Einzelzell-DNA-Methylierungs-Sequenzierung

CD Genomics bietet eine Einzelzell-DNA-Methylierungsanalyse an, um die Heterogenität der genomweiten 5-Methylcytosin (5mC)-Muster zu verstehen.

Die Einführung der Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung

DNA-Methylierung wird als ein wesentlicher Beitrag zur normalen Entwicklung und Regulation der Genexpression anerkannt. Sie ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellulären Identität und ist mit einer Reihe von Schlüsselprozessen verbunden, einschließlich genomischer Prägung, Inaktivierung des X-Chromosoms, Repression von transponierbaren Elementen, Alterung und Karzinogenese. Die derzeitige Methode zur Erforschung der DNA-Methylierung erfolgt ausschließlich durch einen Bulk-Ansatz, wie zum Beispiel Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS), reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS)und MeDIP-SequenzierungWir kombinieren die hochinnovative Einzelzell-WGBS-Bibliotheksvorbereitung und Illumina. Next-Generation-Sequenzierung Technologie zur Visualisierung von genomischen Methylierungszuständen mit Einzelzellauflösung. Die Einzelzell-Ganzgenom-Bisulfid-Sequenzierung ermöglicht die Entdeckung von zellulärer Heterogenität, die typischerweise durch standardisierte Bulk-Methylierungssequenzierung maskiert wird. Wir bieten einen optimierten Arbeitsablauf zur Erstellung von WGBS Bibliotheken. Die Eingangs-DNA wird während des anfänglichen Bisulfitbehandlungs-Schrittes zufällig fragmentiert, gefolgt von der WGBS-Bibliotheksvorbereitung. Das Verfahren kann ultra-niedrige DNA-Eingaben verarbeiten, was es ideal für die Methylierungsanalyse von wertvollen, begrenzten und zielangereicherten Proben macht.

Was sind die Vorteile der Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung?

• Hochauflösende Einzelzell-Methylierungsprofilierung: Dieser methodische Ansatz ermöglicht den Erwerb komplexer Methylierungslandschaften auf Einzelzellebene. Er fungiert als Katalysator für das Eintauchen in zelluläre Heterogenität und dynamische Veränderungen, wodurch unser Verständnis von zellulärer Diversität und Zustandsübergängen vorangetrieben wird.
• Aufdeckung von zellulären Zustandsübergängen und evolutionären Trajektorien: Durch die sorgfältige Verfolgung der Methylierungsdynamik in einzelnen Zellen enthüllt diese Methodik die komplexe Choreografie von zellulären Zustandsübergängen und Entwicklungstrajektorien. Solche Enthüllungen bieten wertvolle Einblicke in die molekularen Grundlagen der zellulären Entwicklung und Evolution.
• Aufdeckung funktionaler Unterschiede zwischen einzelnen Zellen: Durch eine sorgfältige vergleichende Analyse der Methylierungsprofile beleuchtet diese Methode funktionale Unterschiede zwischen einzelnen Zellen und erklärt damit potenzielle Mechanismen, die die Zellfunktion und die epigenetische Regulation steuern.
• Minimale DNA-Eingabeforderung: Diese Technik ist durch ihren minimalen Bedarf an DNA-Eingabe gekennzeichnet und ermöglicht das Erreichen von ultraniedrigen Nachweisgrenzen mit nur einer geringen Anzahl von Zellen.
• Bioinformatische Prüfung: Die gesammelten Daten ebnen den Weg für umfassende und komplexe bioinformatische Analysenund bietet reichhaltige Informationsinhalte für eine sorgfältige Prüfung.
• Bewertung der Datenqualität: Parameter wie Mapping-Verhältnis und Redundanz spiegeln eng die der konventionellen wider. WGBS Daten, wodurch die Integrität und Zuverlässigkeit der gewonnenen Daten sichergestellt wird.

Was sind die Anwendungen der Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung?

Im Bereich der wissenschaftlichen Forschung werden Untersuchungen zu Methylierungsmustern in Einzelzellen und winzigen, seltenen Proben überwiegend in verschiedenen Forschungsbereichen angewendet, wie der Aufklärung der Tumoretiologie, Krebsstudien, Diagnostik von Präimplantationsembryonen, der frühen embryonalen Entwicklung, der Rekombination von Keimzellen, der Stammzellforschung und der Erforschung zellulärer Heterogenität. Diese Bestrebungen umfassen häufig Proben wie Einzelzellen, winzige Zellpopulationen und Spuren von DNA. Diese Methodik eignet sich besonders gut zur Analyse schwer zu beschaffender, schwer fassbarer Proben und von Gewebeproben, die eine signifikante zelluläre Heterogenität aufweisen.

• Tumorheterogenität: Enthüllung der Methylierungslandschaft von Krebszellen.
• Zell-Differenzierung: Kartierung epigenetischer Regulierungsnetzwerke der zellulären Differenzierung.
• Immuns mikroenvironment: Aufklärung der epigenetischen Regulationsmechanismen, die der Aktivierung, Differenzierung und anderen Prozessen von Immunzellen zugrunde liegen.
• Neurowissenschaften: Subtypklassifikation von Nervenzellen und Erforschung der molekularen Mechanismen, die neurobezogene Störungen zugrunde liegen.

Einzelzell-DNA-Methylierungs-Sequenzierungs-Workflow

Mit der Post-Bisulfid-Bibliotheksvorbereitung für WGBSDer Workflow kann in wenigen Stunden abgeschlossen werden. Der allgemeine Workflow für die Methylierungssequenzierung von Einzelzellen ist unten skizziert.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Für dieses Verfahren werden 96-Well-Platten mit lebenden Zellensuspensionen empfohlen. Gefrorene Zellen in speziell gefrorenen Lysaten können ebenfalls als Ausgangsmaterial verwendet werden. ScWGBS Probenart: Zelllinien, primäre Zellen, frisches Gewebe, gefrorene Zellen; Empfohlene Menge & Qualität: Verwenden Sie 200µl PCR-Röhrchen zur Aufbewahrung von Zellen (einzelne oder mehrere Zellen), 5µl Lysat pro Röhrchen und nicht mehr als 1µl Puffer beim Sammeln von Zellen. ≥3 biologische Replikate. ScRRBS Probenart: Zelllinien, primäre Zellen, frisches Gewebe, gefrorene Zellen; Empfohlene Menge & Qualität: Verwenden Sie 200µl PCR-Röhrchen zur Lagerung von Zellen (einzelne oder mehrere Zellen), 5µl Lysat pro Röhrchen und nicht mehr als 1µl Puffer beim Sammeln der Zellen. ≥3 biologische Replikate. >100 ng extrahierte DNA sollte frei von enzymatischen Inhibitoren sein und kann in Wasser, TE oder einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt suspendiert werden.
	Sequenzierung Flexible Serviceoptionen umfassen HiSeq X
	Bioinformatikanalyse Ausrichtung gegen ein Referenzgenom Sequenztiefe und Abdeckungsanalyse mC anrufen Methylierungsgradanalyse Globale Trends des Methyloms Methylierungsdichteanalyse Differenziell methilierte Regionen (DMRs) Analyse DMR-Annotation und Anreicherungsanalyse (GO/KEGG) Clusteranalyse

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Die Konferenz zur Einzelzellsequenzierung von CD Genomics konzentriert sich auf die Zusammenhänge zwischen Zellvariationen in Geweben und der Organfunktion und erläutert weiter die Ursprünge von Krankheiten. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenz:

1. Gravina, S et al. Einzelzell-Genome-weites Bisulfid-Sequencing deckt umfangreiche Heterogenität im Methylom der Mausleber auf. Genomik Biologie, 2016 17(1):150.

1. Was sind die Vorteile der Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung?

Die Nutzung von Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung bietet mehrere Vorteile. Primär ermöglicht sie die Untersuchung der Heterogenität, die zwischen einzelnen Zellen beobachtet wird, die Verfolgung seltener Zellpopulationen und die genaue Überwachung dynamischer Veränderungen in der DNA-Methylierung während Entwicklungsphasen oder dem Fortschreiten von Krankheiten. Dies verdeutlicht zellspezifische epigenetische Fingerabdrücke und erleichtert die Untersuchung der epigenetischen Regulation auf individueller Zellbasis.

2. Welche Herausforderungen sind mit der DNA-Methylierungssequenzierung auf Einzelzellebene verbunden?

Trotz einer Vielzahl von Vorteilen ist die Praxis der DNA-Methylierungssequenzierung auf Einzelzellen nicht ohne Herausforderungen. Vor allem umfasst sie komplexe technische Nuancen wie die Isolation und Amplifikation einzelner Zellen, die zusammen mit der finanziellen Belastung und der Komplexität der Sequenzierung einzelner Zellen erhebliche Hindernisse darstellen. Darüber hinaus treten während der Datenanalyse erhebliche Herausforderungen auf, angesichts der Sparsamkeit von Einzelzelldaten. epigenomisch Daten und die anschließende Anforderung an maßgeschneiderte bioinformatische Apparate.

3. Wie trägt die Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung dazu bei, unser Verständnis von Biologie und Krankheiten zu erweitern?

Die Einzelzell-DNA-Methylierungssequenzierung bahnt unseren Weg zum Verständnis der Variationen zwischen einzelnen Zellen, ihrer Rollen in biologischen Entwicklungsprozessen und den Mechanismen hinter Krankheiten. Indem sie epigenetische Nuancen innerhalb einzelner Zellen ans Licht bringt, entschlüsselt die Technik die Komplexität der Zellschicksalsbestimmung, der Geweberegeneration und der Krankheitsverläufe. Sie besitzt großes Potenzial, neuartige therapeutische Ziele zu enthüllen und somit die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich bösartiger Tumoren und neurologischer Störungen, zu verbessern.

4. Was sind die Unterschiede zwischen Einzelzellmethoden, die auf RRBS basieren, und Einzelzellmethoden, die auf WGBS basieren?

Abdeckung:

RRBSRRBS ist speziell entwickelt worden, um CpG-Inselregionen im Genom durch einen Mechanismus namens Restriktionsenzymverdau zu untersuchen. Obwohl seine genomische Breite begrenzt ist, bietet es aufgrund dieser spezifischen Zielsetzung eine bemerkenswerte Tiefenabdeckung.

WGBS: Im Gegensatz zu RRBS untersucht WGBS das Methylierungsmuster des gesamten Genoms, das sowohl CpG-Inseln als auch Chromatinregionen mit schwacher Methylierung umfasst. Obwohl eine umfassendere genomische Abdeckung geboten wird, ist die Tiefenabdeckung oft beeinträchtigt.

Tiefe und Auflösung:

RRBSÜberwiegend aufgrund seiner spezialisierten Anreicherung von CpG-Inselregionen bietet RRBS häufig eine robuste Tiefenabdeckung, obwohl die Auflösung verringert ist, was die Fähigkeit beeinträchtigt, nicht-CpG-Inselregionen im Genom zu erkennen.

WGBS: Alternativ betrachtet könnte die Tiefe von WGBS, da es das gesamte Genom abdeckt, insbesondere im Kontext der Einzelzellsequenzierung, im Vergleich zu RRBS potenziell beeinträchtigt sein. Dennoch ermöglicht die überlegene Auflösung von WGBS die Erfassung breiterer genomischer Methylierungsmuster.

Datenvolumen und analytische Komplexität:

RRBS: Angesichts seines eingeschränkten Zielspektrums wird das Datenvolumen, das erzeugt wird, von RRBS ist relativ kompakt, was die nachfolgende Datenverarbeitung vereinfacht.

WGBS: Im Gegensatz dazu, WGBS typischerweise zu einem enormen Datenvolumen führt, was eine erweiterte Speicher- und Rechenkapazität erforderlich macht. Folglich führt dies oft zu komplexeren Datenverarbeitungs- und Interoperabilitätsverfahren.

Anwendungen:

RRBS: Wo die Untersuchung der Methylierung innerhalb von CpG-Insel-Domänen betroffen ist, RRBS leuchtet als optimale Wahl. Es ist besonders geschickt darin, in Methylierungsereignisse einzutauchen, die für die Funktionalität des Genoms und dessen epigenetische Regulation von entscheidender Bedeutung sind.

WGBS: Auf der anderen Seite, WGBS präsentiert sich als eine überlegene Wahl für die umfassende Erläuterung von genomweiten Methylierungsmustern. Es ist entscheidend für die Offenlegung globaler Methylierungskonturen und hilft bei der Untersuchung von Methylierungsereignissen, die spezifisch für Zelltypen sind und solchen, die anfällig für dynamische Veränderungen sind.

Einzelzell-DNA-Methylom-Sequenzierung von menschlichen Präimplantationsembryonen

Zeitschrift: Naturgenetik
Impactfaktor: 27,125
Veröffentlicht: 18. Dezember 2017

Hintergrund

In Säugetiergenomen unterliegt Cytosin, hauptsächlich in CpG-Dinukleotiden, einer Methylierung unter der Katalyse von DNA-Methyltransferasen. Forschungen haben gezeigt, dass die DNA-Methylierung entscheidend für zahlreiche biologische Prozesse ist, einschließlich der Repression der Genexpression, der Regulierung der transposonalen Transkriptionsaktivität, der Inaktivierung des X-Chromosoms und der Aufrechterhaltung der genomischen Prägung. Frühere Studien haben auf eine großflächige DNA-Demethylierung während der präimplantatorischen embryonalen Entwicklung hingewiesen. Aktuelle Forschungsdaten deuten jedoch darauf hin, dass nach der Befruchtung durch Spermien und der Fusion mit der Eizelle neben einer massiven DNA-Demethylierung in frühen menschlichen Embryonen auch eine umfangreiche, hochspezifische de novo DNA-Methylierung stattfindet. Dies impliziert, dass das „Nettoergebnis“ der globalen DNA-Demethylierung während der ersten Runde der Reprogrammierung des DNA-Methyloms in frühen menschlichen Embryonen tatsächlich als ein dynamisches Gleichgewicht manifestiert, das durch den Wettstreit des umfangreichen organisierten DNA-Demethylierungsprozesses und der lokalisierten DNA-Methylierung.

Methoden

Ergebnisse

In dieser Untersuchung führten wir eine Einzelzell-PBAT-DNA-Methylom-Sequenzierungsanalyse an einer Kohorte von 480 einzelnen Zellen durch. Diese Kohorte umfasste 50 menschliche Eizellen, bestehend aus 42 reifen Eizellen und 8 Keimblasen (GV) Eizellen, sowie 23 einzelnen Spermienzellen und 62 Präimplantationsembryonen. Das Sequenzierungsprojekt ergab einen erheblichen Datensatz von insgesamt 6,5 Terabyte. Im Durchschnitt wurde jede einzelne Zelle mit 8,4 Gigabyte sequenziert, was eine Abdeckung von etwa 10,8 Millionen CpG-Stellen (≥1×) ermöglichte. Bemerkenswerterweise identifizierte unsere Analyse 3 aneuploide Eizellen und 33 Embryonen, die mindestens ein aneuploides Blastomere aufwiesen. Diese abweichenden Proben wurden anschließend von weiterer analytischer Untersuchung ausgeschlossen.

Detaillierte Untersuchungen haben drei Wellen der globalen Demethylierung während der Entwicklung von Präimplantationsembryonen aufgedeckt. Die erste Welle, die innerhalb der ersten 10 bis 12 Stunden nach der Befruchtung auftrat, zeigte einen signifikanten Rückgang der DNA-Methylierungsniveaus sowohl im väterlichen als auch im mütterlichen Genom. Weitere Wellen der Demethylierung wurden vom späten Zygotenstadium bis zum Zweizellstadium und vom Achtzellstadium bis zum Morulastadium beobachtet, mit unterschiedlichen Methylierungsdynamiken in genomischen Regionen, die reich an Enhancern, Genkörpern, Introns und SINEs sind.

Abb. 1. De novo Methylierungsmuster in frühen menschlichen Embryonen.

Zusätzlich wurden drastische de novo DNA-Methylierungsereignisse während der Präimplantationsentwicklung beobachtet, insbesondere während zweier unterschiedlicher Wellen: vom frühen männlichen Pronukleus bis zur mittleren Pronukleus-Phase und von der Vier-Zell- bis zur Acht-Zell-Phase. Diese de novo methylierten Regionen waren überwiegend angereichert mit Wiederholungselementen wie SINEs, LINEs und LTRs, was auf einen Mechanismus zur Repression ihrer transkriptionellen Aktivität hindeutet.

Abb. 2. Dynamik der DNA-Methylierung von de novo-methylierte Regionen und Anreicherungsanalyse der Demethylierungsregionen.
Darüber hinaus wurden Unterschiede in den Demethylierungsdynamiken zwischen dem väterlichen und mütterlichen Genom aufgeklärt, wobei das väterliche Genom während der frühen embryonalen Stadien schnellere Demethylierungsraten aufwies als das mütterliche Genom. Bemerkenswerterweise hielt das Methylierungsmuster, das das mütterliche Genom begünstigte, während der gesamten Entwicklung vor und nach der Implantation in embryonalen und extra-embryonalen Linien an.

Schließlich offenbarte die Untersuchung von unterschiedlich methylierten Regionen (DMRs) zwischen Eizellen und Spermien spezifische genomische Stellen, die für väterliche und mütterliche DMRs angereichert sind. Diese Ergebnisse unterstreichen die elternspezifischen DNA-Methylierungsmuster, die eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Genexpression und der genomischen Prägung während der embryonalen Entwicklung spielen.

Abb. 3. Charakterisierung von gamet-spezifischen unterschiedlich methylierten Regionen.

Fazit

In dieser Untersuchung begaben wir uns auf eine Reise, um die dynamischen Feinheiten der DNA-Methylierungs-Reprogrammierung auf Einzelzellebene eingehender zu erforschen. Mit modernster Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie führten wir eine Einzelzell-Whole-Genome-DNA-Methylierungsanalyse durch. Dieser wegweisende Ansatz ermöglichte es uns, die entscheidenden Phasen der menschlichen Präimplantations-embryonalen Entwicklung mit beispielloser Präzision systematisch zu überprüfen und Einblicke auf Einzelzellebene und auf Einzelbasenauflösung zu gewinnen. Unsere Erkundungen führten zu mehreren wegweisenden Entdeckungen:

(1) Enthüllung spezifischer de novo DNA-Methylierung: Zum ersten Mal haben wir das Vorhandensein eines erheblichen Volumens spezifischer de novo DNA-Methylierung im Verlauf der menschlichen präimplantatorischen embryonalen Entwicklung enthüllt.
(2) Enthüllungen über die Dynamik der Methylierung des elterlichen Genoms: In einer bahnbrechenden Enthüllung beobachteten wir eine Umkehrung der verbleibenden Methylierungsniveaus auf den elterlichen Genomen, beginnend mit der Zwei-Zell-Embryo-Phase. Interessanterweise überstiegen innerhalb derselben einzelnen Zelle die verbleibenden Methylierungsniveaus des mütterlichen Genoms erheblich die des väterlichen Genoms.
(3) Einblicke in die asymmetrische Verteilung der DNA-Methylierung: Unsere Studie hat erstmals gezeigt, dass die asymmetrische Verteilung der DNA-Methylierung während der frühen embryonalen Teilung vielversprechend als Werkzeug zur Verfolgung der genetischen Abstammung einzelner Zellen innerhalb desselben Embryos ist.

Referenz:

1. Zhu P, Guo H, Ren Y, et al. Einzelzell-DNA-Methylom-Sequenzierung von menschlichen Präimplantationsembryonen. Naturgenetik, 2018, 50(1): 12-19.