Einzelzell-DNA-Sequenzierung

CD Genomics bietet umfassende Whole-Genome-Amplifikation zur Entdeckung von DNA-Mutationen in Einzelzellen an.

Die Einführung der Einzelzell-DNA-Sequenzierung

Zufällige, niedrig-abundante Mutationen im Genom somatischer Zellen sind schwer zu qualifizieren und zu charakterisieren. Um dieses Problem zu umgehen und gleichzeitig die mutationale Heterogenität innerhalb von Geweben zu berücksichtigen, wird die Sequenzierung einer repräsentativen Anzahl einzelner Zellen angewendet.

Die Technologie der gesamten Genomamplifikation (WGA) hat sich als Werkzeug zur Bewertung von DNA-Mutationen in einzelnen oder einer begrenzten Anzahl von Zellen entwickelt. Um die Entdeckung echter Variationen in Einzelzellen zu ermöglichen, wird die WGA von einzelkopierten genomischen DNA, die von einer einzelnen Zelle stammt, optimiert, um ausreichende Mengen an DNA für die Sequenzierung zu erhalten. Angesichts des Problems der begrenzten oder unzureichenden DNA-Menge für verschiedene nachgelagerte Analysen kann die amplifizierte DNA direkt für die Sequenzierung verwendet werden.

Es wurden verschiedene WGA-Techniken entwickelt. Wir bieten Dienstleistungen an, die die ursprüngliche Quell-DNA mit der niedrigsten falsch-positiven Rate genau kopieren und ein validiertes Protokoll bereitstellen, das gut geeignet ist zur Erkennung von Kopienzahlvariationen und einzelnen Nukleotidvariationen im gesamten Genom aus einer einzelnen Zelle nach der gesamten Genomamplifikation.

Was sind die Vorteile der Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

• Die direkte Erkennung von Genebene-Mutationen ist von großer Bedeutung für die Tumorerkennung.
• DNA weist eine größere Stabilität im Vergleich zu RNA auf, was ausreichend Zeit für die Probenverarbeitung bietet.
• Die Nachweisempfindlichkeit zur Identifizierung seltener mutierter Zellklone innerhalb von Geweben kann Werte von bis zu 0,1 % erreichen.
• Dieser Ansatz geht effektiv die Herausforderung an, die durch gemischte Proben entsteht.
• Darüber hinaus bietet es eine verbesserte räumliche Auflösung.
• In die Zukunft blickend, wird die Integration weiterer Omics-Analysen auf Einzelzell-DNA-Plattformen, einschließlich der Profilierung von Zelloberflächenproteinen und der Einzelzell-Methylierungsanalyse, RNA-Seq, und BCR/TCR-Sequenzierung birgt enormes Potenzial.

Was sind die Anwendungen der Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

• Um CNVs und einzelne Nukleotidvariationen (SNVs) im gesamten Genom in Einzelzellen oder bei ultraniedrigem Input zu entdecken.
• Um eine basenweise Ansicht eines Exoms mit Einzelzellauflösung zu erhalten
• Aufdeckung zellulärer Heterogenität
• Verfolgung der embryonalen Entwicklung und Zell-Differenzierung
• Untersuchung der Tumorentwicklung und therapeutischen Resistenz
• Erforschung der Funktionalität des Immunsystems
• Verstehen der Struktur und Funktion des neuronalen Systems
• Analyse der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung

Einzelzell-DNA-Sequenzierungs-Workflow

Die Einführung von Zellsortierungs- und -partitionierungstechnologien, wie z.B. der Durchflusszytometrie und Mikrofluidik, hat es ermöglicht, Einzelzellen zu erfassen, und die WGA ist optimiert, um hohe Ausbeuten an genomischer DNA für die Sequenzierung bereitzustellen. Der allgemeine Arbeitsablauf für die DNA-Sequenzierung von Einzelzellen ist unten skizziert.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Für dieses Verfahren werden 96-Well-Platten mit lebenden Zellensuspensionen empfohlen. Gefrorene Zellen in bestimmten gefrorenen Lysaten können ebenfalls als Ausgangsmaterial verwendet werden. >1000 pg extrahierte DNA. Zellen Empfohlene Menge & Qualität: 1-103Einzelne Zellen werden in 1xPBS-Puffer (ohne Ca) aufbewahrt.2+, Mg2+), das Volumen liegt innerhalb von 2 μL Empfohlene Menge und Qualität der DNA ≥ 0,5 pg
	Sequenzierung HiSeq X Ten Deckungstiefe ≥ 30x Mehr als 85 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Bioinformatikanalyse Qualitätskontrolle von Rohdaten Ausrichtung an Referenzgenom SNP/InDel/SV/CNV-Analyse Annotation und Statistiken Fortgeschrittene Analyse: monogene Erkrankungen, komplexe/multifaktorielle Erkrankungen und Krebs

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in der Einzelzell-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Die Konferenz zur Einzelzell-DNA-Sequenzierung von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und beleuchtet weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, können Sie uns gerne kontaktieren.

Referenzen:

1. Deleye, L et al. Leistung von vier modernen Methoden zur gesamten Genomamplifikation zur Erkennung von Kopienzahlvarianten in Einzelzellen. Wissenschaftliche Berichte, 13. Juni 2017; 7(1): 3422.
2. Dong, X et al. Genaue Identifizierung von Einzel-Nukleotid-Varianten in ganz genomisch amplifizierten Einzelzellen. Natare-MethodenMai 2017; 14(5): 491–493.

Was ist die Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

Die Einzelzell-DNA-Sequenzierung bezieht sich auf eine anspruchsvolle DNA-Sequenzierung Eine Methode, die die Analyse von genetischem Material umfasst, das nur aus einer einzelnen Zelle entnommen wird. Sie verleiht Wissenschaftlern die Fähigkeit, die einzigartigen Verhaltensmuster zu erkennen und zu verstehen, die jede Zelle zeigt.

2. Warum ist die Einzelzell-DNA-Sequenzierung wichtig?

Die Bedeutung der Einzelzell-DNA-Sequenzierung ergibt sich aus ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Studium und die Untersuchung genetischer Variationen zu ermöglichen, die innerhalb einzelner Zellen vorhanden sind, die in einem einzigen Gewebe oder Organismus koexistieren. Das Bewusstsein für diese Unterschiede kann die Grundlage dafür legen, Unregelmäßigkeiten oder Abnormalitäten auf zellulärer Ebene hervorzuheben. Folglich könnte dies den Weg für neuartige Erkenntnisse über den Ursprung und die Evolution von Krankheiten ebnen und gleichzeitig bei der Entwicklung gezielter und effektiver Behandlungsmodalitäten helfen.

3. Wie unterscheidet sich die Einzelzell-DNA-Sequenzierung von traditionellen DNA-Sequenzierungsmethoden?

Traditionell DNA-Sequenzierung Methoden amalgamieren genetische Daten aus einer Vielzahl von Zellen und verschleiern damit die Heterogenität, die in einzelnen Zellen vorhanden ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Einzelzell-DNA-Sequenzierung die Untersuchung einzelner Zellen und deckt somit diese verborgene zelluläre Vielfalt auf.

4. Das Prinzip, Vorteile und Nachteile der Einzelzellgenomamplifikation.

i. MDA (Multiple Displacement Amplifikation)

Erfunden von Laskin et al. im Jahr 2001. Reagiert mit zufälligen sechs Polymer-Primer und φ29 DNA-Polymerase, die starke Kettenersatz-Eigenschaften aufweist und das DNA-Fragment von 50~100kb unter isothermalen Bedingungen amplifizieren kann. Gleichzeitig hat die φ29 DNA-Polymerase aufgrund ihrer 3'-5' Exonukleaseaktivität und Korrekturleseaktivität eine hohe Genauigkeit. Die MDA-Methode bietet eine höhere Genomabdeckung.

ii. MALBAC (Mehrfache Temperierung und Schleifenbasierte Amplifikationszyklen)

Der quasilineare Amplifikationsprozess reduziert die Sequenzpräferenz der exponentiellen Amplifikation. Die 5'-Enden der amplifizierten Primer enthalten die gemeinsame Sequenz von 27 bp und das 3'-Ende ist eine zufällige Sequenz von 8 bp, die bei niedrigen Temperaturen von 15 bis 20 °C mit der Vorlage kombiniert werden kann, um anschließend diese ringförmigen Amplicons nach der quasilinearen Amplifikation von 8 bis 12 Zyklen zu amplifizieren.

Der Vorteil der MALBAC-Methode besteht darin, dass die Sequenzpräferenz zwischen verschiedenen Zellen wiederholbar ist. Aufgrund ihrer besseren Homogenität der Amplifikation sind die Daten besser für die CNV-Analyse geeignet. Die Schwäche von MALBAC liegt darin, dass die Genauigkeit der verwendeten Polymerase nicht so gut ist wie die von φ29-DNA-Polymerase, sodass MALBAC bei der Detektion von SNVs mehr falsch-positive Ergebnisse liefert; zudem kann aufgrund der wiederholbaren Sequenzpräferenz der Bereich mit geringer Amplifikation im Genom manchmal im Amplifikationsprozess verloren gehen.

5. Wie funktioniert die Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

Zellisolierung:

Die Isolation einzelner Zellen aus einer heterogenen Population erfolgt präzise unter Verwendung ausgeklügelter Techniken wie der fluoreszenzaktivierten Zellseparation (FACS), Mikrofluidik oder der laserbasierten Mikrodissektion.

Genomverstärkung:

DNA, das aus der isolierten Zelle extrahiert wurde, unterliegt Amplifikationsverfahren, um ausreichend Material für nachgelagerte Analysen zu gewinnen. Etablierte Methoden wie die Multiple Displacement Amplification (MDA) und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden häufig zu diesem Zweck eingesetzt.

Bibliothekskonstruktion:

Nach der Amplifikation werden DNA-Moleküle fragmentiert, und spezialisierte Adapter werden eingeführt, um die nachfolgenden Sequenzierungsschritte zu erleichtern. Diese entscheidende Phase umfasst sorgfältige Prozesse wie DNA-Scherung, Endreparatur, Adapterligierung und anschließende Amplifikation.

Next-Generation Sequencing (NGS):

Die sorgfältig vorbereiteten Bibliotheken werden dann modernsten Technologien unterzogen. Next-Generation-Sequenzierung Plattformen wie Illumina, PacBiooder Oxford NanoporeWährend der Sequenzierung werden die DNA-Fragmente sorgfältig gelesen, was umfassende Sequenzinformationen liefert.

Datenanalyse:

Rohsequenzierungsdaten unterliegen einer strengen Verarbeitung und Analyse, um genetische Varianten zu identifizieren, einschließlich einzelner Nukleotidvariationen (SNVs), Kopienzahlvariationen (CNVs) und struktureller Variationen (SVs). Fortschrittliche Bioinformatik Werkzeuge und Algorithmen werden für die Variantenbestimmung, Ausrichtung und sorgfältige Interpretation eingesetzt.

6. Welche Techniken gibt es zur Amplifikation des gesamten Genoms?

Im Bereich der gesamten Genomamplifikation treten mehrere bedeutende technische Ansätze hervor:

• Eine solche Methode basiert auf der PCR-Methodik, die durch DOP-PCR (Degenerierte Oligonukleotid-primierte PCR) veranschaulicht wird.
• Ein weiterer Ansatz umfasst isotherme Amplifikationstechniken, die durch MDA (Multiple Displacement Amplification) gekennzeichnet sind.
• Darüber hinaus stellen Methoden, die PCR mit isothermer Amplifikation kombinieren, wie MALBAC (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles), einen eigenen Ansatz dar.
• Darüber hinaus gibt es eine Kategorie, die auf Transposase-Mechanismen basiert, exemplifiziert durch LIANTI und META-CS.

Die MDA-Technologie zeichnet sich als verbreitet und weit verbreitet im Bereich der gesamten Genomverstärkung aus. Darüber hinaus hat MALBAC, das die kombinierten Vorteile von PCR und isothermaler Amplifikation nutzt, eine besondere Bedeutung in Bereichen wie der Einzelzell-Sequenzierung. Während LIANTI und META-CS vielversprechende Entwicklungen in transposase-basierten Ansätzen darstellen, steht ihre weitreichende Akzeptanz und Anerkennung noch hinter der von MDA und MALBAC zurück.

7. Was sind einige Herausforderungen der Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

Inhärente Herausforderungen bestehen im potenziellen Verlust von genetischem Material während der Zellisolierung und der DNA-Extraktionsphasen, Ungenauigkeiten, die während des Amplifikationsprozesses eingeführt werden, und dem erheblichen finanziellen Aufwand, der für diese Technologie erforderlich ist.

8. Wie ist die zukünftige Perspektive für die Einzelzell-DNA-Sequenzierung?

Die Zukunft ist reich an Perspektiven für die Einzelzell-DNA-Sequenzierung. Technologische Fortschritte versprechen, die Kosten zu senken und den Durchsatz zu erhöhen, wodurch eine breitere Nutzung gefördert wird. Die Aggregation von Einzelzell-genomischen Daten wird auch die Erstellung komplexerer Modelle der menschlichen Entwicklung und Krankheitsprogression beschleunigen.

Hochdurchsatz-Genomik einzelner Mikroben mit Stammauflösung, angewendet auf das menschliche Mikrobiom des Darms

Zeitschrift: Wissenschaft
Impactfaktor: 60,528
Veröffentlicht: 3. Juni 2022

Hintergrund

Das menschliche Mikrobiom des Darms stellt ein komplexes und individualisiertes Ökosystem dar, das durch eine Vielzahl von mikrobiellen Arten gekennzeichnet ist. Das Vorhandensein unterschiedlicher Stämme innerhalb einer einzigen Art kann erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit haben, einschließlich der Beeinflussung von Antibiotikaresistenzprofilen und der Modulation von Wechselwirkungen mit dem Wirtsmikrobiom. Folglich kann ein enger Fokus auf mikrobielle Arten ohne Berücksichtigung ihrer spezifischen Stämme dazu führen, dass kritische Nuancen übersehen werden. Trotz der Bedeutung einer Auflösung auf Stamm-Ebene bleibt die genomische Zusammensetzung des Mikrobioms des Darms auf dieser Ebene weitgehend unerforscht, selbst innerhalb eines Individuums.

Während Shotgun-Metagenomik bietet eine umfassende Übersicht über Mikrobengemeinschaftsgenome, bleibt jedoch oft hinter der Erfassung von Varianten auf Stammniveau zurück. Im Gegensatz dazu bieten kulturbasierte Methoden und titerplattenbasierte Einzelzell-Sequenzierung Möglichkeiten, stammaufgelöste Genome zu ermitteln. Diese Ansätze sind jedoch durch ihre begrenzte Fähigkeit eingeschränkt, ein breites Spektrum mikrobieller Stämme abzudecken.

Methoden

Ergebnisse

Die Forscher verwendeten Microbe-seq, um sieben Proben des Mikrobioms aus dem Darm eines einzelnen menschlichen Probanden zu analysieren, was zur Gewinnung von 21.914 einzeln amplifizierten Genomen (SAGs) führte. Diese SAGs wurden zu 76 Genomen auf Art-Ebene zusammengefügt, von denen viele aus Arten stammen, die schwer zu kultivieren sind. Unter diesen Genomen umfassten zehn Arten mehrere Stämme, deren Genome ebenfalls zusammengefügt wurden. Mithilfe dieser stammaufgelösten Genome rekonstruierten die Autoren das Netzwerk des horizontalen Gentransfers (HGT) innerhalb dieses Mikrobioms. Sie beobachteten häufigen genetischen Austausch zwischen Bacteroidetes-Arten, insbesondere in Verbindung mit einem mobilen Element, das ein Typ-VI-Sekretionssystem beherbergt, das für die Vermittlung von inter-stammlichen Wettbewerben bekannt ist.

Darüber hinaus erleichterte die tropfenbasierte Einkapselungsmethode die Untersuchung physikalischer Assoziationen zwischen einzelnen Mikroben und ko-lokalisierten Bakteriophagen. Bemerkenswerterweise wurde eine signifikante Wirt-Phage-Assoziation zwischen crAssphage, dem am häufigsten dokumentierten Bakteriophagen im menschlichen Mikrobiom, und einem spezifischen Stamm von Bacteroides vulgatus.

Abb. 1. Schema des Microbe-seq-Workflows und Anwendung in einer Gemeinschaft bekannter Bakterienstämme.

Abb. 2. Gemeinsam assemblierte Genome von 76 Bakterienarten im menschlichen Mikrobiom eines einzelnen menschlichen Spenders.

Abb. 3. Stammaufgelöste Genome von B. vulgatus im menschlichen Mikrobiom des Darms.

Abb. 4. HGT zwischen bakteriellen Stämmen im menschlichen Mikrobiom eines einzelnen Spenders.

Fazit

Die Forscher verwendeten Microbe-seq, eine Methodik, die die Manipulation von Mikrofluidik-Droplets mit maßgeschneiderter bioinformatischer Analyse integriert, um eine stammaufgelöste Untersuchung der genomischen Architektur im Mikrobiom des Darms eines Individuums durchzuführen. Dieser Ansatz zeigt Vielseitigkeit und kann leicht angepasst werden, um verschiedene mikrobielle Ökosysteme zu untersuchen, einschließlich derjenigen, die in Böden und marinen Umgebungen vorkommen. Die Erweiterung der Anwendung dieser Methodik auf eine breitere menschliche Kohorte und die Integration von Microbe-seq mit ergänzenden Techniken wie funktionellem Screening, Sortierung und Langzeit-Sequenzierung verspricht, unser Verständnis des Mikrobioms des Darms und seiner komplexen Wechselwirkungen mit der menschlichen Gesundheit erheblich zu verbessern.

Referenz:

1. Zheng W, Zhao S, Yin Y, et al. Hochdurchsatz-Genomik einzelner Mikroben mit Stammauflösung, angewendet auf ein menschliches Mikrobiom. Wissenschaft, 2022, 376(6597): eabm1483.