Richtlinien zur Einreichung von Proben
Was ist PhIP-Seq?
Phagen-Immunopräzipitations-Sequenzierung ist eine immunologische Technologie, die die Leistungsfähigkeit der Phagenanzeige mit der Tiefe der Next-Generation-Sequenzierung verbindet. Die Plattform kodiert proteomweite Peptidbibliotheken – Hunderttausende von überlappenden Peptidfliesen – in T7-Bakteriophagen-Genomen unter Verwendung der Oligonukleotidbibliotheksynthese (OLS). Jedes Phagenpartikel zeigt ein definiertes Peptid auf seiner Oberfläche und trägt den entsprechenden DNA-Barcodes in seinem Genom.
Wenn das Serum oder Plasma des Patienten mit der Phagenbibliothek inkubiert wird, binden Antikörper an Phagenpartikel, die ihre entsprechenden Peptidantigene anzeigen. Diese Antikörper-Phagen-Komplexe werden mit Protein A/G-Magnetperlen isoliert, die gefangene Phagen-DNA wird durch PCR amplifiziert, Proben-Barcodes werden integriert und der angereicherte Pool wird mittels Illumina NGS sequenziert. Die computergestützte Analyse der Lesezahlen identifiziert dann, welche Peptide im Vergleich zu negativen Kontrollen signifikant angereichert wurden – was die Antikörperbindungs-Spezifitäten in jeder Probe offenbart.
Was PhIP-Seq von konventioneller Serologie unterscheidet, ist der Maßstab. Während ELISA einen Antigen pro Reaktion testet und Protein-Mikroarrays durch Ausdruckslogistik eingeschränkt sind, untersucht PhIP-Seq gleichzeitig bis zu 700.000+ Peptidziele — ohne dass eine Proteinexpression oder -reinigung erforderlich ist. Unsere Expertise in der Antikörper-Display-Sequenzierung bildet die Grundlage der gesamten Plattform, und jeder Durchlauf wird von unserem validierten Bioinformatik-Pipeline für reproduzierbare Anreicherungsaufrufe unterstützt.
PhIP-Seq Bibliotheksarten, die wir unterstützen
Unser Service unterstützt die gängigen PhIP-Seq-Bibliotheksformate, die in veröffentlichten Forschungen verwendet werden, sowie vollständig maßgeschneiderte Peptidom-Designs, die auf Ihr Zielprotein-Set abgestimmt sind.
| Bibliotheksart | Peptidabdeckung | Typische Peptidlänge | Wichtige Anwendungen |
|---|---|---|---|
| Humanes Proteom | ~48.000+ Proteine und Isoformen | 49–90 aa, gefliest mit Überlappung | Autoantigenentdeckung, autoimmune Profilierung, Krebs-Autoantikörper-Panels |
| Humanes Virom | 200+ Wirbeltierviren, 480.000+ Peptide | 56–62 aa, 28 aa Überlappung | Virom-Expositionsgeschichte, Seroprävalenzstudien, Impfstoffimmunogenität |
| Allergenom | 1.800+ Allergenproteine | 56 aa | Allergieforschung, IgE-Profiling, kreuzreaktive Sensibilisierung |
| Pathogen-spezifisch | Benutzerdefinierte Bakterien, Parasiten, Pilze, Viren | 56–62 aa, konfigurierbarer Überlappung | Forschung zu Infektionskrankheiten, Serologie tropischer Krankheiten |
| Benutzerdefinierte Bibliothek | Jedes von Ihnen definierte Proteinset | Konfigurierbar | Arzneimittel-Ziel-Immunogenität, Neoantigen-Profiling, Biomarker-Panels |
PhIP-Seq-Dienstablauf
Unser Workflow folgt dem validierten T7-Phagen-Display-Rahmen, der von Larman et al. etabliert und über Jahre hinweg durch veröffentlichte Anwendungen verfeinert wurde, mit strengen Qualitätskontrollen in jeder Phase.
Bioinformatikanalyse
Zuverlässig Bioinformatikanalyse ist das, was rohe PhIP-Seq-Sequenzierungsdaten in interpretierbare Immunprofile umwandelt. Unser Standardpipeline liefert Folgendes für jedes Projekt:
- Rohdaten-QC: FastQC-Metriken zu rohen FASTQ-Dateien; Bestätigung der Lese-Tiefe pro Probe; Bewertung der Bibliotheksdarstellung
- Ausrichtung & Quantifizierung: Reads, die an das Phagenbibliotheks-Referenz ausgerichtet sind; Rohzählmatrizen, die pro Peptid und Probe generiert werden.
- Normalisierung: Zählungen normalisiert für die Bibliothekszusammensetzung und Sequenzierungstiefe; Eingabebibliotheksdarstellung als Referenz verwendet
- Bereicherung Anruf: Statistische Identifizierung angereicherter Peptide im Vergleich zu Mock-IP-negativen Kontrollen; Unterstützung sowohl für Z-Score-basierte als auch für Bayesian (BEER) Rahmenwerke.
- Hit-Anmerkung: Angereicherte Peptide, die auf die Quellproteine zurückgeführt werden; Genbezeichnungen, UniProt-IDs und funktionale Annotationen bereitgestellt.
- Protein-Level-Zusammenfassung: Peptidniveau-Hits zusammengefasst zu Proteinreaktivitätswerten
- Visualisierung: Heatmaps der Probe × Peptidanreicherung, Vulkanplots und Zusammenfassungen der Reaktivität pro Protein
- Benutzerdefinierte Analyse: Auf Anfrage: seroprevalenzanalysen auf Bevölkerungsebene, Kohortenvergleiche (Fälle vs. Kontrollen), Pfadanreicherung und Integration mit Multi-Omics-Datensätzen.
Alle Lieferungen werden in Standardformaten bereitgestellt (CSV, TSV, PDF-Bericht). Roh-FASTQ-Dateien sind enthalten. Unsere Wissenschaftler stehen für Unterstützung bei der Dateninterpretation und für gemeinsame Veröffentlichungen zur Verfügung.
Anwendungen von PhIP-Seq
Die Breite der Peptidabdeckung von PhIP-Seq macht es anwendbar für eine Vielzahl von immunologischen Forschungsfragen.
Autoimmunerkrankung und Entdeckung von Autoantigenen
- Proteom-weites IgG-Reaktivitätsprofiling gegen das vollständige menschliche Proteom
- Neuartige Autoantigenentdeckung bei MS, Typ-1-Diabetes, rheumatoider Arthritis, APS1, IPEX
- Fall-Kontroll-Kohortenstudien mit hoher statistischer Power
Infektiöse Krankheitsserologie und Virom-Profiling
- Simultane Profilierung gegen über 200 Wirbeltierviren aus einer einzelnen Serumprobe
- Bevölkerungsweite virale Expositionsgeschichte und Seroprävalenzanalyse
- SARS-CoV-2 Kreuzreaktivität und Antikörperkartierung für endemische Coronaviren
Immunogenität von Impfstoffen und Epitope-Mapping
- Epitopniveau-Auflösung der durch Impfungen induzierten Antikörperantworten
- Identifizierung dominanter IgG-reaktiver Regionen innerhalb von Impfstoffantigenen
- Längsschnittverfolgung der Entwicklung der Antikörperantwort nach der Immunisierung
Allergenprofilierung
- IgE- und IgG-Reaktivitätskartierung gegen über 1.800 Allergeneiweißsequenzen
- Charakterisierung des kreuzreaktiven Sensibilisierungsmusters
- Komponentenbasierte Allergiediagnostik-Unterstützung (RUO)
Biomarker-Entdeckung & Krebsimmunologie
- Identifizierung von tumorassoziierten Autoantikörpern für Kandidaten-Krebsbiomarker-Panels
- Große Prädiagnose-Biobank-Kohortenuntersuchung zur Identifizierung früher immunologischer Signaturen
- Integration mit unseren Antikörperentdeckungs-Workflows für die nachgelagerte Validierung
Wie sich PhIP-Seq mit anderen Antikörperprofilierungsmethoden vergleicht
Die Auswahl der richtigen Serologie-Plattform hängt von der Skalierung, Auflösung und dem Durchsatz ab, die Ihre Forschung erfordert. Die folgende Tabelle stellt PhIP-Seq den am häufigsten verwendeten Alternativen gegenüber.
| Merkmal | PhIP-Seq | ELISA | Protein-Mikroarray | Peptidarray | Luminex Multiplex |
|---|---|---|---|---|---|
| Ziele pro Testverfahren | 100.000–700.000+ Peptide | 1 | 1.000–20.000 Proteine | 5.000–50.000 Peptide | 50–500 Proteine |
| Erfordert die Proteinexpression | Nein | Ja | Ja | Nein | Ja |
| Epitope-Auflösung | Linear Peptidniveau | Proteinspiegel | Proteinspiegel | Lineares Peptidniveau | Proteinspiegel |
| Probenvolumen | ~1–5 µL Serum/Plasma | 10–100 µL | 10–50 µL | 10–50 µL | 10–50 µL |
| Multiplexing (Proben/Lauf) | Hunderte | Niedrig | Niedrig | Niedrig | Moderat |
| Erkennt neuartige Antigene | Ja | Nein | Teilweise | Teilweise | Nein |
| Konformationelle Epitopen | Nein | Ja | Ja | Nein | Ja |
| Am besten für | Proteomweite Entdeckung, große Kohorten | Einzelzielquantifizierung | Zielgerichtetes Proteom-Multiplex | Definierte Epitope-Kartierung | Mittelgroßes Multiplex |
Empfohlener Arbeitsablauf: Verwenden Sie PhIP-Seq für das Screening großer Kohorten in der Entdeckungsphase; validieren Sie die besten Treffer mit Antikörper-Sequenzierung oder gezielte ELISA. Bei Fragen, welche Plattform am besten zu Ihrer Studie passt, kontaktieren Sie direkt unsere Wissenschaftler.
Beispielanforderungen
| Probenart | Mindestvolumen | Qualität | Notizen |
|---|---|---|---|
| Humanserum | ≥50 µL | Standardserumqualität | Bevorzugt; bei −80 °C lagern |
| Humanes Plasma (EDTA) | ≥50 µL | Vermeiden Sie Hämolyse. | EDTA oder Heparin-Antikoagulans |
| Humanes Plasma (Citrats) | ≥50 µL | Vermeiden Sie Hämolyse. | Zitrat akzeptabel |
| Mausserum / Plasma | ≥20 µL | Standardqualität | Für Läufer der murinen Proteombibliothek |
| Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) | ≥200 µL | Zellfrei | Empfohlene vorab bestätigte Ig-Präsenz |
| Andere biologische Flüssigkeiten | Kontaktieren Sie uns | Kontaktieren Sie uns | Speichel, BAL, Synovialflüssigkeit fallweise bewertet. |
- Frost-Tau-Zyklen: Maximal 3 Zyklen empfohlen; aliquote Proben vor der Lagerung entnehmen.
- Wärmeinaktivierung: Nicht erforderlich; wird abgeraten, da es die Integrität der Antikörper beeinträchtigen könnte.
- Negative Kontrollen: Mock-IP-Kontrollen sind in jedem Durchlauf enthalten; keine zusätzlichen Kontrollen sind vom Kunden erforderlich.
- Kohortenlieferungen: Versenden Sie alle Proben zusammen auf Trockeneis, wo möglich.
Für die vollständigen Anforderungen zur Einreichung von Mustern verweisen wir auf unsere Richtlinien für die Einreichung von Proben.
Warum CD Genomics für PhIP-Seq wählen?
Wir kombinieren validierte Phagenanzeige-Infrastruktur, umfassende NGS-Expertise und rigorose Bioinformatik – und liefern reproduzierbare, publikationsbereite PhIP-Seq-Datensätze für akademische und industrielle Partner weltweit.
- Fertige und benutzerdefinierte Bibliotheken: Zugriff auf validierte Bibliotheken des menschlichen Proteoms, Viroms und Allergenoms — oder wir entwerfen ein benutzerdefiniertes Peptidom aus Ihren Proteinsequenzen.
- End-to-End-Service: Ein einziger Ansprechpartner von der Probenannahme bis zur Datenlieferung; keine Auslagerung eines Schrittes im Prozess.
- Strenge negative Kontrollen: Jeder Lauf umfasst Mock-IP-Kontrollen; die Anreicherung wird immer im Verhältnis zu diesen Kontrollen berechnet, nicht zu willkürlichen Schwellenwerten.
- Skalierbares Multiplexing: Die Poolung von Proben mit Barcodes reduziert die Kosten pro Probe bei großen Kohortenstudien erheblich.
- Kollaborative Bioinformatik: Unsere Wissenschaftler unterstützen die Dateninterpretation, maßgeschneiderte Analysen und die Manuskriptvorbereitung.
Von Pilotversuchen bis hin zur immunologischen Profilierung in großem Maßstab machen die End-to-End-Antikörper-Screening- und Sequenzierungsfähigkeiten von CD Genomics uns zu Ihrem vertrauenswürdigen Partner beim Verständnis der humoralimmunologischen Landschaft.
Referenzen
- Mohan, Divya, et al. "PhIP-Seq-Charakterisierung von Serumantikörpern mittels oligonukleotid-kodierten Peptidomen." Naturprotokolle 13.9 (2018): 1958–1978. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
- Sundell, Gustav N., und Sheng-Ce Tao. "Phagenimmunpräzipitation und Sequenzierung — eine vielseitige Technik zur Kartierung des Antikörper-Reaktoms." Molekulare und Zelluläre Proteomik 23.9 (2024): 100831. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
- Huang, Ziru, et al. "PhIP-Seq: Methoden, Anwendungen und Herausforderungen." Grenzen der Bioinformatik 4 (2024): 1424202. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Dokumenten übersetzen. Bitte geben Sie den Text, den Sie übersetzen möchten, direkt hier ein.
- Tiu, Charles Kevin, et al. "Phagen-Immunopräzipitations-Sequenzierung (PhIP-Seq): das Versprechen der Hochdurchsatz-Serologie." Pathogene 11,5 (2022): 568. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
Demonstrationsergebnisse
Peptidanreicherung Heatmap über die Patientenkohorte (Z-Score-Skala)
Vulkan-Plot: Anreicherungs-Faltenänderung vs. statistische Signifikanz
Virom-Profiling: Antikörpertreffer pro Pathogenfamilie (VirScan-Analyse)
PhIP-Seq häufig gestellte Fragen (FAQs)
1. Welche Art von Antikörper wird in Standard-PhIP-Seq-Läufen nachgewiesen?
Unser Standardprotokoll erfasst IgG-Antikörper mit Protein A/G-Magnetperlen. Für die Profilierung von IgA, IgM oder IgE bieten wir isotypenspezifische Pull-Downs mit dem entsprechenden Antikörper-Reagenz an – bitte geben Sie Ihren Interessensisotyp bei der Anfrage nach einem Angebot an.
2. Wie viele Proben können in einem einzigen Durchgang verarbeitet werden?
Wir verwenden barcode-markierte PCR-Primer, um Proben zu multiplexen, was die Sequenzierungskosten pro Probe erheblich senkt. Typische Laufgrößen liegen zwischen 24 und 96 Proben, und wir können größere Kohorten durch Pooling über mehrere Läufe hinweg unterbringen. Kontaktieren Sie uns, um die optimale Batch-Größe für Ihre Studie zu besprechen.
3. Kann PhIP-Seq konformationale Epitopen nachweisen?
PhIP-Seq zeigt lineare Peptid-Tiles und ist für lineare B-Zell-Epitopen optimiert. Konformationale oder diskontinuierliche Epitopen – wie sie durch disulfidverknüpfte Schleifen gebildet werden – werden von dieser Plattform nicht erfasst. Für Antigenziele, bei denen konformationale Epitopen vorherrschen, empfehlen wir, die Entdeckung durch PhIP-Seq mit proteinbasierten Validierungsassays zu kombinieren. Unser Antikörper-Screening-Sequenzierung Das Team kann zu dem am besten geeigneten ergänzenden Ansatz beraten.
4. Welche Bioinformatik-Lieferungen sind im Standardservice enthalten?
Standardlieferungen umfassen rohe FASTQ-Dateien, eine Read-Count-Matrix pro Peptid pro Probe, normalisierte Anreicherungswerte, statistisch ermittelte Treffer mit Fold-Change und p-Werten, Zusammenfassungen der Proteinreaktivität auf Ebene der Proteine sowie einen QC-Bericht. Visualisierungsausgaben (Heatmaps, Vulkanplots) und Annotationsdateien (UniProt-Zuordnungen, Gen-Namen) sind ebenfalls enthalten. Individuelle Analysen — Kohortenvergleiche, Pfadanreicherung, Integration mit anderen Omics-Daten — sind auf Anfrage verfügbar.
5. Wie sollte ich Proben an CD Genomics versenden?
Proben sollten auf Trockeneis in deutlich gekennzeichneten, auslaufsicheren Kryovials versendet werden. Bitte kontaktieren Sie Ihren Projektmanager vor dem Versand, um ein Probenübermittlungsformular und Versandanweisungen zu erhalten. Alle Proben sollten von einem ausgefüllten Probeninformationsblatt begleitet werden, das den Proben-Typ, das Entnahmedatum, die Lagerhistorie und die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen detailliert angibt.
PhIP-Seq Fallstudien
Literatur-Highlight
Phagenimmunpräzipitation und Sequenzierung — eine vielseitige Technik zur Kartierung des Antikörper-Reaktoms
Journal: Molekulare & Zelluläre Proteomik
Impact Factor: 6,1 (2024)
Veröffentlicht: 19. August 2024
Hintergrund
Die Charakterisierung des Antikörper-Reaktoms – das vollständige Set von Antigenen, an die die Antikörper einer Person binden – kann aktuelle oder frühere Infektionen, Allergiestatus und autoimmune Krankheitsprozesse aufdecken. Diese Perspektive von Sundell und Tao an der Shanghai Jiao Tong Universität aus dem Jahr 2024 bietet die umfassendste zeitgenössische Übersicht über das Design von PhIP-Seq-Bibliotheken, statistische Analyse-Strategien und Anwendungen in verschiedenen Krankheitszuständen. Die Studie diente als definitiver technischer Referenzrahmen für das Fachgebiet und katalogisierte alle wichtigen veröffentlichten PhIP-Seq-Bibliotheken sowie deren experimentelle Anwendungen in Gesundheit und Krankheit.
Methoden
Bibliotheksdesign
- T7-Phagen-Display-Format
- OLS-kodierte Peptidbibliotheken
- Menschliches Proteom, Virom, Allergenom, pathogen-spezifische und benutzerdefinierte Bibliotheken überprüft
Experimenteller Arbeitsablauf
- Protein A/G magnetische Bead-Immunpräzipitation
- Barcode-PCR-Amplifikation
- Illumina NGS-Sequenzierung
Statistische Analyse
- Z-Score-basierte Anreicherungserkennung
- Bayesian BEER-Rahmenwerk
- Mock-IP negative Kontrollnormalisierung
Ergebnisse
Die Studie bestätigte, dass PhIP-Seq eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweist — über 97% bzw. 90% — mit starker Reproduzierbarkeit zwischen technischen Replikaten und zwischen separaten experimentellen Durchläufen. Die Überprüfung dokumentierte erfolgreiche Anwendungen in verschiedenen Bereichen, darunter Autoimmunerkrankungen (neue Autoantigenentdeckung bei Multipler Sklerose, APS1 und IPEX), Infektionskrankheiten (virome-weite Expositionskartierung im Bevölkerungsmaßstab), Vakzinologie (Epitopebene Charakterisierung von impfbedingtem IgG), Allergieforschung (Allergenom-Profiling) und Krebsimmunologie (Entdeckung tumorassoziierter Autoantikörper). Die Autoren zeigten zudem, dass die Multiplexkapazität der Plattform die Kosten pro Probe bei großen Kohortenstudien drastisch senkt, was eine immunologische Profilierung im Bevölkerungsmaßstab realisierbar macht.
Schlussfolgerung
Diese Studie bestätigt PhIP-Seq als eine ausgereifte, hochdurchsatzfähige Plattform für umfassendes Antikörper-Profiling. Die Kombination aus proteomweiter Abdeckung, minimalen Eingabebedarf (~1–5 µL Serum) und flexiblem Bibliotheksdesign macht es zur bevorzugten Methode für Forscher, die die gesamte Landschaft der humoralen Immunantworten in verschiedenen Krankheitskontexten charakterisieren möchten. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass die fortgesetzte Integration von PhIP-Seq mit Multi-Omics-Datensätzen seine Rolle in der biomedizinischen Forschung weiter ausbauen wird.
Referenz
- Sundell, Gustav N., und Sheng-Ce Tao. "Phagenimmunpräzipitation und Sequenzierung — eine vielseitige Technik zur Kartierung des Antikörper-Reaktoms." Molekulare und Zelluläre Proteomik 23.9 (2024): 100831. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder DOI-Referenzen übersetzen. Bitte geben Sie den Text, den Sie übersetzen möchten, direkt hier ein.
Fallstudienfigur: Abb. 1 aus Sundell GN & Tao SC, Mol Cell Proteomics 2024, DOI: 10.1016/j.mcpro.2024.100831. Bild wird vom Webteam aus dem veröffentlichten Artikel bezogen.
