Einzelzell-RNA-Sequenzierung

CD Genomics bietet robuste Transkriptomforschungsdienste bis hinunter zu Einzelzell-Eingangslevels in hochwertigen Proben an. Diese globalen Genexpressionsmuster in Einzelzellen haben die Zellbiologie bereits dramatisch vorangebracht.

Die Einführung in scRNA-seq

Zellen sind die grundlegende Einheit des Lebens und jede Zelle ist einzigartig. Die Fähigkeit, komplexe zelluläre Ereignisse in biologischen Systemen zu enthüllen, ist entscheidend für ein besseres Verständnis der zellulären Beiträge während der Entwicklung oder im Krankheitsverlauf. Die Forschung zur Genexpression auf Einzelzellauflösung an Proben, die aus gemischten Zellpopulationen bestehen, ermöglicht tiefgehende Einblicke in die Transkriptomkomplexität verschiedener Zelltypen.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie, die entwickelt wurde, um die Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen zu untersuchen. Das Aufkommen dieser Technologie hat es Forschern ermöglicht, in die Genexpressionsprofile einzelner Zellen einzutauchen und so Heterogenität und funktionale Unterschiede zwischen Zellen aufzudecken. Durch den Einsatz von scRNA-seq können Wissenschaftler umfassende Genexpressionsprofile einzelner Zellen erwerben, was die Offenlegung zellulärer Heterogenität, Entwicklungsverläufe und die Klassifizierung von Zelltypen erleichtert.

CD Genomics bietet erstklassige Werkzeuge für die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung von einer einzelnen Zelle, wenigen Zellen und ultraniedrigen RNA-Eingaben. Durch die Kombination der robusten cDNA-Synthesetechnologie mit den Next-Generation-Sequenzierungs- und Analysetechnologien von Illumina bieten wir zuverlässige Daten von höchster Qualität, um die Heterogenität des Transkriptoms von Zelle zu Zelle zu untersuchen.

Vorteile von scRNA-seq

• Hohe EmpfindlichkeitDie Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) zeichnet sich durch die Erkennung von Genexpressionen mit niedriger Häufigkeit aus und ermöglicht die Identifizierung seltener Gene und Transkripte, die von traditionellen Methoden möglicherweise übersehen werden.
• Hohe AuflösungDiese hochmoderne Technologie ermöglicht eine präzise Messung der Genexpression in einzelnen Zellen und beleuchtet subtile Unterschiede sowie komplexe Differenzierungsprozesse zwischen ihnen.
• Hohe DurchsatzleistungscRNA-seq kann gleichzeitig die Expressionsniveaus zahlreicher Gene bewerten und bietet so eine ganzheitliche und detaillierte Sicht auf die Muster der genauen Expression in Zellen.
• Umfassendes Verständnis der zellulären EigenschaftenDurch die detaillierte Analyse der Genexpression auf Einzelzellebene können Forscher ein tieferes und nuancierteres Verständnis der zellulären Funktionen und intrinsischen Eigenschaften erlangen.
• Entdeckung neuer Zelltypen und KrankheitsmarkerscRNA-seq hilft bei der Entdeckung zuvor unbekannter Zelltypen und neuer Krankheitsmarker, was zu Fortschritten in der Krankheitsdiagnose und der Entwicklung gezielter Therapien beiträgt.
• Breites AnwendungsspektrumDiese vielseitige Technologie ist auf ein breites Spektrum von Proben anwendbar, einschließlich Geweben, Organen, Embryonen und Tumoren, und spielt eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Forschung in Bereichen wie Medizin, Ökologie und Umweltwissenschaften.

Anwendungen von scRNA-seq

Tumorforschung

• Offenlegung der Tumorzellheterogenität
• Überwachung des Tumorfortschritts
• Analyse von Immunzellen
• Mechanismen der Immunabwehr und Arzneimittelresistenz

Stammzell-Differenzierung

• Verfolgung von Genexpressionsänderungen
• Schlüsselregulatorgene und -wege

Neurobiologie

• Studium von neuronalen und glialen Zellen
• Erforschung der Genexpressionsdynamik in der neuronalen Entwicklung
• Untersuchung der molekularen Grundlagen neurologischer Erkrankungen

Entwicklungsbiologie

• Zellschicksalsbestimmung und Gewebebildung
• Verstehen von Entwicklungsstörungen und genetischen Erkrankungen

Immune Regulation

• Analyse der Genexpression in Immunzellen
• Immunantworten bei Infektionen, Entzündungen und Autoimmunerkrankungen

scRNA-seq-Workflow

Die Einführung von Zellsortierungs- und -partitionierungstechnologien, wie z.B. der Durchflusszytometrie und Mikrofluidik, hat es ermöglicht, Einzelzellen zu erfassen, und die DNA oder RNA einzelner Zellen wird für die Einzelzellsequenzierung amplifiziert. Der allgemeine Arbeitsablauf für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist unten skizziert.

Technikenbeschreibung

Fluidigm C1 Einzelzell-mRNA-WorkflowMit dem Fluidigm C1-System bieten wir einen Dienst zur Profilierung des Einzelzell-Transkriptoms in optionalem Umfang an. C1 kann einzelne Zellen schnell und zuverlässig erfassen und verarbeiten. Die Schritte im integrierten C1 Single-Cell mRNA Seq-Workflow umfassen fluidische Schaltungen (IFCs), um Zellen zu erfassen, polyA+ RNA in vollständiges cDNA umzuwandeln und eine universelle Amplifikation der cDNA durchzuführen. Mit den anpassbaren mikrofluidischen Schaltungen ermöglicht C1 einen nahtlosen Übergang von der Identifizierung kritischer Zellpopulationen zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die Transkript-3′-End-Zählung, die vollständige mRNA-Sequenzierung, DNA-Sequenzierung, epigenetische Analysen, Mikro-RNA-Expressionsprofilierung und mehr.

SMART-seq Ultra Low Input RNA für SequenzierungDie SMART-Technologie bietet Informationen zu vollständigen Transkripten und ermöglicht die Analyse von Transkript-Isoformen, Genfusionen, Punktmutationen usw. Das Kit, das diese Technologie verwendet, ermöglicht es den Nutzern, die cDNA-Synthese direkt aus 1–1.000 intakten Zellen oder ultra-niedrigem Gesamt-RNA-Eingang mit hoher Reproduzierbarkeit und genauer Darstellung von GC-reichen Transkripten durchzuführen. Vollständige cDNA-Bibliotheken, die mit diesem Kit hergestellt werden, sind mit Illumina-Plattformen kompatibel.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenart: Einzelzellensuspension, Frisches Gewebe Empfohlene Menge & Qualität: 2×106 Zellen Mindestmenge & Qualität: 1×106 Zellen Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Flexible Serviceoptionen umfassen HiSeq X und MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400.
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Erweiterte Zelltypcharakterisierung Verfeinerung von Zielzellpopulationen durch erneutes Clustern Gen-Set-Variationsanalyse (GSVA) Integrierte differenzielle Expressionsanalyse (iDEA) Evolution von Zellpopulationen Zuständen Vorgeschlagene Zeitanalyse Ratenanalyse für zelluläre Übergänge Trajektorienerkundung Weitere Datenanalyse auf Anfrage. Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Die Konferenz zur Einzelzell-Sequenzierung von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und beleuchtet weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen

1. Wu, AR u. a.Quantitative Bewertung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethoden. Naturmethoden2014 Januar; 11(1): 41–46.
2. Picelli, S u. a.Vollständiges RNA-seq von Einzelzellen mit Smart-seq2.Naturprotokolle2014 Jan;9(1):171-81.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Was ist der Zweck der Einzelzell-RNA-Sequenzierung?

Der Zweck der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) besteht darin, in die komplexe Welt der Genexpressionsprofile einzelner Zellen einzutauchen. Im Gegensatz zur traditionellen Bulk-RNA-Sequenzierung, die die Signale aus einer Mischung von Zellen mittelt, ermöglicht es scRNA-seq den Forschern, die einzigartige genetische Zusammensetzung jeder Zelle zu untersuchen. Diese Technologie ist entscheidend für die Aufdeckung zellulärer Heterogenität, die Identifizierung seltener Zelltypen, das Verfolgen von Entwicklungsprozessen auf granularer Ebene und das Verständnis, wie Zellen in verschiedenen biologischen Kontexten, einschließlich Krankheiten, unterschiedlich reagieren.

2. Was ist der Unterschied zwischen RNA-Seq und scRNA-seq?

Traditionell RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) typischerweise eine große Anzahl von Zellen als Eingabe erfordert, was zu einem durchschnittlichen Expressionsprofil einer gemischten Zellpopulation führt. Dieser Ansatz übersieht die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen. Im Gegensatz dazu analysiert die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) die Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen. Dies wird erreicht, indem die RNA-Transkripte jeder Zelle zufällig geprimt und amplifiziert werden, gefolgt von Hochdurchsatz-SequenzierungFolglich ermöglicht scRNA-seq die detaillierte Untersuchung der Genexpression in jeder einzelnen Zelle, wodurch die zelluläre Heterogenität aufgedeckt wird, die mit herkömmlichem RNA-Seq nicht erfasst werden kann.

3. Was ist der Nutzen der Pseudotime-Analyse?

In vielen biologischen Prozessen sind die Zellen nicht alle auf demselben zeitlichen Stand synchronisiert. Bei der Untersuchung der Zell-Differenzierung mittels Einzelzell-Genexpression umfassen die erfassten Zellen oft ein breites Spektrum unterschiedlicher Stadien: Einige Zellen haben mit der Differenzierung noch nicht begonnen, einige befinden sich in intermediären Zuständen, und andere haben die Differenzierung möglicherweise bereits abgeschlossen. Infolgedessen können die Genexpressionsprofile unter den Zellen in einer Probe erhebliche Variabilität aufweisen, was die Analyse recht komplex macht. Die Pseudotime-Analyse nutzt Genexpressionsdaten, um die zeitliche Distanz zwischen den Zellen zu schätzen. Durch die Berechnung dieser Distanz kann sie die Zellen entlang einer abgeleiteten Entwicklungsbahn anordnen, die den kürzesten Weg durch alle Zellen in ihrem Pseudotime-Fortschritt darstellt. Diese Methode hilft, die Arten von Zellen in der Probe und den gesamten Prozess der Zell-Differenzierung zu verstehen.

4. Wie bestimmt man die spezifischen Zelltypen in einem Cluster?

(1) Verwendung bekannter Marker-Gene

a. Basierend auf etablierten Marker-GenenAus früheren Forschungen und der Literatur ist bekannt, dass bestimmte Zelltypen spezifisch bestimmte Marker-Gene exprimieren, wie CD3/CD4 in T-Zellen oder CD19/CD20 in B-Zellen.

b. Identifizierung der Marker-Genexpression innerhalb von ClusternDurch die Nutzung von Werkzeugen wie dem Loupe Cell Browser oder anderer Software können Forscher Zellen, die spezifische Marker-Gene exprimieren, kennzeichnen, um zu schließen, welcher Cluster einem bestimmten Zelltyp entspricht.

c. Verwendung von differentiell exprimierten Genen oder Marker-Genen, die durch Software identifiziert wurden.Software wie Cell Ranger und monocle2 (oder andere Werkzeuge zur Einzelzellanalyse) liefert Ergebnisse zu differentiell exprimierten Genen innerhalb von Clustern. Wenn es bekannte Marker-Gene für einen Zelltyp gibt, können diese in der Liste der differentiell exprimierten Gene gesucht werden, um zu schließen, ob ein Cluster diesen Zelltyp repräsentiert.

(2) Bestimmung basierend auf funktionalen Wegen

a. Wenn spezifische Marker-Gene unbekannt sindWenn spezifische Marker-Gene in bestimmten Clustern nicht klar sind oder nicht gefunden werden können, können Forscher die Zellfunktionen basierend auf den Wegen, an denen unterschiedlich exprimierte Gene oder ko-exprimierte Gene beteiligt sind, ableiten, indem sie KEGG- und GO-Weganalysen nutzen. Dieser Ansatz hilft, die funktionalen Merkmale und somit die Identität der Zelltypen innerhalb der Cluster zu vermuten.

Die Einzelzell-Transkriptom-Profilierung zeigt die Heterogenität von Neutrophilen in der Homöostase und Infektion.

Internationale Zeitschrift für Molekulare Wissenschaften

Impactfaktor: 31,250

Veröffentlicht: 27. Juli 2020

Hintergrund

Neutrophile sind vielfältige Immunzellen, die zu infizierten Geweben migrieren und auf Entzündungen reagieren, indem sie Krankheitserreger aufnehmen und zerstören. Sie zeigen Heterogenität aufgrund von Differenzierung, mikroenvironmentalen Einflüssen und schneller Alterung, was ihre Funktion und Klassifikation beeinflusst. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung offenbart ihre unterschiedlichen transkriptionalen Profile und bietet Einblicke in Neutrophilen-Subpopulationen in verschiedenen physiologischen und Infektionszuständen.

Materialien und Methoden

Ergebnisse

In dieser Studie wurden Maus-Neutrophile aus Knochenmark, peripherem Blut und Milz mittels FACS analysiert. Qualitätskontrollierte Daten von 19.582 Zellen identifizierten sieben Hauptzellpopulationen und acht Cluster von differenzierenden und reifen Neutrophilen. Die Genexpressionsanalyse identifizierte 2.922 unterschiedlich exprimierte Gene und 24 Signaturgene, wobei Gene, die mit dem Zellzyklus in frühen Phasen der Neutrophilenreifung in Verbindung stehen, hervorgehoben wurden.

Abbildung 1. Einzelzell-RNA-seq-Analyse von Neutrophilen im steady-state Knochenmark (BM), peripherem Blut (PB) und Milz (SP).

Diese Studie untersucht die Heterogenität von Neutrophilgranula und bestätigt die Hypothese zur Biosynthesezeit für einige Proteine, identifiziert jedoch Inkonsistenzen, die auf alternative Sortierungsmechanismen hindeuten. Der Vergleich mit morphologiebasierten Klassifikationen stimmt mit molekularen Signaturen überein und validiert scRNA-seq neben Bulk-RNA-seq zum Verständnis der Reifungsstadien von Neutrophilen.

Abbildung 2. (a-f) Transkriptionslandschaft von Neutrophilen entlang der Differenzierungs- und Reifungswege.

Diese Studie verband scRNA-seq-definierte BM-Neutrophilenpopulationen (G0-G4) mit morphologiebasierten Subpopulationen. Die Marker CXCR2 und IFIT1 unterschieden die G3/G4- und G5-Subpopulationen im BM und PB und bestätigten die Identitäten durch charakteristische Genexpression. Die FACS-Analyse validierte die scRNA-seq-Ergebnisse für die Anteile der Neutrophilen-Subpopulationen.

Abbildung 3. Analyse der Neutrophilen-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie.

Bakterielle Infektionen verändern die Neutrophilenpopulationen im Knochenmark (KM). Sie erhöhen die G1-Zellproliferation und stabilisieren G2-Zellen. G3-Zellen differenzieren hauptsächlich in G4-Zellen, wobei G4-Zellen im KM abnehmen, aber im peripheren Blut (PB) und in der Milz (SP) zunehmen. Übergänge zwischen G5a, G5b und G5c werden während der Infektion unterdrückt, was insbesondere die G5c-Populationen reduziert. Die Geschwindigkeitsanalyse hebt die veränderten Dynamiken unter den Neutrophilen-Subpopulationen im KM, PB und SP während der Infektion hervor.

Abbildung 4. Bakterielle Infektionen programmieren die Struktur der Neutrophilenpopulation und den dynamischen Übergang zwischen den einzelnen Subpopulationen um.

Fazit

Diese Studie verwendet die Einzelzell-Transkriptom-Profilierung, um die Heterogenität und Reifung von Neutrophilen unter stabilen Bedingungen und bei bakteriellen Infektionen zu umreißen. Sie korreliert die durch scRNA-seq definierten Neutrophilenpopulationen mit traditionellen morphologiebasierten und zuvor identifizierten Knochenmarkunterpopulationen und hebt die unterschiedlichen transkriptionalen Profile reifer Neutrophilen im peripheren Blut hervor.

Referenz

1. Xie X, Shi Q, Wu P, et al. Die Einzelzell-Transkriptom-Profilierung zeigt die Heterogenität von Neutrophilen in der Homöostase und bei Infektionen. Natur Immunologie. 2020, 21(9):1119-33.