Richtlinien zur Einreichung von Proben
Was ist T2T-Genomsequenzierung?
Das T2T-Genom bezieht sich auf eine lückenfreie Genomassemblierung, die von Telomer zu Telomer reicht, wobei nur in bestimmten Regionen wie ribosomaler DNA (rDNA), Geschlechtschromosomen und Zentromeren geringfügige Lücken erlaubt sind. Diese Genomassemblierung zeigt außergewöhnlich hohe Qualitätswerte (Q) für Genauigkeit und BUSCO-Werte für Vollständigkeit, mit minimalen strukturellen Fehlern zwischen den Rohdaten und der endgültigen Assemblierung.
Seit der Veröffentlichung der vollständigen Sequenz des menschlichen X-Chromosoms in Nature im Jahr 2020 arbeitet das T2T-Konsortium intensiv daran, das menschliche Genom zu verfeinern und zu perfektionieren. Im Jahr 2022 stellte das Konsortium die erste vollständige, lückenlose Sequenz des menschlichen Genoms vor. Dieser Meilenstein enthüllte hochidentische segmental duplizierte Regionen und deren Variationen innerhalb des menschlichen Genoms und markierte das erste Mal, dass diese Bereiche vollständig charakterisiert wurden. Dieser Meilenstein stellt den Beginn der T2T-Ära in der Genomassemblierung dar.
Warum T2T? Die Einschränkungen traditioneller Baugruppen
In der Geschichte der Genomik war "Referenzqualität" immer mit einem Sternchen versehen. Sogar das Benchmark-Referenzgenom des Menschen (GRCh38) ließ ungefähr 8 % der Sequenz unresolved aufgrund technologischer Einschränkungen. Diese fehlenden Teile sind kein "Junk-DNA" – sie sind biologisch signifikante Regionen, die angereichert sind mit:
- Zentromere und Telomere: Kritisch für die Chromosomenstabilität und Zellteilung.
- Segmentale Duplikationen: Hotspots für schnelle Evolution und krankheitsassoziierte Umstellungen.
- Satelliten und Wiederholungen: Komplexe Tandemwiederholungen, die von kurzen Reads nicht eindeutig zugeordnet werden können.
Die Veröffentlichung des T2T-CHM13 Das menschliche Genom markierte einen Paradigmenwechsel und bewies, dass eine lückenlose Assemblierung möglich ist. Bei CD GenomicsWir demokratisieren diese Technologie und wenden die gleichen rigorosen Strategien auf Ihre Forschungsspezies an. Durch die Erreichung einer echten T2T-Assemblierung erhalten Sie Zugang zur vollständigen Sequenz von einem chromosomalen Ende zum anderen, was die Entdeckung neuer struktureller Varianten (SVs) ermöglicht und eine perfekte Grundlage für Pan-Genom-Studien bietet.
Unsere Technologie-Strategie: Die HiFi + Ultra-Long Synergie
Die Erreichung eines lückenlosen Genoms erfordert eine strategische Kombination von Sequenzierungskapazitäten. Wir verwenden einen Ansatz zur "Hybridassemblierung", der Genauigkeit mit extremen Leseweiten in Einklang bringt.
1. PacBio HiFi-Sequenzierung (Der Genauigkeitsanker)
RolleBietet hochpräzise Langsequenzen (15-20 kb) mit über 99,9% Genauigkeit.
VorteilLöst die meisten Genomkomplexitäten, während sichergestellt wird, dass die Basisgenauigkeit (QV-Score) der endgültigen Assemblierung extrem hoch ist.
2. ONT Ultra-Langzeit-Sequenzierung (Der Brückenbauer)
RolleBietet ultra-lange Reads (bis zu 100 kb+ oder sogar im Mb-Bereich).
VorteilUmfasst die größten repetitiven Regionen (wie ribosomale DNA-Arrays und Zentromere), die selbst von HiFi-Reads nicht überbrückt werden können. Dies "verankert" die Contigs effektiv in vollständige Chromosomen.
3. Hi-C / Bionano (Der Gerüstarchitekt)
RolleErfasst langreichweitige Chromatin-Interaktionen.
VorteilOrdnet und orientiert Contigs in chromosomale Scaffolds und korrigiert dabei eventuelle strukturelle Fehlassemblierungen.
T2T-Assemblierungsstrategie, die die Genauigkeit von PacBio HiFi mit den ultralangen Reads von Oxford Nanopore kombiniert, um Zentromere und genomische Lücken zu lösen.
Serviceportfolio: Maßgeschneiderte T2T-Lösungen
CD Genomics bietet eine Vielzahl flexibler T2T-Genomsequenzierungsdienstleistungen an, um unterschiedlichen Forschungszielen und Budgetanforderungen gerecht zu werden:
- T2T Genomsequenzierung
Durch die Integration fortschrittlicher Technologien wie der Sequenzierung der dritten Generation und Hi-C wird eine "0-Lücken" T2T-Assemblierung für ein oder mehrere Chromosomen erreicht.
- Haplotype-resolvierte T2T-Genomsequenzierung
Es umfasst haplotypenaufgelöste Genomassemblierung, die die von jedem Elternteil vererbten Chromosomen unterscheidet und somit die vollständigen genetischen Informationen sowohl von väterlichen als auch von mütterlichen Quellen erhält.
1. Wirbeltier T2T Genomsequenzierung
Wir bieten drei Ebenen von Assemblierungsstrategien an, um Ihr Budget und Ihre Kontinuitätsziele zu erfüllen.
| Strategieebene | Technologiekombination | Ideale Anwendung |
|---|---|---|
| Foundation T2T | PacBio HiFi nur | Hochwertige Assemblierung für weniger repetitive Wirbeltiergenome; hervorragende Genraumvollständigkeit. |
| Fortgeschrittenes T2T | PacBio HiFi + ONT Ultra-lang | Empfohlen zur Lösung komplexer Wiederholungen, Zentromere und zur Erreichung nahezu lückenloser Kontinuität. |
| Platin T2T | PacBio HiFi + ONT Ultra-lange + Hi-C | Der ultimative Standard. Verankert Sequenzen an Chromosomen für ein echtes Telomere-zu-Telomere-Finish. |
2. Pflanzen T2T Genomsequenzierung
Pflanzen stellen einzigartige Herausforderungen dar: hohe Ploidie, massive repetitive Elemente und extreme Heterozygotie. Unsere Pipelines gehen speziell auf diese Hürden ein.
ZielKomplexe Pflanzen, Heilpflanzen und evolutionäre Modelle.
StrategieWir nutzen hochauflösende HiFi-Sequenzierung, um zwischen Haplotypen in polyploiden Arten zu unterscheiden, kombiniert mit ultralangen Reads, um massive Transposonregionen, die in Pflanzengenomen häufig vorkommen, abzudecken.
3. Bakterielle T2T-Genomsequenzierung
Für die Mikrobiologie bedeutet "T2T", ein einzelnes, geschlossenes zirkuläres Chromosom und vollständig assemblierte Plasmide ohne Lücken zu erreichen.
MethodikHybrider Ansatz unter Verwendung von PacBio/ONT Lange Reads für die Montage + Illumina Kurzlesungen (optional) zur Politur (Pilon-Korrektur).
Liefergegenstand0 Lücken, vollständige Plasmidzusammenstellung, Methylierungsmuster.
T2T-Sequenzierungsdienst-Workflow
Bei CD Genomics bieten wir einen nahtlosen, durchgängigen Service für die gesamte Genomsequenzierung an, der darauf ausgelegt ist, konsistente, hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Unser standardisierter Workflow – von der Probenübermittlung bis zur Datenlieferung – ist darauf ausgelegt, die Reproduzierbarkeit zu unterstützen, die Forschung zu optimieren und die Entdeckung in allen Arten von Studien zu beschleunigen.
- ProbenvorbereitungDie Extraktion von hochmolekularer DNA (HMW) ist entscheidend. Wir stellen sicher, dass die Fragmente lang genug für den Ultra-langen Bibliotheksaufbau sind.
- BibliotheksbauParallelvorbereitung von SMRTbell-Bibliotheken (PacBio) und LSK/ULK-Bibliotheken (ONT).
- SequenzierungHochdurchsatz-Sequenzierung auf den Plattformen PacBio Revio/Sequel IIe und Oxford Nanopore PromethION.
- VersammlungNutzung von T2T-spezifischen Assemblierern (z. B. Hifiasm, Verkko), um Datentypen zu integrieren.
- Polieren & QualitätssicherungFehlerkorrektur und strenge Bewertung mithilfe von QV-Werten und Busco.
- AnnotationGenvorhersage und funktionale Annotation der neu entdeckten Regionen.
Abbildung 1. Der T2T-Workflow von CD Genomics.
T2T Genomsequenzierung Bioinformatikanalyse
CD Genomics bietet umfassende und flexible Bioinformatikanalyse-Dienstleistungenvon grundlegender Datenverarbeitung bis hin zu fortgeschrittenen maßgeschneiderten Analysen.
- Versammlungsgrafbewertung: Überprüfung des Graphen auf Konnektivität und Auflösung von Verwicklungen.
- Kontinuitätsmetriken: Contig N50 und Scaffold N50. In erfolgreichen T2T-Projekten nähert sich der Contig N50 oft der Größe des Chromosoms selbst an.
- Vollständigkeit (BUSCO): Bewertung des Geninhalts, um sicherzustellen, dass essentielle Gene vorhanden sind (>98% Ziel).
- Genauigkeit (QV & Merqury): K-mer basierte Bewertung zur Sicherstellung der Basisgenauigkeit (Zielbereich Q50-Q70).
- Strukturelle Konsistenz: Mapping von Hi-C-Daten um die korrekte Ausrichtung und Reihenfolge der Contigs zu bestätigen.
T2T-Genomsequenzierung Anwendungen
Es ermöglicht Forschern, zuvor unzugängliche strukturelle Variationen, neuartige Gene und funktionale Elemente zu identifizieren – und treibt Durchbrüche in der Landwirtschaft, Medizin und Evolutionsbiologie voran.
Entdeckung neuer Gene und Variationen:
T2T-Sequenzierung ermöglicht die Identifizierung zuvor unbekannter Gene und struktureller Variationen, wodurch unser Verständnis von genetischer Vielfalt und Krankheitsmechanismen verbessert wird.
Untersuchung der chromosomalen und telomeralen Endregion:
Die T2T-Sequenzierung offenbart die genetische Zusammensetzung von Telomeren und Zentromeren und verbessert das Verständnis von chromosomalen Anomalien und Vererbungsmustern.
Wiederholende und komplexe genomische Sequenzen:
T2T-Sequenzierung löst die Herausforderungen der Kartierung von repetitiven und komplexen genomischen Regionen und liefert genaue Daten über schwer zu sequenzierende Bereiche wie segmentale Duplikationen.
Pflanzen- und Agrarforschung:
T2T-Sequenzierung unterstützt die Pflanzen-Genomforschung, indem sie genetische Variationen im Zusammenhang mit Wachstum, Stressresistenz und Krankheiten kartiert, was der Pflanzenzüchtung und der Gentechnik zugutekommt.
Molekulare und Funktionelle Genomik:
Die Technik hilft, die funktionalen Rollen von Genen zu verstehen, die an wesentlichen biologischen Prozessen wie der Immunantwort und der Entwicklung beteiligt sind.
Musteranforderungen
| Probenart | Benötigter Betrag | Konzentration | Reinheit / Integrität |
|---|---|---|---|
| Genomisches DNA | ≥15μg | ≥60ng/μL | OD260/280 = 1,8-2,0; Keine RNA/Protein-Kontamination. |
| Gewebeproben | Pflanze: >5 g Tier: >5 gZelle: 1×108 |
N/V | Frisch oder mit flüssigem Stickstoff gefroren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. |
| Blut | ≥10 ml | N/V | Frisch, mit EDTA-Antikoagulans (kein Heparin). |
Hinweis: Für die HMW-DNA-Extraktion wird frisches Gewebe immer bevorzugt, um die Fragmentlänge zu maximieren.
Was Sie erhalten werden
- Rohdaten-Dateien (FASTQ)
- Ausrichtungsdateien (BAM) und Variationsdateien (VCF)
- Statistische und Annotationsberichte (PDF + Excel)
- Grafische Analyseergebnisse
- Projektdokumentation und Nutzungshinweise
Warum CD Genomics für T2T-Genomsequenzierung wählen?
Von fortschrittlichen Sequenzierungsplattformen bis hin zu hochwertiger Datenlieferung bietet CD Genomics eine effiziente, umfassende Lösung, die auf verschiedene Forschungsbedürfnisse zugeschnitten ist. Egal, ob Sie nicht-modellorganismen erkunden oder neuartige Forschungsbereiche erschließen, unser Team sorgt für zuverlässige Ergebnisse mit flexibler Unterstützung.
- Fortgeschrittene Technologie: Wir verwenden die neuesten Technologien der dritten Generation für Sequenzierung und Hi-C, um die genauesten und vollständigsten Genomassemblierungen bereitzustellen.
- Hohe Genauigkeit und VollständigkeitUnsere T2T-Sequenzierung liefert ein lückenfreies, fehlerfreies Genom mit hoher Genauigkeit und Vollständigkeit.
- Anpassbare DienstleistungenWir bieten flexible Sequenzierungsoptionen, die auf Ihre spezifischen Forschungsbedürfnisse zugeschnitten sind.
- Experte für BioinformatikUnser Bioinformatik-Team sorgt dafür, dass Ihre Daten mit den besten Werkzeugen analysiert werden, um klare und umsetzbare Erkenntnisse zu liefern.
- Nachgewiesene ErfolgsbilanzCD Genomics verfügt über jahrelange Erfahrung in der Bereitstellung zuverlässiger, hochwertiger genomischer Daten in verschiedenen Bereichen.
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Q1: Was ist der Hauptunterschied zwischen "Reference Grade" und "T2T Grade" Genomen?
EinDer Standard "Referenzqualität" bezieht sich oft auf hochwertige Assemblierungen, die dennoch Lücken (Gerüste) enthalten. T2T Note strebt nach "Null Lücken" über das gesamte Chromosom, einschließlich der schwierigen zentromeren und telomeren Regionen. T2T bietet die höchstmögliche Auflösung des Genoms.
Q2: Warum kombinieren Sie PacBio HiFi- und ONT Ultra-long-Daten?
EinDies ist der Ansatz "Das Beste aus beiden Welten". PacBio HiFi bietet die notwendigen Genauigkeit Fehler zu korrigieren und kleine Wiederholungen zu beheben, während ONT Ultra-Langlese die Länge benötigt, um massive sich wiederholende Regionen zu überbrücken, die die Länge von HiFi-Reads überschreiten. Diese Kombination ist derzeit die effektivste Methode für eine lückenlose Assemblierung.
Q3: Kann T2T-Sequenzierung auf polyploide Pflanzen angewendet werden?
EinJa. T2T-Strategien sind besonders effektiv für Polyploide. Die hohe Genauigkeit von HiFi-Lesungen ermöglicht es uns, zu trennen Haplotypen (phasend) effektiv, um sicherzustellen, dass Subgenome deutlich assemblierte werden, anstatt in eine mosaikartige Sequenz zusammengefasst zu werden.
Q4: Brauche ich immer Hi-C-Daten?
EinFür T2T-Projekte bei Wirbeltieren und Pflanzen, Hi-C wird dringend empfohlen.Während HiFi+ONT massive Contigs erstellen kann, liefert Hi-C die physikalischen Verknüpfungsinformationen, um diese Contigs definitiv in Chromosomen-große Gerüste anzuordnen. Für Bakterien ist Hi-C in der Regel nicht notwendig.
Fallstudie: Lückenfreie T2T-Genomassemblierung der Oktoploiden Erdbeere (Fragaria × ananassa)
Quelle: Adaptierte von Ran, K., et al. (2024). Gartenbau Forschung.Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von externen Links nicht abrufen oder übersetzen. Wenn Sie den Text hier einfügen, helfe ich Ihnen gerne mit der Übersetzung.
1. Hintergrund
Kultivierte ErdbeereErdbeere) ist eine allo-octoploide Art (2n=8x=56) mit einem hochkomplexen Genom, das vier Subgenome umfasst. Traditionelle Referenzassemblierungen waren aufgrund der hohen Heterozygotie und repetitiven Elemente fragmentiert, was es schwierig machte, zwischen den Subgenomen zu unterscheiden. Die Forscher hatten das Ziel, ein haplotyp-resolviertes, lückenfreies T2T-Genom um die genetische Divergenz zwischen diesen Subgenomen zu entschlüsseln.
2. Methoden
Die Studie verwendete eine hochmoderne hybride Sequenzierungsstrategie, die perfekt mit dem "Platinum T2T"-Workflow übereinstimmt:
- PacBio HiFi-SequenzierungGenerierte hochauflösende Langsequenzen (~38 Gb, 46× Abdeckung), um das primäre Contig-Rückgrat zu erstellen.
- ONT Ultra-Langzeit-SequenzierungProduzierte ultra-lange Reads (N50 > 50 kb), um große repetitive Lücken zu überbrücken.
- Hi-C TechnologieVerwendete Hi-C-Daten, um Sequenzen in 56 verschiedene Chromosomen zu verankern und die Haplotypen zu phasieren.
3. Ergebnisse
Die resultierende Assemblierung erreichte einen Meilenstein in der Polyploid-Genomik:
- Lückenlose MontageAlle 56 Chromosomen wurden von Telomer zu Telomer assembliert mit 0 Lücken.
- HaplotypenauflösungErfolgreich wurden die vier Subgenome (A, B, C, D) phasiert, wobei festgestellt wurde, dass Subgenom A die meisten Gene und die höchsten Expressionsniveaus behält.
- Epigenetische EntdeckungDie lückenlose Montage ermöglichte eine präzise Kartierung der DNA-Methylierungsmuster und deckte Unterschiede in der Stummschaltung von transponierbaren Elementen (TE) zwischen den Subgenomen auf.
Lückenfreie T2T-Genomassemblierung von oktaploider ErdbeereErdbeere × ananassa Der Circos-Plot veranschaulicht die 56 Chromosomen, die in vier Subgenome ohne Lücken aufgelöst sind.
4. Schlussfolgerungen
Diese Studie beweist, dass die Kombination aus PacBio HiFi und ONT ultra-langen Reads selbst die komplexesten polyploiden Genome auflösen kann. Die T2T-Assemblierung bietet eine grundlegende Ressource für die molekulare Züchtung von Erdbeeren, insbesondere zur Identifizierung von Genen, die mit der Fruchtentwicklung und Krankheitsresistenz in Zusammenhang stehen.
Referenzen:
- Miga, Karen H., et al. "Telomer-zu-Telomer-Versammlung eines vollständigen menschlichen X-Chromosoms." Natur 585,7823 (2020): 79-84. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie den Text hier einfügen, helfe ich Ihnen gerne bei der Übersetzung.
- Nurk, Sergey, et al. "Die vollständige Sequenz eines menschlichen Genoms." Wissenschaft 376.6588 (2022): 44-53. DOI: 10.1126/science.abj6987
- Wang, Xiaoxuan, et al. "Die vollständige Genomassemblierung liefert Einblicke in die Zentromerarchitektur des Kürbis (Cucurbita maxima).. Molekulare Pflanzenwissenschaften 17.4 (2024): 773-786. https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100935
- Hu, Fengkun, et al. "Das telomer-zu-telomer-lückenlose Genom des Graskarpfens bietet Einblicke für die genetische Verbesserung." Wissenschaft China Lebenswissenschaften (2025). doi: 10.1093/gigascience/giaf059
