Richtlinien zur Einreichung von Proben
Erstellen Sie bearbeitete iPSC-Klone mit sequenzierungsunterstützter Qualitätskontrolle von Anfang an.
Die Genbearbeitung in induzierten pluripotenten Stammzellen kann die Krankheitsmodellierung, die Erzeugung isogener Kontrollen, die funktionelle Genomik und die Entwicklung von Modellen zur Arzneimittelentdeckung unterstützen. Aber ein bearbeitetes iPSC-Projekt ist selten nur eine Bearbeitungsaufgabe. Ihr Team benötigt auch eine Klonvalidierung auf Ebene der Klone, eine Probenverfolgung, Sequenzierungsnachweise und einen klaren QC-Plan, bevor die nachgelagerten Experimente beginnen.
Unsere iPSC-Gentbearbeitungs- und Qualitätskontrolllösung ist darauf ausgelegt, Ihnen zu helfen, das Projekt als einen zusammenhängenden Arbeitsablauf zu planen. Wir unterstützen Sie dabei, das Bearbeitungsziel, die Zielsequenz, die Donor-Vorlage, die Screening-Strategie, die Validierung der Zielstelle, optionale genomweite Qualitätskontrollen und die berichtsfähigen Ergebnisse zu durchdenken, bevor Zellen oder extrahierte DNA in das Projekt eingehen.
Was diese Lösung Ihnen hilft zu beantworten
- Ist meine iPSC-Linie für das geplante Editierungsziel geeignet?
- Sollte das Projekt eine KO-, KI-, Punktmutation-, Korrektur- oder Reporterstrategie verwenden?
- Wird eine Spender-Vorlage benötigt?
- Welche Klone tragen die beabsichtigte Bearbeitung?
- Ist die Sanger-Bestätigung ausreichend, oder sollten Amplicon-, gezielte oder Ganzgenom-Sequenzierungen hinzugefügt werden?
- Welche QC-Ergebnisse sind erforderlich, bevor nachgelagerte Krankheitsmodellierungen, Differenzierungen oder funktionale Studien durchgeführt werden?
Das Ziel ist es, Ihrem Team zu helfen, von "wir benötigen einen bearbeiteten Klon" zu "wir verstehen, welcher Klon besser durch Sequenzierungs- und QC-Beweise unterstützt wird" zu gelangen.
Warum bearbeitete iPSC-Projekte mehr als die Bestätigung der Zielstelle benötigen
Die Bestätigung des Zielorts ist wichtig, reicht jedoch möglicherweise nicht für jedes bearbeitete iPSC-Projekt aus. Ein Klon kann durch eine kurze PCR oder Sanger-Auslesung korrekt erscheinen, während dennoch eine tiefere Überprüfung des Allelstatus, größerer On-Target-Ereignisse, der Struktur der Donoreinschübe, von Änderungen der Kopienzahl oder anderer genomweiter QC-Signale erforderlich ist.
Das bedeutet nicht, dass jedes Projekt die gleiche QC-Tiefe benötigt. Es bedeutet, dass die QC dem Zweck des bearbeiteten Klons entsprechen sollte. Ein schneller explorativer Knockout-Screen benötigt möglicherweise nicht dasselbe Evidenzpaket wie ein hochpreisiges isogenes Krankheitsmodell oder ein Klon, der für langfristige nachgelagerte Differenzierungsstudien vorgesehen ist.
Wir helfen Ihnen, diese QC-Tiefe frühzeitig festzulegen, damit die endgültigen Ergebnisse einfacher zu überprüfen und einfacher zu verwenden sind.
Unsere Servicefähigkeiten für bearbeitete iPSC-Projekte
Wir unterstützen bearbeitete iPSC-Projekte als integrierte Design-, Validierungs-, Sequenzierungs-, QC- und Reporting-Workflows. Je nach Projektumfang kann unser Team bei der Planung der Bearbeitungsstrategie, der Logik des Klon-Screenings, der Validierung der Zielorte, der sequenzierungsunterstützten QC und der bioinformatischen Interpretation helfen.
Bearbeitungsziele, bei denen wir helfen können, sie zu planen
- Gen-Knockout für Verlust-funktionale Modellierung
- Knock-in oder Reporter-Einfügung
- Einführung in Punktmutationen
- Korrektur krankheitsassoziierter Mutationen
- Isogene Kontrolle Generation
- Spender-Template-unterstützte Bearbeitung
- Klonebene Genotypvalidierung
- Sequenzierungsunterstützte Qualitätskontrolle vor nachgelagerten Forschungen
Für jedes Projekt sollte das Bearbeitungsziel mit einer Validierungsstrategie verknüpft sein. Ein Knockout-Klon könnte eine Allel-Ebene Indel-Interpretation erfordern, während ein Knock-in oder eine Reporter-Einfügung eine Validierung der Junction und eine Bestätigung der Donorsequenz benötigen könnte.
Klon-Screening- und Validierungsmodule
- Kandidatenklon-Sammlung und -Verfolgung
- Überprüfung des Klonexpansionsstatus
- Zielort-Genotypisierung
- Sanger- oder Amplicon-Sequenzierung, wo zutreffend
- Gezielte Sequenzierung für eine hochauflösende Überprüfung von Bearbeitungen
- Donor-Einfügung oder Verbindungsbestätigung
- Klone-Vergleichstabelle
- QC-Flaggen und Berichtsnotizen
Diese Module helfen Ihrem Team, Klone auf strukturierte Weise zu vergleichen, anstatt verstreute Dateien zu überprüfen.
Sequenzierungsunterstützte QC- und Reporting-Optionen
Für ausgewählte Projekte kann die sequenzierungsunterstützte Qualitätskontrolle über die Zielregion hinausgehen. Je nach Studienziel können optionale Zusatzleistungen die Überprüfung von Off-Target-Kandidaten, die sequenzierungsunterstützte Qualitätskontrolle des gesamten Genoms, die Analyse von CNV/SNV/SV oder die Überprüfung großer On-Target-Ereignisse umfassen.
Für verwandte Dienstleistungen siehe unser CRISPR-Bearbeitungsanalyse mit NGS, CRISPR Off-Target Validierungssequenzierungund CRISPR-Sequenzierung Seiten.
Wählen Sie die richtige Bearbeitungs- und Qualitätskontrollstrategie für Ihre iPSC-Linie aus.
Es gibt keinen einheitlichen QC-Plan, der für jedes bearbeitete iPSC-Projekt geeignet ist. Die richtige Strategie hängt vom Bearbeitungsziel, dem Spenderdesign, der Klonanzahl, der späteren Verwendung und dem benötigten genomischen Kontext Ihres Teams ab.
| Strategie | Hauptfrage | Best-Fit-Bearbeitungsziel | Validierungsmethode | QC-Tiefe | Einschränkung |
|---|---|---|---|---|---|
| K.O. | Wurde das Zielgen gestört? | Funktionsverlust-iPSC-Modell | Sanger-, Amplicon-Sequenzierung oder gezielte Sequenzierung | Zielstandortvalidierung und Klonvergleich | Möglicherweise ist eine Allel-Ebene-Interpretation erforderlich. |
| Knock-in | Wurde die Spendersequenz korrekt eingefügt? | Reporter-Einfügung, Tag-Einfügung, funktionale Sequenzaddition | Junction-PCR, Amplicon-Sequenzierung oder gezielte Sequenzierung | Spenderinsertions- und Verbindungsüberprüfung | Die Gestaltung des Spenders beeinflusst die Komplexität des Screenings. |
| Punktmutation | Wurde die beabsichtigte Basisänderung eingeführt? | Krankheitsmutationsmodellierung | Amplicon- oder gezielte Sequenzierung | Allele-Ebene Bestätigung | Niedrigfrequente Änderungen erfordern sorgfältige Klonüberprüfung. |
| Mutationskorrektur | Wurde die krankheitsassoziierte Variante korrigiert? | Isogene Kontrollgeneration | Zielort-Sequenzierung und Klonvergleich | Überprüfung des Zielorts und des Allelstatus | Zusätzliche Qualitätskontrolle kann für hochpreisige Klone erforderlich sein. |
| Reporter-Einfügung | Wurde der Reporter im Bild und am richtigen Ort eingefügt? | Reporter-iPSC-Linie | Junctionvalidierung und Sequenzierung | Zielort-Plus-Downstream-Expressionsplanung | Ersetzt nicht die Zellzustands-QC. |
| WGS-unterstützte QC | Sind umfassendere genomische Veränderungen vorhanden? | Überprüfung von hochwertigen Klonen vor nachgelagerten Studien | Whole-Genome-Sequenzierung und Bioinformatik | Genomweite Überprüfung, CNV/SNV/SV-Kontext, wo zutreffend | Nicht immer für jeden Forschungs-Klon erforderlich. |
Für die Validierung der Zielstelle, Gezielte Regionssequenzierung kann eine fokussierte Überprüfung unterstützen. Für eine umfassendere genomweite Bewertung, Whole Genome Sequenzierung kann in Betracht gezogen werden, wenn das Projekt eine tiefere Qualitätskontrolle erfordert.
Beginnen Sie mit der Bearbeitung, die Sie benötigen, und dem nachgelagerten Experiment, das Sie durchführen möchten. Wenn der bearbeitete Klon für frühe explorative Arbeiten verwendet wird, könnten die Validierung des Zielorts und der Vergleich der Klone ausreichen. Wenn der Klon jedoch zur Unterstützung von Krankheitsmodellierungen, isogenen Kontrollstudien oder langfristigen Differenzierungsexperimenten verwendet wird, könnte ein umfassenderes Qualitätskontrollpaket nützlich sein.
Ein Spender-Template-Projekt sollte eine Überprüfung des Spenderdesigns und eine Bestätigung der Junctions umfassen. Ein Projekt zur Punktmutation oder Korrektur könnte eine Allel-Ebene-Sequenzierung erfordern. Ein Klon, der für eine breitere nachgelagerte Verwendung vorgesehen ist, könnte eine genomweite Qualitätskontrolle oder eine Überprüfung potenzieller Off-Target-Effekte benötigen.
Wir helfen Ihnen, das passende Validierungsniveau für Ihr Forschungsziel auszuwählen, ohne jedes Projekt in einen unnötig schweren Arbeitsablauf zu verwandeln.
Proben-zu-Bericht-Workflow mit Qualitätskontrollpunkten auf Klon-Ebene
Unser Workflow verbindet das Bearbeiten von Designs, Klon-Screening, Sequenzvalidierung und QC-Berichterstattung. Jeder Schritt ist darauf ausgelegt, Unsicherheiten zu verringern, bevor das Projekt in die nächste Phase übergeht.
Schritt 1: Projektaufnahme und Überprüfung der Bearbeitungsziele
Wir beginnen mit der Überprüfung des Zielgens oder der genomischen Region, des Bearbeitungstyps, der iPSC-Quelle und des Zelllinienhintergrunds, der Informationen zum Donor-Template oder Konstrukt, wo zutreffend, der nachgelagerten Forschungsnutzung, der gewünschten Validierungstiefe, der Anzahl der zu screenenden Klone und der erwarteten Ergebnisse.
Dieser Schritt hilft uns zu bestimmen, ob das Projekt nur eine Validierung des Zielstandorts, einen Klonvergleich, eine Überprüfung von Off-Target-Kandidaten, eine genomweite Qualitätskontrolle oder ein kombiniertes Paket benötigt.
Schritt 2: Bearbeitung des Designs, Planung der Leit-RNA und des Donor-Templates
Das Entwurfsdesign der Bearbeitung sollte dem beabsichtigten Ergebnis entsprechen. Knockout-Projekte können sich auf die Schaffung von Frameshift- oder disruptiven Indels konzentrieren. Knock-in- und Reporterprojekte erfordern die Planung von Donor-Vorlagen und die Validierung von Verbindungsstellen. Projekte zur Punktmutation oder -korrektur erfordern eine sorgfältige Bestätigung auf Sequenzebene.
In diesem Stadium werden die Leit-RNA, die Donor-Vorlage, die Zielsequenz und die Screening-Logik gemeinsam überprüft. Dies hilft, das Risiko zu verringern, eine Bearbeitung zu entwerfen, die technisch möglich, aber später schwer zu validieren ist.
Schritt 3: Lieferung, Wiederherstellung und monoklonales Screening
Der Liefer- und Wiederherstellungsplan hängt von der iPSC-Linie und der Bearbeitungsstrategie ab. iPSC-Linien können empfindlich auf Bearbeitungsstress, Einzelzellhandhabung und Klonexpansion reagieren. Monoklonales Screening hilft, Kandidatenklone zu trennen und ermöglicht es, jeden Klon unabhängig zu überprüfen.
Sobald Klone verfügbar sind, werden die Identität der Proben, die Kennzeichnung der Klone, der Expansionsstatus und die Verfügbarkeit von DNA wichtige Qualitätskontrollpunkte.
Schritt 4: Validierung der Zielstelle und Vergleich der Klone
Die Validierung der Zielstelle überprüft, ob die beabsichtigte Bearbeitung vorhanden ist. Je nach Projekt kann dies Sanger-Sequenzierung, Amplicon-Sequenzierung, gezielte Sequenzierung, Bestätigung von Junctions, Überprüfung auf Allelebene oder Unterstützung bei der Donoreinfügung umfassen.
Die Klonvergleich bringt die Ergebnisse zusammen. Anstatt jeden Klon isoliert zu betrachten, kann Ihr Team Genotyp, Editiermuster, Zygosität, Status der Donoreinfügung, QC-Flags und Sequenzierungsqualität in einer Tabelle vergleichen.
Schritt 5: Genomweite Qualitätskontrolle, Bioinformatik und endgültige Ergebnisse
Für ausgewählte Projekte kann die zusätzliche Qualitätskontrolle eine durch whole-genome sequencing unterstützte Überprüfung, Validierung von Off-Target-Kandidaten, CNV/SNV/SV-Analysen oder eine umfassende Überprüfung von On-Target-Ereignissen umfassen. Die bioinformatische Analyse organisiert diese Ergebnisse in Tabellen, visuellen Zusammenfassungen und Berichtshinweisen.
Die endgültigen Liefergegenstände können bearbeitete Kloninformationen, Sequenzierungsdaten, QC-Zusammenfassungen, Klonvergleichstabellen, Abbildungen und Analysehinweise umfassen.
Muster- und Projektinformationsanforderungen
Die Probenanforderungen hängen davon ab, ob Ihr Team eine Bearbeitung des Designs, eine Klonvalidierung, eine Sequenzierung-Only-QC, eine genomweite Überprüfung oder ein kombiniertes Paket anfordert. Die folgende Tabelle verwendet die Richtlinien zur Probenübermittlung von CD Genomics als Grundlage für die Einreichung von Nukleinsäuren und Zellen. Die endgültigen Anforderungen sollten während der Projektüberprüfung bestätigt werden.
| Eingabetyp | Empfohlenes Material | Qualitätsprüfung | Container oder Format | Versand oder Einreichung | Notizen |
|---|---|---|---|---|---|
| Bestehende iPSC-Linie oder gefrorene Zellen | Projektbezogen; für die allgemeine Zellübermittlung gibt die Anleitung von CD Genomics eine Zelleneingabe von 1×10 an.6 Zellen | Zellidentität, Lebensfähigkeit, Passagehistorie, Mykoplasma-Status, falls verfügbar | Cryovial oder genehmigtes gefrorenes Zellformat | Trockeneis | Verwendet für die Bearbeitung von Machbarkeitsprüfungen oder die Planung der DNA/RNA-Extraktion. |
| Bearbeitete iPSC-Klone / Zellpellets | Projektbezogen; ausreichende Zellen für die Extraktion von genomischer DNA und die Validierung von Klonen | Kloneidentität, Probenkennzeichnung, Expansionsstatus, DNA-Ausbeute nach der Extraktion | Cryovial oder Zellpellet-Röhrchen | Trockeneis | Verwendet für die Validierung von Zielstandorten, den Vergleich von Klonen und die Qualitätskontrolle. |
| Extrahierte genomische DNA zur Validierung von Zielorten oder Klonen | Für fokussierte DNA-Sequenzierungsprojekte verwenden Sie die assayspezifischen Anforderungen; WES/WGS-ähnliche Short-Read-Eingaben beginnen normalerweise bei ≥500 ng gDNA. | OD260/280 nahe 1,8-2,0; RNase-behandelt; keine offensichtlichen Degradation oder Kontamination | DNase-freies Röhrchen; DNase-freies Wasser, Elutionspuffer oder 10 mM Tris pH 8,0 | Eisbeutel | Nützlich für gezielte Sequenzierung, Klonvalidierung oder fokussierte Qualitätskontrolle. |
| Extrahierte genomische DNA für WGS-unterstützte Qualitätskontrolle | WGS: empfohlen ≥500 ng, minimum 200 ng, minimale Konzentration 10 ng/µL; PCR-freies WGS: empfohlen ≥1 µg, minimum 500 ng, minimale Konzentration 20 ng/µL | Konzentration durch Fluorometrie, wenn möglich; bei Verwendung von Nanodrop könnte ein höherer Input erforderlich sein. | DNase-freies Röhrchen | Eispackungen | Wird verwendet, wenn eine umfassendere genomweite Qualitätskontrolle erforderlich ist. |
| Extrahierte genomische DNA für die strukturelle Überprüfung mit Langzeitlesung | PacBio WGS: ≥3 µg, 80 ng/µL; Nanopore WGS: ≥5 µg, 20 ng/µL | Hochmolekulare DNA, geringe Degradation, angemessene Reinheit | DNase-freies Röhrchen | Eisbeutel | Berücksichtigen Sie, wann der langfristige strukturelle Kontext wichtig ist. |
| Reinigtes Amplicon für gezielte Validierung | Amplicon-Sequenzierung: empfohlen ≥1 µg, minimum 500 ng, minimale Konzentration 20 ng/µL | Einzelnes erwartetes Produkt, falls zutreffend; Konzentrations- und Reinheitsprüfung | Niedrigbindende oder DNase-freie Röhre | Eisbeutel | Nützlich für die Bestätigung auf Zielort, Donor-Junktion oder Klon-Ebene |
| Bearbeiten von Entwurfsdateien | Zielgen, Referenzsequenz, gRNA, Donor-Template, Plasmidkarte, Klonliste | Sequenzgenauigkeit und Konsistenz der Proben-ID | FASTA, GenBank, Tabellenkalkulation, Plasmidkarte oder Projektblatt | Elektronische Einreichung | Benötigt vor der Überprüfung der Methode und der Einrichtung des Berichts |
CD Genomics bittet die Kunden außerdem, ein ausgefülltes Probenübermittlungsformular einzureichen, die Probenbezeichnungen zwischen dem Formular und den Probenetiketten konsistent zu halten und elektronische QC-Daten bereitzustellen, wenn verfügbar. Proben in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen sollten sorgfältig versiegelt werden; Zellen und gefrorene Proben sollten mit Trockeneis versendet werden.
Bioinformatikanalyse und Ergebnisse
Bioinformatik hilft dabei, Sequenzierungsdaten in Qualitätskontrollbeweise auf Klon-Ebene umzuwandeln. Dies ist besonders wichtig, wenn Ihr Projekt Amplicon-Sequenzierung, gezielte Sequenzierung, Validierung von Off-Target-Kandidaten, WGS-unterstützte Qualitätskontrolle oder den Vergleich mehrerer Klone umfasst.
Minimale Lieferungen
- Bearbeitung der Design-Überprüfungsnotizen, wo enthalten.
- Zusammenfassung der Qualitätskontrolle auf Probe- und Klon-Ebene
- Zusammenfassung der Zielortvalidierung
- Allel- oder Indel-Profil, wo zutreffend
- Klone-Vergleichstabelle
- Sequenzierungs-QC-Zusammenfassung
- Tabelle zur Validierung von Off-Target-Kandidaten, wo enthalten
- Genomweite QC-Zusammenfassung, in der WGS enthalten ist
- CNV/SNV/SV Überprüfungsergebnisse, wo zutreffend
- Abschlussberichtsnotizen
Für benutzerdefinierte Analysen und Berichterstattung, siehe unser Bioinformatik Dienstleistungen.
Optionale Zusatzleistungen
- Amplicon-Sequenzierungsanalyse
- Gezielte Validierung von Off-Target-Kandidaten
- Whole-Genome-Sequenzierung-unterstützte Qualitätskontrolle
- CNV/SNV/SV-Analyse
- Überprüfung großer gezielter Deletionen oder Insertionen, wo geeignet
- Analyse der Donor-Einfügungsstelle
- Klon-Ranking oder Klon-Auswahl Zusammenfassung
- Benutzerdefinierte, figurenfertige Visualisierung
- Pipeline-Parameteraufzeichnung
Für eine umfassendere Bewertung von Off-Target-Effekten siehe unser CRISPR Off-Target Entdeckung und CRISPR Off-Target Validierung Seiten.
Ein starker Bericht sollte Ihrem Team helfen, Klone zu vergleichen, nicht nur Sequenzierungsdateien zu archivieren. Nützliche Ausgaben können Klon-niveau Zusammenfassungen, Zielort-Diagramme, Beweise für Spenderverbindungen, Tabellen mit Off-Target-Kandidaten, genomweite QC-Daten und abschließende Interpretationsnotizen umfassen.
Dies ist besonders hilfreich, wenn die bearbeitete iPSC-Linie die Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffentdeckung oder langfristige nachgelagerte Experimente unterstützen wird.
Anwendungsszenarien für iPSC-Bearbeitung und Qualitätskontrolle
Diese Anwendungszenarien zeigen, wie editierte iPSC-Klone die nachgelagerte Forschung unterstützen können, wenn Design, Klon-Screening und sequenzierungsunterstützte Qualitätskontrolle gemeinsam geplant werden.
Krankheitsmodell und Erzeugung isogener Kontrollen
Bearbeitete iPSC-Linien werden häufig verwendet, um krankheitsassoziierte Varianten zu modellieren oder isogene Kontrollen zu erzeugen. In diesen Projekten können die Validierung der Zielstelle, der Vergleich von Klonen und optionale genomweite Qualitätskontrollen Ihrem Team helfen, besser unterstützte Klone vor der Differenzierung oder funktionellen Tests auszuwählen.
Entwicklung von Modellen zur Arzneimittelentdeckung
Arzneimittelentdeckungsprogramme können bearbeitete iPSC-abgeleitete Modelle nutzen, um Krankheitsmechanismen, Reaktionen von Signalwegen oder die Wirkungen von Verbindungen zu untersuchen. Ein klares QC-Paket hilft, Unsicherheiten zu verringern, bevor die bearbeitete Linie in größeren Screening- oder Assay-Entwicklungsarbeiten verwendet wird.
Funktionelle Genomik und Mechanismusforschung
Knockout-, Knock-in-, Reporter- und Punktmutations-iPSC-Modelle können funktionelle Genomik und Mechanismusstudien unterstützen. Ein sequenzgestützter Validierungsplan hilft sicherzustellen, dass der beobachtete Phänotyp so weit wie möglich mit der beabsichtigten Bearbeitung verknüpft ist.
Unterstützung der Forschung in der regenerativen Medizin
Für die Forschung in der regenerativen Medizin müssen bearbeitete iPSC-Linien möglicherweise einer umfassenderen Überprüfung auf Klon- und genomweiter Ebene unterzogen werden, bevor sie in nachgelagerten Experimenten verwendet werden. Wir können helfen, die QC-Tiefe basierend auf den Forschungszielen zu planen, während wir die Interpretation im Rahmen eines Forschungsdienstes halten.
Demonstrationsergebnisse: Was ein bearbeitetes iPSC-QC-Paket enthalten kann
Demoergebnisse helfen Ihrem Team zu verstehen, wie ein finales QC-Paket aussehen könnte. Diese Beispiele zeigen gängige Ausgabeformate, wenn sie mit dem Projektdesign übereinstimmen.
Demo 1: Bestätigung der Zielseitenbearbeitung
Ein Zielortbestätigungsoutput kann anzeigen, ob die beabsichtigte Bearbeitung vorhanden ist. Je nach Methode kann dies Sequenzspuren, Zusammenfassungen der Amplikonsequenzierung, Indel-Profile, Beweise für Donor-Junctions oder Edit-Tabellen auf Allelebene umfassen.
Dies hilft Ihrem Team, über "bearbeitet oder nicht bearbeitet" hinauszugehen und das genaue Ergebnis auf Sequenzebene zu überprüfen.
Demo 2: Klon-Screening und Genotypvergleich
Der Klonvergleich ist nützlich, wenn mehrere Kandidatenklone verfügbar sind. Ein Bericht kann Klon-ID, Genotyp, Allelstatus, Editiermuster, Expansionsstatus, Unterstützung durch Spenderinsertion und QC-Flags vergleichen.
Dies erleichtert die Entscheidung, welche Klone in tiefere Qualitätskontrollen oder nachgelagerte Tests überführt werden sollen.
Demo 3: Genomweite Qualitätskontrolle und Zusammenfassung der Off-Target-Überprüfung
Für höherwertige bearbeitete iPSC-Projekte können genomweite Qualitätskontrollen oder Überprüfungen von Off-Target-Effekten hinzugefügt werden. Eine Zusammenfassung kann potenzielle Off-Target-Stellen, CNV/SNV/SV-Funde, wo zutreffend, Notizen zur genomweiten Qualitätskontrolle und figurenfertige Zusammenfassungen enthalten.
Das Ziel ist nicht, das, was QC beweisen kann, zu übertreiben. Das Ziel ist es, ein stärkeres Forschungsevidenzpaket für die Klonprüfung bereitzustellen.
FAQ: Planung eines iPSC-Gene-Editing- und QC-Projekts
1. Können Sie mit meiner bestehenden iPSC-Linie arbeiten?
Ja. Wir können Ihre bestehende iPSC-Linie, das Bearbeitungsziel, verfügbare Zellinformationen und die QC-Anforderungen vor der Projektvorbereitung überprüfen. Nützliche Informationen umfassen die Zellquelle, die Passagehistorie, den Kulturstatus, den Mykoplasma-Status, falls verfügbar, und den Verwendungszweck.
2. Welche Bearbeitungsarten kann diese Lösung unterstützen?
Diese Lösung kann die Planung für Knockout-, Knock-in-, Punktmutationen, Mutationskorrekturen, Reporter-Einfügungen und isogene Kontrollprojekte unterstützen. Der genaue Arbeitsablauf hängt von der Zielsequenz, der Donor-Vorlage, den Zelllinienbedingungen und den Validierungszielen ab.
3. Brauche ich ein monoklonales Screening?
Wenn Ihr Team einen stabilen, bearbeiteten iPSC-Klon für nachgelagerte Studien benötigt, ist das monoklonale Screening in der Regel wichtig. Es ermöglicht, einzelne Klone zu genotypisieren, zu vergleichen und basierend auf klon-spezifischen Nachweisen auszuwählen.
4. Ist die Sanger-Sequenzierung ausreichend für die Validierung bearbeiteter iPSCs?
Die Sanger-Sequenzierung kann für das anfängliche Screening von Zielorten nützlich sein, reicht jedoch möglicherweise nicht für jedes Projekt aus. Amplicon-Sequenzierung, gezielte Sequenzierung, Validierung von Off-Target-Effekten oder WGS-unterstützte Qualitätskontrolle können nützlich sein, wenn eine Allel-Ebene oder ein breiterer genomischer Kontext erforderlich ist.
5. Wann sollte WGS zur Qualitätskontrolle von bearbeiteten iPSCs hinzugefügt werden?
WGS kann in Betracht gezogen werden, wenn ein Klon hochwertige nachgelagerte Studien, isogene Krankheitsmodellierung, langfristige Differenzierung oder Projekte unterstützt, bei denen der genomweite Kontext wichtig ist. Es ist nicht für jeden bearbeiteten Klon erforderlich.
6. Welche Proben- oder Projektinformationen sollte ich bereitstellen?
Nützliche Informationen umfassen das Zielgen, den Bearbeitungstyp, die iPSC-Quelle, die Donor-Vorlage, Informationen zur Leit-RNA, die Zielsequenz, die Klonliste, verfügbare gDNA-QC-Daten, gewünschte Ergebnisse und die Verwendung in nachgelagerten Forschungsarbeiten.
7. Können Sie mehrere bearbeitete Klone vergleichen?
Ja. Der Klonvergleich kann Genotyp, Allelstatus, Muster der Zielortbearbeitung, Unterstützung der Donor-Junktion, QC-Flags, Sequenzierungsqualität und Berichtshinweise umfassen. Dies hilft Ihrem Team zu entscheiden, welche Klone weiterverfolgt werden sollten.
8. Welche Bioinformatik-Ausgaben können einbezogen werden?
Die Ausgaben können Zusammenfassungen zur Validierung von Zielorten, Indel- oder Allelprofile, Vergleichstabellen von Klonen, Tabellen zur Validierung potenzieller Off-Target-Effekte, Überprüfungen von CNV/SNV/SV, wo zutreffend, genomweite QC-Notizen und Zusammenfassungen des Abschlussberichts umfassen.
9. Kann diese Lösung die Krankheitsmodellierung oder isogene Kontrollprojekte unterstützen?
Ja. Editierte iPSC-Linien werden häufig in der Krankheitsmodellierung und der Forschung zu isogenen Kontrollen eingesetzt. Wir können helfen, die Editierungs- und Qualitätskontrollstrategie zu planen, sodass klonale Nachweise die nachgelagerte Forschungsüberprüfung unterstützen.
10. Welche Ergebnisse können enthalten sein?
Je nach Projektumfang können die Liefergegenstände bearbeitete Kloninformationen, Sequenzierungsdaten, Ergebnisse der Validierung von Zielstandorten, Klonvergleichstabellen, bioinformatische Ausgaben, QC-Zusammenfassungen und abschließende Berichtsnotizen umfassen.
Fallstudie: Tiefere Qualitätskontrolle kann versteckte Mängel in CRISPR-bearbeiteten iPSCs aufdecken.
Fall der Open-Access-Literatur
Journal: Stammzellberichte
Veröffentlicht: 2022
DOI: 10.1016/j.stemcr.2022.02.008
Hintergrund
Diese Open-Access-Studie untersuchte ein zentrales Qualitätsproblem in CRISPR-bearbeiteten iPSC-Projekten. Menschliche iPSC-Linien werden häufig für Krankheitsmodellierung und die Erzeugung isogener Kontrollen verwendet, aber bearbeitete Klone können unerwartete On-Target-Veränderungen aufweisen, die mit kurzen PCR- und Sanger-Sequenzierungen allein schwer zu erkennen sind.
Die Studie ist relevant für diese Lösung, da sie zeigt, warum die Qualitätskontrolle von bearbeiteten iPSCs mehr als nur eine einfache Überprüfung der Zielstelle erfordern könnte, insbesondere wenn Klone wichtige nachgelagerte Experimente unterstützen sollen.
Methoden
Die Autoren evaluierten 27 iPSC-Klone, die nach CRISPR/Cas9-Bearbeitung an 9 genomischen Loci in 4 Genen erzeugt wurden. Diese Klone schienen zunächst basierend auf kurzen PCR- und Sanger-Sequenzierungen korrekt bearbeitet zu sein.
Um tiefer zu blicken, verwendete die Studie Qualitätskontrollassays, einschließlich quantitativer Genotypisierung von Allelkopien mittels PCR und Sequenzierung von nahegelegenen heterozygoten SNPs. Das Ziel war es, große On-Target-Ereignisse und Muster des Verlusts der Heterozygotie zu identifizieren, die durch die Standardvalidierung übersehen werden könnten.
Ergebnisse
Die Studie ergab, dass 33 % der bearbeiteten iPSC-Klone große on-target genomische Defekte erworben hatten, einschließlich Insertionen und Verlust der Heterozygotie. Wichtig ist, dass all diese Defekte der standardmäßigen PCR- und Sanger-Sequenzierungsanalyse entgangen waren. Die Veröffentlichung berichtet, dass 8 von 27 Klonen eine niedrigere Allelkopienzahl durch qgPCR zeigten, und ein weiterer Klon ein kopieneutrales Verlust-der-Heterozygotie-Muster durch die Analyse benachbarter SNPs aufwies.
Abbildung 2 präsentiert die Bewertung der Allelkopienanzahl in bearbeiteten iPSC-Klonen. Es umfasst das Konzept des qgPCR-Assays, die Ergebnisse der Allelkopienanzahl über 27 Klone, die Analyse benachbarter SNPs und ein Donut-Diagramm, das korrekt bearbeitete Klone im Vergleich zu Klonen mit unerwünschter monoallelicaler Bearbeitung zusammenfasst.
Abbildung 2 aus der Open-Access-Studie zeigt, wie die Bewertung der Allelkopienanzahl bearbeitete iPSC-Klone mit versteckten On-Target-Defekten aufdecken kann, die den Standard-Screeningverfahren entgangen sind.
Fazit
Diese Studie unterstützt eine praktische Lektion für bearbeitete iPSC-Projekte: Ein Klon, der bei der standardmäßigen Zielortscreening korrekt aussieht, kann je nach Forschungsziel dennoch eine tiefere Qualitätskontrolle erfordern.
Für ein Dienstleistungsprojekt bedeutet dies, dass der QC-Plan frühzeitig definiert werden sollte. Die Validierung des Zielorts, der Vergleich von Klonen, die Überprüfung von Off-Target-Effekten und die genomweite QC sollten basierend darauf ausgewählt werden, wie der bearbeitete Klon verwendet wird.
Referenz
