Gezielte Bisulfid-Sequenzierung

Als führender Anbieter von NGS Als Partner von Illumina ist CD Genomics darauf spezialisiert, ein Portfolio von Lösungen für epigenetische Studien anzubieten. Gekennzeichnet durch geringe Probenanforderungen, hohe Auflösung, Effizienz und Wirtschaftlichkeit, stellt das gezielte Bisulfid-Sequencing ein geeignetes Werkzeug zur Analyse des Methylierungsstatus gezielter genomischer Regionen dar. Mit über 10 Jahren professioneller Erfahrung können wir Ihre Projektanforderungen und Budgets bei der Erforschung des Methyloms vollständig erfüllen.

Die Einführung der gezielten Bisulfit-Sequenzierung

DNA-Methylierung, die am häufigsten an Cytosinen in den CpG-Stellen auftritt, spielt eine wichtige Rolle bei der Genexpression und -regulation. Die Fähigkeit, DNA-Methylierung präzise und effizient zu erkennen und zu bewerten, trägt dazu bei, unser Verständnis der DNA-Methylierung in Entwicklung und Krankheit zu verbessern. Während die Ganzgenom-Bisulfid-Sequenzierung methylierte Cytosine im gesamten Genom identifiziert, ist die gezielte Bisulfid-Sequenzierung eine genaue, effiziente und wirtschaftliche Technologie zur Analyse der DNA-Methylierung in Zielregionen. Diese kann einen hybridisierungsbasierten Schritt auf Plattformen umfassen, die vorgefertigte Oligos enthalten, die die CpG-Inseln, Genpromotoren und andere signifikante methylierte Regionen erfassen, oder einen PCR-basierten Schritt, um mehrere bisulfid-konvertierte DNA-Regionen in einer einzigen Reaktion zu amplifizieren. Es sind kommerziell gestaltete Capture-Bibliotheken mit einer Reihe von epigenetischen Merkmalen verfügbar, die etwa 12% bis 24% aller CpGs im Genom abdecken. Darüber hinaus werden spezifische Primer entworfen, um die Zielregion zu erfassen und standortspezifische Veränderungen der DNA-Methylierung zu bewerten.

Vorteile der gezielten Bisulfit-Sequenzierung

• Einzelbasenauflösende DNA-Methylierungsmusterung selektiver Regionen.
• Erhöhte Genauigkeit und Empfindlichkeit bei gleichzeitiger Senkung Ihrer Gesamtkosten.
• Ermöglicht eine bessere Bestimmung sowohl von SNPs als auch von Methylierungsstatusereignissen.
• Ein besseres Verständnis von Entwicklung und Krankheit vermitteln.

Anwendung der gezielten Bisulfit-Sequenzierung

• Forschung zu Mechanismen der Genregulation
• Methylierungsmarker-Screening
• Methylierungsvalidierung
• Forschung zur Tier- und Pflanzenzucht
• Klinische großangelegte multizentrische Methylierungsstudien

Gezielte Bisulfid-Sequenzierung Arbeitsablauf

Unser hochqualifiziertes Expertenteam und die strenge Qualitätskontrolle nach jedem Verfahren gewährleisten umfassende und präzise Ergebnisse. Im Prozess der gezielten Bisulfit-Sequenzierung wird die genomische DNA bisulfitkonvertiert und mithilfe speziell entworfener und validierter Primer oder Sonden multiplex amplifiziert. Die Amplicons werden durch Barcoding und Adapterisierung zusammengeführt. Die Amplicon-Bibliotheken werden anschließend mit Illumina HiSeq-Plattformen sequenziert.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen und Vorbereitung Probenquellen einschließlich Menschen, Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen Genomisches DNA: Empfohlene Menge ≥500 ng; Minimale Menge: 50 ng, Konzentration ≥10 ng/µl, OD260/280 = 1,8~2,0 Zelle: Empfohlene Menge ≥ 1×106 Gewebe: Empfohlene Menge ≥ 20 mg Das Protokoll zur Probenvorbereitung umfasst wahrscheinlich die Extraktion, Reinigung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle von genomischer DNA usw.
	Sequenzierung Illumina HiSeq-Plattformen, paired-end 150 bp Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert Sequenzierungstiefe > 100X
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Rohdatenstatistiken Ausrichtung gegen Referenzgenom Methylierungsstellenvorhersage & CG-, CHG-, CHH-Kategorisierung Schätzung des DNA-Methylierungsniveaus und des Verteilungstrends 5mC-Spiegel in verschiedenen genetischen Strukturelementen Identifikation von differentiell methylierten Regionen Funktionsannotation der proximate Gene in der Nähe von differentiell methylierten Regionen Multi-Proben-Methylierungsdifferenzialanalyse

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur gezielten Bisulfid-Sequenzierung für Ihre Schreibweise (Anpassung)

CD Genomics bietet hochwertige Daten und integrierte bioinformatische Analyse-Dienstleistungen für gezielte Bisulfit-Sequenzierung an, einschließlich Bisulfit-Konversion, Primer-/Sonden-Design und Validierung, Hybridisierung/PCR-Amplifikation, Bibliotheksvorbereitung, DNA-Sequenzierung und Datenanalyse. CD Genomics verwendet sowohl kommerziell entworfene Capture-Arrays als auch maßgeschneiderte Capture-Bibliotheken, um Ihre Forschungsziele vollständig zu erfüllen. Bitte zögern Sie nicht, uns für weitere Informationen zu kontaktieren. Wir freuen uns auf eine Zusammenarbeit mit Ihnen in naher Zukunft.

Referenz:

1. Ziller M. J. et al. Zielgerichtete Bisulfid-Sequenzierung des dynamischen DNA-Methyloms. Epigenetik & Chromatin, 2016, 9(1): 55.

1. Wann sollten Sie sich für gezielte Bisulfit-Sequenzierung entscheiden?

Die Technologie der gezielten Bisulfit-Sequenzierung kombiniert die Bisulfit-Konversion mit der gezielten Amplifikation von Regionen von Interesse, und die Next-Generation-SequenzierungEs ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur Analyse von bis zu 10 kb gezielter genomischer Regionen in bis zu 96 Proben gleichzeitig. Die Ergebnisse bieten eine absolute Quantifizierung der Cytosin-Methylierung mit Einzelbasenauflösung. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Ergebnisse zu bestätigen, die aus Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierungund methylierte DNA-Immunpräzipitations-SequenzierungGezielte Bisulfid-Sequenzierung ermöglicht eine bessere Bestimmung von SNPs und Methylierungsstatusereignissen sowie ein besseres Verständnis menschlicher Krankheiten.

2. Was sind die Vorteile der gezielten Bisulfit-Sequenzierung im Vergleich zu anderen Technologien der Methylierungssequenzierung?

Im Vergleich zu Studien zur Methylierungsprofilierung des gesamten Genoms ist die Methylierungsdetektion nur ausgewählter Kandidatenregionen ein praktikablerer Ansatz, der die Methylierungsanalyse in verschiedenen Umgebungen machbarer und zugänglicher macht. Die gezielte Bisulfid-Sequenzierung erhöht die Datenmenge erheblich und senkt die Kosten. Gleichzeitig ist sie auch in der Lage, den Methylierungsstatus von Regionen zu erfassen, die nicht erkannt werden können durch RRBS (reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung) oder Immunopräzipitation Ansätze. Zielgerichtete Bisulfid-Sequenzierung wurde umfassend für die Methylierungssequenzierung und Validierung großer Stichprobenkohorten in Zielregionen angewendet.

3. Wie entwirft man geeignete Sonden oder Primer?

Eine erfolgreiche Anwendung der gezielten Bisulfit-Sequenzierung hängt weitgehend von der richtigen Gestaltung von Sonden und Primern ab. Es gibt viele effektive Werkzeuge zur automatischen Erstellung von Sonden oder Primern, wie ppDesigner (http://genome-tech.ucsd.edu/public/Gen2_BSPP/ppDesigner/ppDesigner.php) und PRIMEGENSw3 (http://primegens.org). Nach dem Erhalt vieler Sonden- oder Primerkandidaten ist der Validierungsprozess wichtig, um die optimalsten auszuwählen.

4. Wie ist der Workflow des gezielten Bisulfit-Sequenzierens?

Der Arbeitsablauf der PCR-basierten gezielten Bisulfit-Sequenzierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei der hybridisierungsbasierten gezielten Bisulfit-Sequenzierung kann entweder die Bisulfit-Konversion von hybrid-selektiertem nativen DNA oder die Hybridselektion von konvertierter DNA durchgeführt werden. Letzterer Ansatz ist mittlerweile kommerziell verfügbar und zeichnet sich durch eine überlegene Zielgenauigkeit, geringere DNA-Eingangsvoraussetzungen und die Fähigkeit aus, eine C-zu-U-Bisulfit-Konversion von einem C-zu-T-SNP zu unterscheiden.

Abbildung 1. Der Arbeitsablauf der PCR-basierten gezielten Bisulfid-Sequenzierung.

Gezielte Methylierungssequenzierung zeigt dysregulierte Wnt-Signalgebung bei Parkinson-Krankheit

Zeitschrift: Zeitschrift für Genetik und Genomik

Impactfaktor: 4,051

Veröffentlicht: 20. Oktober 2016

Hintergrund

Umwelt- und genetische Faktoren spielen eine entscheidende Rolle in der Ätiologie der Parkinson-Krankheit. Bis jetzt haben wir verstanden, dass eine Reihe von Umweltgiften das Parkinsonismus bei Menschen und Tieren begünstigt. Dennoch haben wir keine Ahnung von der potenziellen Wechselwirkung zwischen Umwelt und Genetik in der Parkinson-Pathogenese. Daher wenden Zhang et al. sowohl gezielte Bisulfit-Sequenzierung als auch immunhistochemische Methoden an, um die zugrunde liegenden Zusammenhänge zu untersuchen.

Methoden

Ergebnisse

Gezielte Bisulfid-Sequenzierung zeigte eine erhöhte Methylierung von Genen im Wnt-Signalweg.

Sie entwarfen ein Set von etwa 97.000 Vorhängeschloss-Proben, das 16.379 validierte Gewebe-differenzielle Methylierungsregionen (T-DMRs), alle bekannten und vorhergesagten menschlichen imprintierten Gene sowie die Transkriptionsstartstellen aller Gene auf dem X-Chromosom abdeckt. Die K-Means-Clusteranalyse ergab 336 nicht überlappende DMRs, die bekannten Genen zugeordnet wurden. Die Mehrheit dieser Regionen (230/233) zeigte im Vergleich zu gesunden Spendern erhöhte Methylierungslevels in den PD-Gehirngeweben. Es gibt eine signifikante Anreicherung von Genen, die an der Wnt-Signalübertragung und der Neurogenese beteiligt sind.

2. Verminderte Erkennung von Genen im Wnt-Signalweg in der Substantia nigra von PD-Patienten

Die Werte von Foxc1, Ngn2, Spry1 und β-Catenin in den DA-Neuronen des Mittelhirns waren bei PD-Patienten im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen deutlich reduziert. Die quantitative Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der Zellen mit reduzierter oder nicht nachweisbarer Expression dieser Gene. Im Gegensatz dazu blieb der NEDD8-Spiegel in den DA-Neuronen sowohl bei PD-Patienten als auch bei Kontrollen ähnlich, was darauf hindeutet, dass die reduzierte Nachweisbarkeit dieser Proteine in den DA-Neuronen des Mittelhirns bei PD-Patienten spezifisch ist. Ähnliche Beobachtungen wurden bei Foxc1 und Spry1 in den kortikalen Geweben von PD-Patienten und ihren entsprechenden Kontrollen gemacht. Allerdings wurde in den kortikalen Geweben von PD-Patienten und ihren entsprechenden Kontrollen nur eine geringe Veränderung von Ngn2 und β-Catenin festgestellt.

3. Herunterregulierung der Wnt-Signalgebung in Zellen, die mit dem PD-Neurotoxin MPP+ behandelt wurden

Die funktionelle Annotierungsanalyse durch MPP+-Behandlung zeigt eine Anreicherung von hochregulierten Genen, die in der Disulfidbindung, Zellmembran, neurologischen Systemprozessen, Abwehrreaktionen, Zelladhäsion, positiver Regulation der Apoptose und Regulation der Migration tätig sind. Zu den durch MPP+ induzierten herunterregulierten Annotierungsclustern gehören Gene, die in der Disulfidbindung, sekretorischen Prozessen, extrazellulärer Matrix, Plasmamembran, Wnt-Signalgebung und Hedgehog-Signalgebung tätig sind. Die Ergebnisse unterstützen weiter die Vorstellung, dass die Wnt-Signalgebung bei neurotoxisch induziertem Parkinsonismus beeinträchtigt ist.

Referenz:

1. Zhang L, Jie D, Qian P, et al. Zielgerichtete Methylierungssequenzierung zeigt dysregulierte Wnt-Signalgebung bei Parkinson-Krankheit. Zeitschrift für Genetik und Genomik, 2016, 43(10):587-592.