10x räumliche Transkriptom-Sequenzierungsdienstleistung

Was ist räumliche Transkriptomik?

Die räumliche Transkriptomik, ein innovativer Ansatz zur tiefen Analyse von RNA-seq-Daten in einer räumlichen Dimension, ermöglicht eine umfassende Darstellung der mRNA-Verteilung innerhalb jedes einzelnen Gewebeschnitts. Dies erlaubt anschließend die präzise Lokalisierung und differenzierte Identifizierung von aktiv exprimierten Funktionsgenen innerhalb eines bestimmten Gewebegebiets. Da Zellen, die die grundlegenden Einheiten eines Organismus darstellen, ihre einzigartigen biologischen Funktionen in Zusammenarbeit mit ihrem räumlich spezifischen Mikroumfeld ausüben, wird das Verständnis von räumlichen Positionsinformationen entscheidend, wenn es darum geht, Mechanismen in der Zellbiologie, Onkologie und Entwicklungsbiologie zu untersuchen.

Dank der Fortschritte in der mikroskopischen Bildgebungstechnologie (einschließlich Superauflösung und Einzelmolekül-Bildgebung) sowie kontinuierlicher Verbesserungen der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechniken hat unser Verständnis von Zellen, Gewebestrukturen und -funktionen exponentiell zugenommen. Gleichzeitig hat die Entwicklung von Sequenzierungstechnologien präzise quantitative und qualitative Analysen der Genexpression in zuvor unerforschten Zellen oder Geweben ermöglicht. Die räumliche Transkriptomik integriert mikroskopische Bildgebung und Sequenzierungstechnologien und bewahrt so viele räumliche Informationen der Probe wie möglich, während sie Daten zur Genexpression erfasst. Dies bietet Wissenschaftlern revolutionäre Erkenntnisse mit tiefgreifenden Implikationen.

FFPE räumliche Transkriptomik-Sequenzierung

Mit dem kontinuierlichen Fortschritt und der Innovation in der Technologie der räumlichen Transkriptomik werden zahlreiche technische Herausforderungen allmählich überwunden. Kürzlich erzielte 10X Genomics einen bedeutenden Durchbruch, indem es die räumliche Transkriptomik anwendete, um erfolgreich die Einschränkungen von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten in der räumlichen Genexpressionsanalyse zu adressieren. Diese Entwicklung bietet eine robuste Unterstützung für die weitere Erforschung räumlicher Informationen. Die Visium-Technologie zur räumlichen Genexpression kombiniert geschickt Histologie mit Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und erweitert erheblich die Arten und den Umfang der Probenverarbeitung in der Einzelzellsequenzierungstechnologie. Dies bietet eine reichhaltigere Auswahl für die Forschung in Bereichen wie der Pathophysiologie und ermöglicht umfassende transkriptomische Analysen von über 18.000 Genen bei Menschen und Mäusen. Diese Technologie ermöglicht die eingehende Untersuchung der Genexpression von Signalwegen, die Analyse der Gewebeheterogenität und die Offenlegung von Zelltypen und -zuständen in verschiedenen geweblichen morphologischen Hintergründen.

10x Genomics Visium Räumliche Transkriptomik Sequenzierungsdienst bei CD Genomics

Der Spatial Transcriptomics Sequencing Service von CD Genomics ist eine bahnbrechende Technik, die die fortschrittliche 10x Visium-Plattform nutzt und eine präzise in-situ-transkriptionale Profilierung der vollständigen Genexpression innerhalb von Geweben ermöglicht. Dieser Ansatz bietet detaillierte Einblicke nicht nur in die Ebenen der Genexpression, sondern lokalisiert auch genau, wo Gene im Geweberaum exprimiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, unterschiedliche Genexpressionen in verschiedenen funktionalen Regionen innerhalb von Geweben direkt zu beobachten und zu vergleichen. Dadurch bietet es ein leistungsstarkes Werkzeug für die eingehende Erforschung der Gewebefunktionen und der Krankheitsmechanismen und erweitert somit unsere Fähigkeit, die Mechanismen von Gesundheit und Krankheit zu untersuchen.

10x Genomics

10x Genomics Visium räumliche Transkriptomik Sequenzierungsprinzip

Der Schlüssel zur Technologie hinter räumlichen Genexpressionslösungen liegt im Abschnitt der Folie. Als Grundlage für den Bibliotheksaufbau dient jede Folie, die mit vier präzisen Erfassungsbereichen gemustert ist, die jeweils 6,5 x 6,5 Millimeter messen und in einem quadratischen Rahmen angezeigt werden. In jedem Erfassungsbereich befinden sich 5000 mit Barcodes versehenen Stellen, die jeweils einen Durchmesser von 55 Mikrometern haben und einen Abstand von 100 Mikrometern zwischen benachbarten Stellen aufweisen. Jede Stelle trägt eine einzigartige Barcode-Sequenz – einen räumlichen Barcode – der verwendet wird, um die einzelnen Stellen zu identifizieren und zu unterscheiden. Darüber hinaus hat jede Nukleinsäuresonde innerhalb einer Stelle ein exklusives einzigartiges Tag, um verschiedene Transkripte innerhalb einer einzelnen Zelle zu unterscheiden und PCR-Duplikate zu beseitigen, wodurch eine absolute Quantifizierung erreicht wird.

Nach der Freisetzung von RNA aus den Zellen im Gewebeschnitt wandern sie zu den zuvor genannten Stellen und werden mit entsprechenden Barcode-Sequenzen versehen. Anschließend durchläuft die RNA die Prozesse der Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung. Durch die Nutzung der Barcode-Informationen aus den Proben-Daten können wir die Daten genau ihrem relevanten Standort zuordnen und die Ursprünge der Daten aus spezifischen räumlichen Koordinaten feststellen. Letztendlich ermöglicht dieser Prozess die Visualisierung der räumlichen Genexpression.

Übersicht über den Visium-Raumanalysen-Workflow. (Dmitrii Shek et al.) Methoden Protokolle. 2023)

Räumliche Transkriptomik-Sequenzierung Experimentelle Schritte

Präzises Schneiden von frisch gefrorenen Gewebeproben wird durchgeführt, gefolgt von der Visualisierung mit fortschrittlichen Bildgebungstechniken.

Die Gewebeschnitte werden auf einem speziell gestalteten Objektträger platziert, der mit RNA-spezifischen Fangsonden beschichtet ist. Nach strengen Fixierungs- und Permeabilisierungsschritten wird sichergestellt, dass die mRNA aus den Zellen vollständig freigesetzt und spezifisch an die Fangsonden gebunden ist, was zu einer genauen Erfassung von Genexpressionsinformationen führt.

Erfasste RNA dient als Vorlage für die präzise cDNA-Synthese und die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek, wodurch die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der nachfolgenden Analyse gewährleistet wird.

Die vorbereiteten Sequenzierungsbibliotheken durchlaufen eine effiziente Sequenzierung für eine umfassende Erfassung von Genexpressionsinformationen.

Durch die Analyse von Datenvisualisierungen bestimmen wir präzise die exprimierten Gene, quantifizieren sie und interpretieren darüber hinaus ihre räumlichen Positionsinformationen.

Workflow für den Sequenzierungsdienst der räumlichen Transkriptomik

Visium Spatial Gene Expression für frisches gefrorenes Gewebe Service-Workflow

Visium Spatial Gene Expression für FFPE-Service-Workflow

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Frisches Gewebe: 6,5 mm³ FFPE: 6,5 mm³; DV200 > 50% Artenbereich: Mensch, Maus, Ratte. Für andere Arten konsultieren Sie bitte.
	Sequenzierung Sequenzierungsplattform: Illumina NovaSeq 6000 Sequenzierungsmuster: PE150 Sequenzierung Datenvolumen: ≥50k Lese-Paare pro Spot.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an, einschließlich: Rohsequenzdaten Bewertung der Datenqualität und Filterung von Sequenzierungsdaten Stichprobenqualitätskontrolle Datenanpassung Datenstandardisierung Punktclustering Spot-Untergruppenanalyse Markeranalyse Zelltypidentifikation Anatomische Regionsannotation Zellkommunikationsanalyse Inter-Sample-Differentialanalyse Differenzanalyse im Inter-Annotierungsbereich

Probenvorbereitung

Es ist wichtig, eine entscheidende Vorsichtsmaßnahme im Prozess der Probenvorbereitung zu erwähnen, insbesondere für Gewebeproben. Es wird empfohlen, das Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff zu vermeiden, da die schnelle Abkühlung potenziell schädlich für die Zellstrukturen sein kann. Stattdessen wird die Verwendung von in Pentan eingebettetem OTC für das schnelle Einfrieren von Gewebeproben offiziell von 10X Genomics empfohlen. In der praktischen Anwendung stoßen viele Forscher häufig auf Schwierigkeiten bei der Vorbereitung der Suspension während einzelner Zellexperimente. Trotz wiederholter Versuche bei der Verdauungsbearbeitung ist es nach wie vor mühsam, eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, die den Anforderungen für die Maschinenbenutzung entspricht. Selbst wenn man widerwillig mit dem Maschinenbetrieb fortfährt, könnten Risiken für suboptimale Zellbedingungen, unzureichende Zellaufnahme und die Komplikation von mehrzelligen Verunreinigungen bestehen. Im Vergleich dazu ist der Workflow von räumlichen Transkriptomik-Experimenten etwas optimiert. Unter der Anleitung erfolgreicher Unternehmen können nach einer angemessenen Einfrierung von Gewebeproben die nachfolgenden Schritte der Gewebeaufklärung, Färbung, Fixierung, Klärung, Bibliothekskonstruktion, Sequenzierung und Analyse usw. an professionelle Unternehmen übertragen werden. Dies könnte den Forschern eine erhebliche Menge an Zeit sparen.

Servicevorteile

Überlegene Qualität beim SchneidenMit umfangreicher Erfahrung im Schneiden und Montieren haben wir optimierte Lösungen für verschiedene Gewebe entwickelt.

Automatisierte AnalyseUnser gut etabliertes Analyseverfahren bietet eine schnelle und präzise Interpretation von räumlichen Transkriptomdaten.

Standardisierte QualitätskontrolleUnser Reichtum an praktischer Erfahrung hat zur Entwicklung eines standardisierten Qualitätskontrollsystems geführt.

Professionelles TeamUnser renommiertes technisches Team verfügt über jahrelange Erfahrung in der Planung von Projekten, im Laborbetrieb und in der Nachanalyse des Verkaufs.

Vollservice-AnsatzWir bieten ein umfassendes Spektrum an Dienstleistungen, das die Kryokonservierung und Einbettung von Gewebe, das Montieren, Schneiden, Klären, die Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung sowie die Datenanalyse umfasst.

Abbildung 1. Punktclusterung und Bildintegration. (Quelle: 10x Genomics)

Abbildung 2. Genexpressionsmuster in räumlicher Auflösung. (Quelle: 10x Genomics)

Abbildung 3. mRNA-Expression und Clusterkarte des räumlichen Transkriptoms. (Quelle: 10x Genomics)

• 1. Welche Arten von Gewebematerialien können wir verarbeiten?
  • Primär ermöglicht unsere Visium Spatial Gene Expression-Lösung die Untersuchung von Gewebeproben von Mensch und Maus, insbesondere solchen in Blockform oder auf Glasobjektträgern, egal ob gefärbt oder ungefärbt.
• 2. Wie groß sind die einzelnen Positionen auf dem Visium Spatial Slide?
  • Die Durchmesser der Flecken messen 55 µm.
• Bietet Visium einen Ansatz für die Einzelzellauflösung?
  • Obwohl jeder 55 µm Punkt in unserem aktuellen Visium-Setup ungefähr 10 Zellen erfasst, ermöglicht uns unsere bioinformatische Strategie, die Daten für eine Untersuchung auf Einzelzellebene zu dekodieren.
• 4. Wie ist der Erfassungsbereich auf dem Visium Spatial Slide organisiert?
  • Die verfügbaren Konfigurationen für den Erfassungsbereich sind entweder 6,5 mm x 6,5 mm oder 11 mm x 11 mm.

Räumliche Kartierung zeigt menschliche Adipozyten-Subpopulationen mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten.

Zeitschrift: Zellstoffwechsel

Impact-Faktor: 27,287

Veröffentlicht: 7. September 2021

Hintergrund

Weißes Fettgewebe (WAT) reguliert den Energiehaushalt durch Lipidspeicherung und die Sekretion von Faktoren. Seine Plastizität umfasst verschiedene Zelltypen, wobei eine gesunde WAT-Erweiterung Vaskularität, Adipozytenbildung und Immunantworten benötigt, während ungesundes WAT Hypertrophie und chronische Entzündungen zeigt, die zu Stoffwechselerkrankungen führen. Die räumliche Transkriptomik in Kombination mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung hat drei verschiedene Adipozytenpopulationen im menschlichen WAT identifiziert, die jeweils unterschiedliche hormonelle Reaktionen aufweisen und die Bedeutung der Adipozytenheterogenität in der hormonellen Sensitivität hervorheben.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Mit der 10x Genomics Visium Spatial Gene Expression-Plattform analysierten die Autoren subkutanes abdominales WAT von zehn Personen. Sie identifizierten 20 verschiedene Zellklassen, darunter Immun-, Gefäß- und Vorläuferzellen. Die Kombination aus räumlicher Transkriptomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung offenbarte drei Klassen reifer Adipozyten mit einzigartigen Gen-Signaturen. Diese Ergebnisse unterstreichen die zelluläre Heterogenität und räumliche Organisation innerhalb des WAT und erweitern das Verständnis seiner komplexen Struktur und Funktion.

Abbildung 1. Integrative Analysen von räumlichen und Einzelzell-Transkriptomdaten identifizieren 18 verschiedene Zellklassen im menschlichen WAT.

Die Autoren analysierten systematisch die zelluläre Organisation des weißen Fettgewebes (WAT) und entdeckten, dass Zellen sowohl homotypische als auch heterotypische Cluster bilden. Immunzellen, Adipozyten-Vorläufer und Gefäßzellen zeigten unterschiedliche Grade der homotypischen Clusterbildung. Darüber hinaus offenbarte die Studie räumliche Beziehungen zwischen verschiedenen Zellklassen. Diese Ergebnisse unterstreichen die komplexen und räumlich definierten Zell-Zell-Beziehungen innerhalb des WAT.

Abbildung 2. WAT-Residentenzellen zeigen große Variationen in der Neigung, homotypische Zellcluster zu bilden.

Abbildung 3. Bestimmte Zellpopulationen zeigen heterotypische Cluster im WAT.

Fazit

Die Autoren verwendeten hochauflösende räumliche Transkriptomik, um menschliches weißes Fettgewebe (WAT) zu kartieren und identifizierten 18 verschiedene Zellklassen, darunter Adipozytenvorläufer, Immunzellen, Gefäßzellen und reife Fettzellen. Sie entwickelten Algorithmen, um homotypische und heterotypische Zellcluster zu entdecken, und zeigten, dass WAT strukturell organisierter ist als bisher angenommen. Bemerkenswerterweise fanden sie heraus, dass nur eine der drei identifizierten reifen Adipozytenpopulationen signifikant auf hormonelle Stimuli reagierte. Diese Arbeit erweitert unser Verständnis der zellulären Architektur von WAT und deren Einfluss auf die hormonelle Sensitivität und bietet eine wertvolle Ressource für weitere Forschungen.

Referenz

1. Bäckdahl J, Franzén L, Massier L, et al. Räumliche Kartierung zeigt menschliche Adipozyten-Subpopulationen mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten. Zellstoffwechsel, 2021, 33(9): 1869-1882. e6.