Richtlinien zur Einreichung von Proben
Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst
Die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung revolutioniert das Gebiet der Transkriptomik durch die Bereitstellung unvergleichlicher Einblicke in die Genexpression und -regulation auf Einzelzellebene. Dieser ausgeklügelte Ansatz ist unerlässlich, um komplexe biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen zu erhellen, die häufig durch traditionelle Bulk-RNA-Sequenzierung verschleiert werden.
CD Genomics führt diese innovative Grenze an, indem es hochmoderne Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienste anbietet. Durch die Nutzung fortschrittlicher Technologien wie PacBio MAS-Seq erzielt CD Genomics hochauflösende, vollständige Isoformdaten und fördert damit unser Verständnis von zellulärer Heterogenität und molekularer Komplexität.
Was ist die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung?
Die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung (scIso-Seq) ist eine robuste Technik zur Analyse des Transkriptoms einzelner Zellen und enthüllt somit die komplexen Nuancen der Genexpression und der Splicing-Variationen, die der zellulären Vielfalt und Funktion zugrunde liegen. Im Gegensatz zur herkömmlichen RNA-Sequenzierung, die Genexpressionsprofile aus einer Zellpopulation aggregiert, bewahrt scIso-Seq die Heterogenität zwischen einzelnen Zellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung einzigartiger Isoformen und Splice-Varianten, die potenziell entscheidend für Gesundheit und Krankheit sind, und bietet tiefere Einblicke in die molekularen Grundlagen biologischer Prozesse.
Bedeutung der Einzelzell-Isoform-Sequenzierung
Die Komplexität des Transkriptoms, definiert durch verschiedene Spleißereignisse und Isoformen, beeinflusst das Zellverhalten und die Funktion erheblich. Traditionelle Methoden der Kurzlesesequenzierung stoßen oft an ihre Grenzen, wenn es darum geht, diese Komplexitäten aufzulösen, da sie nicht in der Lage sind, vollständige Transkripte zu erfassen. Im Gegensatz dazu bietet scIso-Seq einen umfassenden Überblick über das gesamte Transkript, vom 5'-Transkriptionsstartpunkt bis zum 3'-Poly-A-Schwanz, und deckt wichtige Informationen über Exon-Nutzung, Spleißstellen und untranslatierte Regionen (UTRs) auf. Dieses Maß an Detailgenauigkeit ist entscheidend für eine präzise Genannotation, das Verständnis regulatorischer Mechanismen und die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.
PacBio MAS-Seq für die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung
Die Multiplexed Arrays Sequencing (MAS-Seq) von PacBio stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Isoform-Sequenzierung auf Einzelzellebene dar. Durch die Kombination von Full-Length cDNA-Synthese mit den Möglichkeiten der Langsequenzierung überwindet MAS-Seq die Einschränkungen traditioneller Kurzleseverfahren und verbessert die Auflösung sowie den Durchsatz der Einzelzelltranskriptomik.
Prinzip der MAS-Seq
MAS-Seq umfasst die Verkettung von vollständigen cDNA-Molekülen zu größeren Fragmenten, die dann sequenziert werden mit PacBios hochpräzise (HiFi) LanglesetechnologieDer Prozess beginnt mit der Generierung von Einzelzell-cDNA, gefolgt von der Entfernung von Template-Switching-Oligos (TSOs) und der Verkettung von cDNA-Molekülen zu geordneten Arrays. Diese Arrays werden mit MAS-Adaptern ligiert und auf PacBio-Plattformen wie Sequel II/IIe und Revio-Systemen sequenziert.
Die resultierenden HiFi-Lesungen werden bioinformatisch segmentiert, um die ursprünglichen cDNA-Sequenzen abzurufen, was hohe Genauigkeit und Durchsatz gewährleistet. Diese Methode beseitigt die Notwendigkeit von Fragmentierung und Kurzleseassemblierung und bietet eine direkte und umfassende Sicht auf das Transkriptom auf Einzelzellebene.
Vorteile von MAS-Seq
- Vollständige Isoform-InformationenMAS-Seq erfasst vollständige Isoformen, einschließlich aller exons, Spleißstellen und UTRs, und bietet eine detaillierte Karte des Transkriptoms.
- Hohe DurchsatzleistungDie Konkatenationsstrategie erhöht den Durchsatz erheblich und ermöglicht die Sequenzierung mehrerer cDNA-Moleküle in einem einzigen Durchlauf. Diese Effizienz ist besonders vorteilhaft für großangelegte Studien und komplexe Gewebe.
- Genauer ZellbarcodeMAS-Seq integriert Einzelzell-Barcoding und einzigartige Tags, um eine präzise Quantifizierung und Identifizierung einzelner Transkripte zu gewährleisten.
- Kosten-EffektivitätDurch die Maximierung der Sequenzierungskapazität senkt MAS-Seq die Kosten pro Zelle und pro Isoform, was es zu einer praktikablen Option für umfangreiche Einzelzellstudien macht.
- Eliminierung der orthogonalen SequenzierungMAS-Seq bietet umfassende Isoformdaten unabhängig an, optimiert den Arbeitsablauf und reduziert die Komplexität.
- Erweiterte Isoform-ErkennungDie Fähigkeit von MAS-Seq, vollständige Isoformen zu erfassen, bietet einen umfassenden Überblick über alternative Spleißereignisse, Fusionsgene und andere transkriptomische Variationen, die häufig von der Kurzlesesequenzierung übersehen werden.
- Hochauflösende DatenDie in MAS-Seq verwendete Long-Read-Technologie bietet eine hohe Auflösung und Genauigkeit, die die Identifizierung subtiler transkriptomischer Veränderungen und seltener Isoformen ermöglicht, die für das Verständnis zellulärer Funktionen und Krankheitsmechanismen entscheidend sind.
- Optimierter ArbeitsablaufMAS-Seq vereinfacht den Sequenzierungsworkflow und reduziert die Zeit, die Kosten und die Komplexität von Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsprojekten.
- Kompatibilität und FlexibilitätDas MAS-Seq-Kit ist mit cDNA kompatibel, die aus dem 10x Chromium-System erzeugt wurde, was es anpassungsfähig für verschiedene Einzelzell-Sequenzierungsanwendungen macht. Seine Flexibilität ermöglicht es Forschern, eine Vielzahl von biologischen Proben und experimentellen Bedingungen zu untersuchen.
- Robuste BioinformatikunterstützungPacBio bietet umfassende bioinformatische Werkzeuge zur Verarbeitung von MAS-Seq-Daten, einschließlich Lesesegmentierung, Korrektur einzigartiger Tags und Isoformklassifizierung. Diese Werkzeuge gewährleisten eine genaue und effiziente Datenanalyse und erleichtern nachgelagerte Anwendungen und Erkenntnisse.
Abbildung 1. Einzelzell-Isoform-aufgelöste Sequenzierung von Einzelzellen mit MAS-ISO-seq.
Anwendungen und Auswirkungen von MAS-Seq
Die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung unter Verwendung von MAS-Seq hat bedeutende Implikationen in mehreren Bereichen der biologischen Forschung und Medizin. Im Kontext der Krebsforschung erleichtert diese Technologie die Identifizierung von isoformspezifischen Mutationen und Spleißereignissen, die der Tumorentstehung und der Therapieresistenz zugrunde liegen. In der Neurobiologie ermöglicht sie eine detaillierte Untersuchung der neuronalen Vielfalt und die Erkennung von Isoformvariationen, die mit neurologischen Störungen verbunden sind. Darüber hinaus erweist sich MAS-Seq in der Pflanzen-Genomik als äußerst wertvoll, da es zur Aufklärung komplexer Transkriptome in Arten mit umfangreichen und vielfältigen Genomen beiträgt.
Unser Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst von MAS-Seq
Bei CD Genomics nutzen wir die fortschrittliche MAS-Seq-Technologie, um eine unvergleichliche Auflösung in der transkriptomischen Analyse zu bieten. Unser Service erfasst vollständige Isoformen und ermöglicht ein umfassendes Verständnis von alternativer Spleißung, Genfusionsevents und anderen transkriptomischen Variationen, die oft durch herkömmliche Sequenzierungsmethoden verschleiert werden.
Neben unseren fortschrittlichen Isoform-Sequenzierungsfähigkeiten verpflichten wir uns, hochwertige Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Einzelzell-DNA-Sequenzierung, Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung und 10X Genomics Einzelzell-Sequenzierung anzubieten. Diese vielseitige Plattform ermöglicht es uns, ein breites Spektrum an Forschungsbedürfnissen zu bedienen und detaillierte Einblicke in die Genexpression, genetische Variationen und epigenetische Modifikationen auf Einzelzellebene zu liefern.
MAS-Seq-Datenanalyse-Workflow und Inhalt
| Schritt | Beschreibung | Einzelheiten |
|---|---|---|
| Datenvorverarbeitung | Konvertieren Sie MAS-Seq-Daten in ein verwendbares Analyseformat und fügen Sie relevante Metadaten hinzu. | - Quantifizierte und verarbeitete RNA-Capture- und Antikörper-Capture-Bibliotheken. - Konservativen Zellidentifikation angesprochen, um mehr lebensfähige Tröpfchen zu erhalten. - Nicht-immunkompetente Zellen und Doppelzellen entfernt. - Log-transformierte Antikörperfangzahlen für weitere Analysen. |
| Datenintegration | Integrieren Sie Lang- und Kurzlesedaten, um Konsistenz und eine hochwertige gemeinsame Analyse sicherzustellen. | - Konvertierte Isoformen-zählmatrizen für die Analyse. - Neu geschriebene Transkripte und Gene auf bekannte Annotationen abgebildet. - Markierte mehrdeutige Transkripte und kreuzreferenzierte Rezeptorgene. - Harmonisierte Datensätze durch Beibehaltung gemeinsamer Zell-Barcodes, was eine hohe Identifikationsgenauigkeit erreicht. |
| Normalisierung, Clustering und Einbettung | Normalisieren Sie die Daten, identifizieren Sie hochvariable Merkmale und führen Sie eine Clusteranalyse durch. | - Angewandte varianzstabilisierende Transformation auf Zählungen. - Ausgewählte Top-Gene/Isoformen als hochvariable Merkmale. - Reduzierter Funktionsumfang durch Hauptkomponentenanalyse. - Konstruiertes nächster Nachbar-Graph für Einbettung und Clustering. - Durchführung der differentiellen Genexpressionsanalyse. |
| Differenzielle Expressionsanalyse | Identifizieren Sie differentielle Expressionsgene zwischen verschiedenen Zelltypen und annotieren Sie Zellpopulationen. | - Durchführung einer differentiellen Expressionsanalyse zur Identifizierung von Expressionsunterschieden zwischen verschiedenen Zelltypen. |
| Analyse der evolutionären Trajektorie | Verwenden Sie die Diffusions-Pseudotime-Analyse (DPT), um die Entwicklungswege von Zellen abzubilden. | - Durchführung einer Diffusions-Pseudotime-Analyse zur Bestimmung von Zellzustandsübergängen. - Verwendete transformierte Zählungen für eine klarere grafische Darstellung. |
| CD45 Isoform-Annotierung Verfeinerung | Verfeinern Sie die GENCODE-Anmerkungen, um die Spezifität der Isoformzuweisungen zu verbessern. | - Verfeinerte unvollständige Genannotationen - Verbesserte Spezifität bei Isoformzuweisungen durch verbesserte Methoden. - Eingesetzte entscheidungsbasierte Zuordnung zur genauen Isoformdetektion. |
| Identifikation von unterschiedlich gespleißten Genen | Führen Sie globale und cluster-resolute statistische Tests für differenzielle Spleißung durch, um differenzielle Isoformnutzung in Zellpopulationen zu identifizieren. | - Durchführung globaler differentieller Spleißtests und clusteraufgelöster differentieller Spleißtests zur Identifizierung unterschiedlicher Isoformnutzung in verschiedenen Zellclustern. - Angepasste p-Werte für die Fehlerentdeckungsrate (FDR), um die statistische Robustheit zu gewährleisten. |
Ablauf unseres Services
Probenvorbereitung: Einzelzell-Suspensionen werden hergestellt und mit dem 10x Chromium Next GEM Single Cell 3'-Kit verarbeitet, um cDNA zu erzeugen.
cDNA-Synthese und Reinigung: Vollständige cDNA-Moleküle werden synthetisiert und gereinigt, um Template-Switching-Oligos (TSOs) zu entfernen.
Konkatenation und Adapterligatur: cDNA-Moleküle werden in geordnete Arrays konkatenisiert, und MAS-Adapter werden ligiert, um das Sequenzieren zu erleichtern.
Long-Read-Sequenzierung: Die vorbereiteten cDNA-Bibliotheken werden auf PacBio-Plattformen sequenziert, wie z.B. Sequel II/IIe oder Revio-Systemen, die hochpräzise lange Reads erzeugen.
Datenanalyse: Die HiFi-Lesungen werden bioinformatisch segmentiert, um die ursprünglichen cDNA-Sequenzen abzurufen, gefolgt von einer detaillierten Analyse des Isoformgehalts, alternativer Spleißung und Genfusionen.
Abbildung 2. MAS-ISO-seq Arbeitsablauf
Musteranforderung
Zellviabilität: Eine hohe Zellviabilität (>90%) ist entscheidend für die Erstellung qualitativ hochwertiger Einzelzell-cDNA-Bibliotheken.
Zellzahl: Eine Mindestanzahl von 1.000 Zellen wird empfohlen, um eine umfassende Abdeckung und eine genaue Isoformquantifizierung zu erreichen.
Probenreinheit: Proben sollten frei von Verunreinigungen und Rückständen sein, um Interferenzen mit dem Sequenzierungsprozess zu vermeiden.
RNA-Integrität: Eine hohe RNA-Integrität (RIN > 7) ist entscheidend für die Erzeugung von vollwertigen cDNA-Molekülen.
Wie stellen Sie die Datengenauigkeit und -qualität sicher?
Wir nutzen die hochpräzise Sequenzierungstechnologie von PacBio und robuste bioinformatische Werkzeuge, um hohe Genauigkeit und Qualität in unseren Datenoutputs sicherzustellen. Darüber hinaus führt unser Expertenteam während des gesamten Workflows strenge Qualitätskontrollen durch.
Können Sie seltene und niedrig-abundante Isoformen analysieren?
Ja, MAS-Seq ist hochsensibel und in der Lage, seltene und niedrig-abundante Isoformen zu erkennen, wodurch eine umfassende Sicht auf das Transkriptom ermöglicht wird.
Welche Arten von Proben können Sie verarbeiten?
Wir können eine Vielzahl von Einzelzellproben verarbeiten, einschließlich solcher aus Geweben, Zelllinien und primären Zellen. Bitte kontaktieren Sie uns für spezifische Probenanforderungen und Empfehlungen.
Was ist die minimale Anzahl an Zellen, die für das Einzelzell-Isoform-Sequenzieren erforderlich ist?
Für optimale Ergebnisse empfehlen wir mindestens 1.000 Zellen. Dies gewährleistet eine umfassende Abdeckung und eine genaue Quantifizierung der Isoformen. Wir können jedoch auch mit kleineren Zellzahlen arbeiten, falls erforderlich, was jedoch die Tiefe der Analyse beeinträchtigen kann.
Welche Sequenzierungsplattformen verwenden Sie für die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung?
Wir verwenden die PacBio Sequel II/IIe oder Revio Systeme für die Einzelzell-Isoform-Sequenzierung. Diese Plattformen bieten hochpräzise Langsequenzen, die eine genaue und detaillierte Isoform-Analyse gewährleisten.
Wie gehen Sie mit Datenschutz und Sicherheit um?
Bei CD Genomics legen wir großen Wert auf Datenschutz und Sicherheit. Alle Daten werden auf sicheren Servern mit eingeschränktem Zugang gespeichert, und wir halten uns an strenge Datenschutzprotokolle, um die Vertraulichkeit der Informationen unserer Kunden zu gewährleisten.
Können Sie Unterstützung bei der Dateninterpretation bieten?
Ja, unser Expertenteam für Bioinformatik steht zur Verfügung, um bei der Dateninterpretation zu helfen. Wir bieten umfassende Unterstützung, um Ihnen zu helfen, die Ergebnisse zu verstehen, einschließlich detaillierter Berichte und Beratungsdienste.
Welche Probenarten sind mit Ihrem Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst kompatibel?
Unser Service ist mit verschiedenen Einzelzellproben kompatibel, einschließlich frischer und gefrorener Gewebe, Zelllinien und primären Zellen. Wenn Sie spezifische Probenarten haben, kontaktieren Sie uns bitte für detaillierte Empfehlungen.
Welche Art von bioinformatischer Analyse bieten Sie an?
Unsere bioinformatische Analyse umfasst die Korrektur einzigartiger Tags, die Klassifizierung von Isoformen, die Analyse alternativer Spleißvorgänge, die Erkennung von Genfusionen und die Analyse der differentiellen Expression. Wir bieten umfassende Berichte mit Visualisierungen an, um die Dateninterpretation zu erleichtern.
Wie sollten Proben vorbereitet und versendet werden?
Proben sollten als Einzelzellensuspensionen mit hoher Lebensfähigkeit und Reinheit vorbereitet werden. Für den Versand empfehlen wir die Verwendung von Trockeneis und geeigneter Verpackung, um die Integrität der Proben während des Transports zu gewährleisten. Detaillierte Richtlinien zur Probenvorbereitung und zum Versand werden auf Anfrage bereitgestellt.
Kann Ihr Service neuartige Isoformen identifizieren?
Ja, unser Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst ist darauf ausgelegt, neuartige Isoformen zu identifizieren. Die hochauflösenden Daten, die durch MAS-Seq erzeugt werden, ermöglichen die Entdeckung zuvor uncharakterisierter Isoformen und verbessern unser Verständnis des Transkriptoms.
Ist Ihr Service für klinische Forschung geeignet?
Unser Service ist ausschließlich für Forschungszwecke gedacht und eignet sich nicht für klinische Diagnosen oder Tests. Er ist jedoch äußerst wertvoll für Forschungsanwendungen, einschließlich Krebsforschung, Studien zu seltenen Krankheiten und personalisierter Medizin.
Was kostet Ihr Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst?
Die Kosten für unseren Service variieren je nach Projektumfang, Anzahl der Proben und spezifischen Anforderungen. Bitte kontaktieren Sie uns für ein detailliertes Angebot, das auf Ihre Bedürfnisse zugeschnitten ist.
Bieten Sie maßgeschneiderte Lösungen für spezifische Forschungsbedürfnisse an?
Ja, wir bieten maßgeschneiderte Lösungen, um spezifische Forschungsbedürfnisse zu erfüllen. Unser Team wird mit Ihnen zusammenarbeiten, um einen individuellen Ansatz zu entwickeln, der Ihre einzigartigen Forschungsziele und Herausforderungen berücksichtigt.
Wie kann ich mit dem Einzelzell-Isoform-Sequenzierungsdienst von CD Genomics beginnen?
Um loszulegen, kontaktieren Sie uns einfach mit Ihren Projektdetails und Anforderungen. Unser Team wird eine Beratung anbieten, um Ihre Bedürfnisse zu besprechen und die nächsten Schritte für die Einreichung von Mustern und den Projektstart zu skizzieren.
Referenz
- Al'Khafaji, A.M., Smith, J.T., Garimella, K.V. et al. Hochdurchsatz-RNA-Isoform-Sequenzierung mittels programmierter cDNA-Verkettung. Nat Biotechnol 42, 582–586 (2024).
