Richtlinien zur Einreichung von Proben
CD Genomics bietet robuste Transkriptomforschungsdienste bis hinunter zu Einzelzell-Eingangslevels in hochwertigen Proben an. Diese globalen Genexpressionsmuster in Einzelzellen haben die Zellbiologie bereits dramatisch vorangebracht.
Die Einführung in scRNA-seq
Zellen sind die grundlegende Einheit des Lebens und jede Zelle ist einzigartig. Die Fähigkeit, komplexe zelluläre Ereignisse in biologischen Systemen offenzulegen, ist entscheidend für ein besseres Verständnis der zellulären Beiträge während der Entwicklung oder im Krankheitsverlauf. Die Forschung zur Genexpression auf Einzelzellebene an Proben, die aus gemischten Zellpopulationen bestehen, ermöglicht tiefere Einblicke in die Transkriptomkomplexität verschiedener Zelltypen.
Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie, die entwickelt wurde, um die Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen zu erforschen. Das Aufkommen dieser Technologie hat es Forschern ermöglicht, die Genexpressionsprofile einzelner Zellen zu untersuchen und so Heterogenität und funktionale Unterschiede zwischen Zellen aufzudecken. Durch den Einsatz von scRNA-seq können Wissenschaftler umfassende Genexpressionsprofile einzelner Zellen erwerben, was die Offenlegung zellulärer Heterogenität, Entwicklungsverläufe und die Klassifizierung von Zelltypen erleichtert.
CD Genomics bietet erstklassige Werkzeuge zur Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung von einer einzelnen Zelle, wenigen Zellen und ultraniedrigen RNA-Eingaben. Durch die Kombination der robusten cDNA-Synthesetechnologie mit den Next-Generation-Sequenzierungs- und Analysetechnologien von Illumina bieten wir zuverlässige Daten von höchster Qualität, um die Heterogenität des Transkriptoms von Zelle zu Zelle zu untersuchen.
Vorteile von scRNA-seq
- Hohe EmpfindlichkeitDie Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) zeichnet sich durch die Erkennung von Genexpressionen mit niedriger Häufigkeit aus und ermöglicht die Identifizierung seltener Gene und Transkripte, die mit traditionellen Methoden möglicherweise übersehen werden.
- Hohe AuflösungDiese hochmoderne Technologie ermöglicht eine präzise Messung der Genexpression innerhalb einzelner Zellen und erhellt subtile Unterschiede sowie komplexe Differenzierungsprozesse zwischen ihnen.
- Hohe DurchsatzleistungscRNA-seq kann gleichzeitig die Expressionsniveaus zahlreicher Gene bewerten und bietet somit einen ganzheitlichen und detaillierten Überblick über die Muster der zellulären Genexpression.
- Umfassendes Verständnis der zellulären EigenschaftenDurch die detaillierte Analyse der Genexpression auf Einzelzellebene können Forscher ein tieferes und nuancierteres Verständnis der zellulären Funktionen und intrinsischen Eigenschaften erlangen.
- Entdeckung neuer Zelltypen und KrankheitsmarkerscRNA-seq hilft bei der Entdeckung zuvor unbekannter Zelltypen und neuer Krankheitsmarker, was zu Fortschritten in der Krankheitsdiagnose und der Entwicklung gezielter Therapien beiträgt.
- Breites AnwendungsspektrumDiese vielseitige Technologie ist auf ein breites Spektrum von Proben anwendbar, einschließlich Geweben, Organen, Embryonen und Tumoren, und spielt eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Forschung in Bereichen wie Medizin, Ökologie und Umweltwissenschaften.
Anwendungen von scRNA-seq
Tumorforschung
- Offenlegung der Tumorzellheterogenität
- Überwachung des Tumorfortschritts
- Analyse von Immunzellen
- Mechanismen der Immunflucht und Arzneimittelresistenz
Stammzell-Differenzierung
- Verfolgung von Genexpressionsänderungen
- Schlüsselregulatorische Gene und Signalwege
Neurobiologie
- Studium von neuronalen und glialen Zellen
- Erforschung der Genexpressionsdynamik in der neuronalen Entwicklung
- Untersuchung der molekularen Grundlagen neurologischer Erkrankungen
Entwicklungsbiologie
- Zellschicksalsbestimmung und Gewebebildung
- Verständnis von Entwicklungsstörungen und genetischen Erkrankungen
Immune Regulation
- Analyse der Genexpression in Immunzellen
- Immunantworten bei Infektionen, Entzündungen und Autoimmunerkrankungen
scRNA-seq Arbeitsablauf
Die Einführung von Zellsortierungs- und -partitionierungstechnologien, wie der Durchflusszytometrie und Mikrofluidik, hat es ermöglicht, Einzelzellen zu erfassen, und die DNA oder RNA von Einzelzellen wird für die Einzelzellsequenzierung amplifiziert. Der allgemeine Arbeitsablauf für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung ist unten skizziert.
Technikenbeschreibung
Fluidigm C1 Einzelzell-mRNA-WorkflowMit dem Fluidigm C1-System bieten wir einen Service zur Profilierung des Einzelzelltranskriptoms in optionalem Umfang an. C1 kann einzelne Zellen schnell und zuverlässig erfassen und verarbeiten. Die Schritte im integrierten C1 Single-Cell mRNA Seq-Workflow umfassen fluidische Schaltkreise (IFCs), um Zellen zu erfassen, polyA+ RNA in vollwertiges cDNA umzuwandeln und eine universelle Amplifikation der cDNA durchzuführen. Mit den anpassbaren mikrofluidischen Schaltkreisen ermöglicht C1 einen nahtlosen Übergang von der Identifizierung kritischer Zellpopulationen zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die Transkript-3′-End-Zählung, die Voll-Längen-mRNA-Sequenzierung, DNA-Sequenzierung, epigenetische Analysen, Mikro-RNA-Expressionsprofilierung und mehr.
SMART-seq Ultra Low Input RNA für die SequenzierungDie SMART-Technologie bietet Informationen zu vollständigen Transkripten, die eine Analyse von Transkript-Isoformen, Genfusionen, Punktmutationen usw. ermöglichen. Das Kit, das diese Technologie verwendet, ermöglicht es den Nutzern, die cDNA-Synthese direkt aus 1–1.000 intakten Zellen oder ultraniedrigen Eingangs-Gesamt-RNA mit hoher Reproduzierbarkeit und genauer Darstellung von GC-reichen Transkripten durchzuführen. Vollständige cDNA-Bibliotheken, die mit diesem Kit erzeugt werden, sind mit Illumina-Plattformen kompatibel.
Dienstspezifikationen
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Musteranforderungen
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Sequenzierungsstrategie
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Bioinformatikanalyse
Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an:
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Analyse-Pipeline
Liefergegenstände
- Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
- Experimentelle Ergebnisse
- Datenanalysebericht
- Details in der Einzelzell-RNA-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)
Die Konferenz zur Einzelzell-Sequenzierung von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und beleuchtet weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, können Sie uns gerne kontaktieren.
Referenzen
- Wu, AR u. a.Quantitative Bewertung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethoden. Naturmethoden2014 Januar; 11(1): 41–46.
- Picelli, S u. a.Vollständige RNA-Sequenzierung aus Einzelzellen mit Smart-seq2.Naturprotokolle2014 Jan;9(1):171-81.
Demonstrationsergebnisse
Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:
scRNA-seq häufig gestellte Fragen
1. Was ist der Zweck der Einzelzell-RNA-Sequenzierung?
Der Zweck der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) besteht darin, in die komplexe Welt der Genexpressionsprofile einzelner Zellen einzutauchen. Im Gegensatz zur traditionellen Bulk-RNA-Sequenzierung, die die Signale aus einer Mischung von Zellen mittelt, ermöglicht scRNA-seq den Forschern, die einzigartige genetische Zusammensetzung jeder Zelle zu untersuchen. Diese Technologie ist entscheidend, um zelluläre Heterogenität aufzudecken, seltene Zelltypen zu identifizieren, Entwicklungsprozesse auf granularer Ebene zu verfolgen und zu erläutern, wie Zellen in verschiedenen biologischen Kontexten, einschließlich Krankheiten, unterschiedlich reagieren.
2. Was ist der Unterschied zwischen RNA-Seq und scRNA-Seq?
Traditionell RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) typischerweise eine große Anzahl von Zellen als Eingabe erfordert, was zu einem durchschnittlichen Expressionsprofil einer gemischten Zellpopulation führt. Dieser Ansatz übersieht die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen. Im Gegensatz dazu analysiert die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) die Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen. Dies wird erreicht, indem die RNA-Transkripte aus jeder Zelle zufällig geprimt und amplifiziert werden, gefolgt von Hochdurchsatz-SequenzierungFolglich ermöglicht scRNA-seq die detaillierte Untersuchung der Genexpression in jeder einzelnen Zelle und offenbart damit die zelluläre Heterogenität, die traditionelle RNA-Seq nicht erfassen kann.
3. Was ist der Nutzen der Pseudotime-Analyse?
In vielen biologischen Prozessen sind die Zellen nicht alle auf demselben zeitlichen Stand synchronisiert. Bei der Untersuchung der Zelldifferenzierung mittels Einzelzell-Genexpression umfassen die erfassten Zellen oft ein breites Spektrum unterschiedlicher Stadien: Einige Zellen haben mit der Differenzierung noch nicht begonnen, einige befinden sich in intermediären Zuständen, und andere haben die Differenzierung möglicherweise bereits abgeschlossen. Infolgedessen können die Genexpressionsprofile unter den Zellen in einer Probe erhebliche Variabilität aufweisen, was die Analyse recht komplex macht. Die Pseudotime-Analyse nutzt Genexpressionsdaten, um die zeitliche Distanz zwischen den Zellen zu schätzen. Durch die Berechnung dieser Distanz kann sie die Zellen entlang einer abgeleiteten Entwicklungstrajektorie anordnen, die den kürzesten Weg durch alle Zellen in ihrem Pseudotime-Fortschritt darstellt. Diese Methode hilft, die Arten von Zellen in der Probe und den gesamten Prozess der Zelldifferenzierung zu verstehen.
4. Wie bestimmt man die spezifischen Zelltypen in einem Cluster?
(1) Verwendung bekannter Marker-Gene
a. Basierend auf etablierten Marker-GenenAus früheren Forschungen und Literatur ist bekannt, dass bestimmte Zelltypen spezifisch bestimmte Marker-Gene exprimieren, wie CD3/CD4 in T-Zellen oder CD19/CD20 in B-Zellen.
b. Identifizierung der Marker-Genexpression innerhalb von ClusternDurch die Nutzung von Werkzeugen wie dem Loupe Cell Browser oder anderer Software können Forscher Zellen, die spezifische Marker-Gene exprimieren, kennzeichnen, um zu schließen, welcher Cluster einem bestimmten Zelltyp entspricht.
c. Verwendung von differentiell exprimierten Genen oder Marker-Genen, die durch Software identifiziert wurden.Software wie Cell Ranger und monocle2 (oder andere Werkzeuge zur Einzelzell-Analyse) liefert Ergebnisse zu differentiell exprimierten Genen innerhalb von Clustern. Wenn es bekannte Marker-Gene für einen Zelltyp gibt, können diese in der Liste der differentiell exprimierten Gene gesucht werden, um zu schließen, ob ein Cluster diesen Zelltyp repräsentiert.
(2) Bestimmung basierend auf funktionalen Wegen
a. Wenn spezifische Marker-Gene unbekannt sindWenn spezifische Marker-Gene in bestimmten Clustern nicht klar sind oder nicht gefunden werden können, können Forscher die Zellfunktionen basierend auf den Wegen ableiten, an denen differentielle exprimierte Gene oder ko-exprimierte Gene beteiligt sind, indem sie KEGG- und GO-Weganalysen nutzen. Dieser Ansatz hilft, die funktionalen Merkmale und somit die Identität der Zelltypen innerhalb der Cluster zu vermuten.
scRNA-seq Fallstudien
Die Einzelzell-Transkriptomprofilierung zeigt die Heterogenität von Neutrophilen in der Homöostase und bei Infektionen.
Zeitschrift: Internationale Zeitschrift für Molekulare Wissenschaften
Impactfaktor: 31,250
Veröffentlicht: 27. Juli 2020
Hintergrund
Neutrophile sind vielfältige Immunzellen, die in infizierte Gewebe migrieren und auf Entzündungen reagieren, indem sie Krankheitserreger aufnehmen und zerstören. Sie zeigen Heterogenität aufgrund von Differenzierung, mikroenvironmentalen Einflüssen und schneller Alterung, was ihre Funktion und Klassifizierung beeinflusst. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung zeigt ihre unterschiedlichen transkriptionalen Profile und bietet Einblicke in Neutrophilen-Subpopulationen in verschiedenen physiologischen und Infektionszuständen.
Materialien & Methoden
Probenvorbereitung
- Mausstämme
- Maus-Neutrophilen-Isolation
- Probenentnahme beim Menschen
- Peripheres Blut
- Einzelzellensammlung
- Gesamte RNA-Extraktion
Sequenzierung
- Bibliotheksbau
- Illumina NovaSeq6000
- RNA-Seq
- scRNA-seq
- Batch-Korrektur
- Dimensionsreduktion
- Unüberwachtes Clustering und Annotation
- Identifizierung von differentiell exprimierten Genen
- Differenzielle Aktivitätsanalyse
- RNA-Geschwindigkeit-Analyse
Ergebnisse
In dieser Studie wurden Maus-Neutrophile aus Knochenmark, peripherem Blut und Milz mittels FACS analysiert. Qualitätskontrollierte Daten von 19.582 Zellen identifizierten sieben Hauptzellpopulationen und acht Cluster von differenzierenden und reifen Neutrophilen. Die Analyse der Genexpression identifizierte 2.922 differentielle exprimierte Gene und 24 Signaturgene, wobei der Schwerpunkt auf genzyklusbezogenen Genen in den frühen Phasen der Neutrophilenreifung lag.
Abbildung 1. Einzelzell-RNA-seq-Analyse von Neutrophilen im stabilen Zustand aus Knochenmark (BM), peripherem Blut (PB) und Milz (SP).
Diese Studie untersucht die Heterogenität von Neutrophilgranula und bestätigt die Hypothese zur Biosynthesezeit für einige Proteine, identifiziert jedoch Inkonsistenzen, die auf alternative Sortierungsmechanismen hindeuten. Der Vergleich mit morphologiebasierten Klassifikationen stimmt mit molekularen Signaturen überein und validiert scRNA-seq neben Bulk-RNA-seq für das Verständnis der Reifungsstadien von Neutrophilen.
Abbildung 2. (a-f) Transkriptionslandschaft von Neutrophilen entlang der Differenzierungs- und Reifungswege.
Diese Studie verband scRNA-seq-definierte BM-Neutrophilenpopulationen (G0-G4) mit morphologiebasierten Subpopulationen. Die Marker CXCR2 und IFIT1 unterschieden die G3/G4- und G5-Subpopulationen im BM und PB und bestätigten die Identitäten durch die Expression charakteristischer Gene. Die FACS-Analyse validierte die scRNA-seq-Ergebnisse hinsichtlich der Anteile der Neutrophilen-Subpopulationen.
Abbildung 3. Analyse der Neutrophilen-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie.
Bakterielle Infektionen verändern die Neutrophilen-Populationen im Knochenmark (KM). Sie erhöhen die Proliferation von G1-Zellen und stabilisieren G2-Zellen. G3-Zellen differenzieren hauptsächlich in G4-Zellen, wobei G4-Zellen im KM abnehmen, aber im peripheren Blut (PB) und in der Milz (SP) zunehmen. Übergänge zwischen G5a, G5b und G5c werden während der Infektion unterdrückt, insbesondere die G5c-Populationen. Die Geschwindigkeitsanalyse hebt die veränderten Dynamiken unter den Neutrophilen-Subpopulationen im KM, PB und SP während der Infektion hervor.
Abbildung 4. Bakterielle Infektionen programmieren die Struktur der Neutrophilenpopulation und den dynamischen Übergang zwischen den einzelnen Subpopulationen um.
Fazit
Diese Studie verwendet die Einzelzell-Transkriptom-Profilierung, um die Heterogenität und Reifung von Neutrophilen unter stabilen Bedingungen und bei bakteriellen Infektionen zu untersuchen. Sie korreliert die durch scRNA-seq definierten Neutrophilenpopulationen mit traditionellen morphologiebasierten und zuvor identifizierten Knochenmark-Subpopulationen und hebt die unterschiedlichen Transkriptionsprofile reifer Neutrophilen im peripheren Blut hervor.
Referenz
- Xie X, Shi Q, Wu P, et al. Die Einzelzell-Transkriptom-Profilierung zeigt die Heterogenität von Neutrophilen in der Homöostase und bei Infektionen. Natur Immunologie. 2020, 21(9):1119-33.
