poly-A-Schwänzen aus der gesamten RNA anreichern. lncRNAs ohne Poly-A-Strukturen können jedoch auf diese Weise nicht angereichert und sequenziert werden, was dazu führt, dass nur ein Teil der lncRNAs nachgewiesen wird.

4. Wie viele biologische Replikate werden allgemein für die Nanopore-Voll-Längen-Transkriptom-Sequenzierung empfohlen?

Forschungen zeigen, dass biologische Replikate die Genauigkeit bei der Identifizierung von Genexpressionsniveaus über das gesamte Transkriptom verbessern, während eine erhöhte Sequenzierungstiefe hauptsächlich die Genauigkeit bei der Erkennung von Genen mit niedriger Expression erhöht. Es wird empfohlen, für jede Behandlungsbedingung mindestens drei biologische Replikate zu haben. Für Studien, die Proben mit hoher biologischer Variabilität oder solche, die subtile Ausdrucksunterschiede oder Faltänderungen erkennen wollen, beinhalten, ist eine höhere Anzahl biologischer Replikate erforderlich. Beispielsweise können klinische Proben mit signifikanten individuellen Unterschieden 5-10 Replikate pro Gruppe erfordern, während Zelllinienproben mit geringerer biologischer Variabilität möglicherweise mit drei Replikaten pro Gruppe auskommen.

5. Was sind die Unterschiede zwischen der Nanopore-Voll-Längen-Transkriptom-Sequenzierung und der Next-Generation-Sequenzierung von Illumina? RNA-Sequenzierung?

Der Hauptunterschied liegt in den Sequenzierungsplattformen. Die Illumina-Plattform verwendet typischerweise die paired-end 150 (PE150) Sequenzierung, bei der kleine Fragmentbibliotheken erstellt und die Sequenzierung durch Synthese durchgeführt wird, was während der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung eine PCR-Amplifikation erfordert. Sie wird hauptsächlich zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der differentiellen Expression eingesetzt. Im Gegensatz dazu erfordert die Nanopore-Sequenzierung des vollständigen Transkriptoms keine RNA-Fragmente und kann vollständige Transkripte von 5' bis 3' erfassen, wodurch umfassende Sequenz- und Expressionsinformationen bereitgestellt werden. Sie hat keine Vorurteile gegenüber der Fragmentgröße und erkennt direkt elektrische Signale, wodurch die Notwendigkeit für Synthese während der Sequenzierung entfällt und im Vergleich zu Plattformen der zweiten Generation eine deutlich geringere GC-Bias entsteht. Darüber hinaus hat sie, da keine Transkriptzusammenstellung erforderlich ist, erhebliche Vorteile bei der Erkennung struktureller Variationen auf Transkriptebene, wie alternative Spleißung, Genfusionen, APA (alternative Polyadenylierung) und die Vorhersage neuer Gene.

Vollständige Transkription Charakterisierung von SF3B1 Mutation bei chronischer lymphatischer Leukämie zeigt eine Herabregulierung von behaltenen Introns.

Zeitschrift: Nature Communications
Impact-Faktor: 14,919
Veröffentlicht: 18. März 2020

Hintergrund

Bei verschiedenen Krebsarten treten Mutationen im Spleißfaktor auf. SF3B1 wurden mit spezifischen Veränderungen in den Spleißmustern in Verbindung gebracht, die Bedingungen wie chronische lymphatische Leukämie (CLL), uveales Melanom, Brustkrebs und myelodysplastische Syndrome betreffen. SF3B1, ein grundlegender Bestandteil des Spliceosoms, interagiert mit prä-mRNA und übt entscheidende Kontrolle über den Spleißprozess aus. Besonders bemerkenswert sind Mutationen in SF3B1, insbesondere die K700E-Mutation, die mit ungünstigen klinischen Ergebnissen bei CLL in Verbindung gebracht wurde. Während die Kurzlesesequenzierung Einblicke in die durch beeinflussten Spleißmuster geliefert hat SF3B1 Mutationen, Long-Read-Nanopore-Sequenzierung bietet eine umfassendere Perspektive und enthüllt neuartige Details zu Spleißveränderungen. Nanoporen-Sequenzierung ermöglicht die Erkennung von vollständigen Transkriptmolekülen und ermöglicht eine präzise Bewertung von alternativen Spleißereignissen, was vielversprechende Wege für die Krebsforschung und therapeutische Interventionen eröffnet.

Methoden

Ergebnisse

In dieser Pilotstudie verwendeten die Autoren die Nanoporen-Sequenzierung, um zu analysieren SF3B1^K700E vollständige Transkripte in CLL-Proben. Die Autoren fanden erhöhtes abnormales 3'-Spleißen in SF3B1^K700E, was frühere Ergebnisse bestätigt. Zusätzliche Proben wurden mit Nanopore-Technologie sequenziert, was insgesamt 257 Millionen Reads ergab. Trotz einer RNA-Lagerung von 5 Jahren wurde eine minimale Degradation beobachtet. Eine starke Korrelation der Genexpression zwischen den mit minION und PromethION sequenzierten Proben ermöglichte die Datenkombination für nachfolgende Analysen.

Abb. 1: Langzeit-Nanoporen-Sequenzierung und FLAIR-Analyse zur Identifizierung von Voll-Längen-Transkripten, die mit SF3B1 Mutation bei chronischer lymphatischer Leukämie.

In dieser Studie versuchten die Forscher, die Verstärkung der Nutzung alternativer 3'-Spleißstellen (3'SS) zu bestätigen, die durch SF3B1^K700E durch Nanoporen-Sequenzierungsdaten. Eine vergleichende Analyse von 3'-Spleißereignissen in einer Kohorte mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), die zunächst über Kurzlese-Illumina-Sequenzierung identifiziert wurde, wurde parallel zu den Ergebnissen der Nanoporen-Sequenzierung durchgeführt. Um alternative Spleißereignisse (AS) in Isoformen genau zu klassifizieren, entwickelten die Autoren einen AS-Ereignis-Caller innerhalb von FLAIR. Dieser Ansatz erleichterte die Identifizierung signifikanter Unterschiede in alternativen 3'- und 5'-Spleißstellen zwischen SF3B1^K700E und SF3B1^WTBemerkenswerte Beobachtungen umfassten die Identifizierung einer adeninhaltigen Region stromaufwärts des kanonischen 3'SS, die mit früheren Forschungsergebnissen übereinstimmt.

Abb. 2: Die mit Nanoporen-Sequenzierungsdaten identifizierten Spleißmuster von Alternative 3 stimmen mit den Kurzlesedaten überein und zeigen zusätzliche Spleißkomplexität.

Kurzzeitstudien haben Mutationen in Verbindung gebracht SF3B1 in CLL zu einem Anstieg von Transkripten mit vorzeitigen Terminierungs-Kodons (PTCs). Die vollständige cDNA-Sequenzierung ermöglicht eine genauere Erkennung von Transkripten mit PTCs und die Schätzung unproduktiver Isoformen. Unproduktive Isoformen, definiert durch PTCs, die 55 Nukleotide oder mehr stromaufwärts von der 3' am weitesten entfernten Spleißstelle liegen, können einer nuklearen Retention oder einem nonsense-vermittelten Abbau unterliegen. In Nanopore-Daten identifizierten die Autoren genau bekannte unproduktive Transkripte von SRSF1 und entdeckten zusätzliche unannotierte Isoformen, von denen einige als unproduktiv vorhergesagt werden.

Abb. 3: Mutant SF3B1 reguliert unproduktive, intron-behaltende Transkripte nach unten.

Fazit

Diese Studie nutzt Nanoporen-Sequenzierung, um vollständige cDNA aus CLL-Proben zu untersuchen, und zeigt signifikante unterschiedliche Spleißereignisse, die mit SF3B1 Mutation. Die Autoren stellen FLAIR vor, einen computergestützten Arbeitsablauf zur Transkriptanalyse, und identifizieren Veränderungen an 3'-Spleißstellen sowie eine Herabregulierung von Intron-Retention-Ereignissen. Die Analyse von Voll-Längen-Transkripten liefert Einblicke in alternatives Spleißen und die Häufigkeit von Isoformen und hebt das Potenzial der Nanoporen-Sequenzierung für die Krebs- und Spleißforschung hervor.

Referenz:

1. Tang, Alison D., u. a."Vollständige Transkriptcharakterisierung von" SF3B1 Mutation bei chronischer lymphatischer Leukämie zeigt eine Herabregulierung von behaltenen Introns. Naturkommunikationen 11.1 (2020): 1438.