CRISPR-Sequenzierung

CD Genomics bietet eine kosteneffiziente und hochdurchsatzfähige Validierung von CRISPR-Cas9-Knockouts sowie die potenzielle Erkennung von Off-Targets, indem fortschrittliche Technologien genutzt werden. Next-Generation-Sequenzierung (NGS)Unsere Teammitglieder verfügen über Erfahrung in sowohl der Genomeditierung als auch der NGS, was umfangreiche Unterstützung für Ihre Forschung ermöglicht.

Was ist CRISPR?

CRISPR, kurz für Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, ist eine revolutionäre Gentechnologie, die aus den natürlichen Immunsystemen von Bakterien und Archaeen stammt. Dieses System ist ein entscheidender Bestandteil der prokaryotischen Immunabwehr, das es diesen Organismen ermöglicht, Fragmente viraler DNA zu erfassen und sie zu nutzen, um ähnliche virale Sequenzen während nachfolgender Infektionen zu erkennen und zu zerstören. Im Wesentlichen ermöglicht CRISPR Viren, ihr genetisches Material in Bakterien zu integrieren und die zelluläre Maschinerie der Bakterien zu nutzen, um ihre eigenen Gene zu replizieren, einen Prozess, den wir als Gentechnik bezeichnen.

Die Hauptbestandteile des CRISPR-Systems umfassen:

• CRISPR-LociDiese Loci bestehen aus repetitiven genetischen Sequenzen, die mit "Spacern" durchsetzt sind, das sind Fragmente von viraler DNA, die aus früheren Infektionen stammen.
• Cas-Proteine (CRISPR-assoziierte Proteine)Cas9 ist beispielsweise ein Enzym, das DNA an bestimmten Stellen schneiden kann, geleitet von RNA-Sequenzen.
• Leit-RNA (gRNA)Dies ist eine kurze RNA-Sequenz, die komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist und das Cas9-Enzym an die genaue Stelle im Genom lenkt, an der eine Bearbeitung gewünscht ist.

Was ist das CRISPR-Cas9-System?

Das CRISPR-Cas9-Gentargeting-System, das zwei Komponenten erfordert: eine maßgeschneiderte Leit-RNA (sgRNA, bestehend aus einer ziel-spezifischen crRNA-Sequenz und tracrRNA) und eine unspezifische CRISPR-assoziierte Endonuklease (Cas9), ist ein neues Werkzeug zur Genom-Engineering, das es Forschern ermöglicht, Teile des Genoms zu bearbeiten, indem sie einen Abschnitt der DNA-Sequenz in Organismen entfernen, hinzufügen oder verändern. Es ist derzeit die einfachste, vielseitigste, präziseste und effektivste Methode der genetischen Manipulation, die viele potenzielle Anwendungen hat, einschließlich Medizin und Verbesserung von Pflanzensamen. CRISPR-Cas9 wurde auch angepasst, um hochdurchsatzfähige Genom-Editierungen zu ermöglichen und hat die Erzeugung gezielter Mutationen revolutioniert.

Einführung in die CRISPR-Sequenzierung

CRISPR-Sequenzierung ist eine fortschrittliche Methodik, die die CRISPR-Gentechnologie mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, das darauf abzielt, das Genom präzise zu manipulieren und die resultierenden Effekte zu analysieren. CRISPR, ein Akronym für Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, stammt aus einem bakteriellen Immunsystem und nutzt Cas (CRISPR-assoziierte) Proteine, die von spezifischen RNA-Molekülen geleitet werden, um DNA-Sequenzen zu zielen und zu bearbeiten. Diese Technik ermöglicht nicht nur gezielte Genomänderungen, sondern auch umfassende nachgelagerte Analysen und bietet erhebliches Potenzial sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Biotechnologie.

In CRISPR-Experimenten ist die Validierung genetischer Änderungen von größter Bedeutung. NGS bietet einen unkomplizierten, hochdurchsatzfähigen Ansatz zur Untersuchung der gewünschten Mutationen, angesichts der möglichen Vorkommen von Off-Target-Modifikationen anstelle der beabsichtigten Genänderungen. Die CRISPR-Amplicon-Sequenzierung hat sich zur standardisierten Validierungstechnik in akademischen, klinischen und industriellen Bereichen entwickelt. Hochdurchsatz-CRISPR-Screening nutzt die Prinzipien der gezielten Amplicon-Sequenzierung, indem Primer verwendet werden, die die Zielregionen für die PCR-Amplifikation flankieren. Die gezielte Amplicon-Sequenzierung ist die empfindlichste Methode zur Mutationsdetektion und kann Mutationen mit Frequenzen von bis zu 0,01 % identifizieren.

Um den aufkommenden Bedürfnissen der Forschungsgemeinschaften gerecht zu werden, hat CD Genomics eine erschwingliche, zuverlässige und hochdurchsatzfähige Strategie zur Screening und Validierung von CRISPR-Cas9-basierten Mutationen entwickelt, indem ampliconbasierte Next-Generation-Sequenzierung genutzt wird. Unser CRISPR-Next-Generation-Sequenzierungsdienst kann Ihnen direkte und detaillierte Informationen über die Natur und Vielfalt der Mutationen liefern, einschließlich der Bestätigung von Knockout-/Knockin-Allel, der Bewertung der Schneideeffizienz von sgRNAs, der Identifizierung von homozygoten und heterozygoten Varianten sowie der Berechnung von Mutationsfrequenzen. u. a..

Vorteile unseres CRISPR-Sequenzierungsdienstes

• Die hohe Präzision des CRISPR/Cas9-Systems ermöglicht eine genaue Zielansteuerung und Bearbeitung spezifischer genomischer Loci.
• Diese Vielseitigkeit erleichtert eine Vielzahl von genomischen Modifikationen, einschließlich Gen-Knockouts, Knock-ins, Punktmutationen und Genregulation.
• Umfangreiche Multiplexing-Flexibilität und Hochdurchsatz-Sequenzierung, bis zu 10⁴ Proben pro Durchlauf
• Ultra-tiefe Sequenzierung von Amplicons oder erfassten Regionen mit mehr als 1000-facher Abdeckung
• Kosteneffiziente und hochsensible Nachweisniveaus ohne Verzerrung
• Keine mühsamen und zeitaufwändigen Klonierungs Schritte erforderlich.
• Engagierte Unterstützung von spezialisierten Wissenschaftlern auf Doktoratsniveau

Anwendungen der CRISPR-Sequenzierung

• Funktionelle Genomik: Dieses Gebiet untersucht die Genfunktion und die Rollen, die Gene in biologischen Prozessen spielen, und bietet ein umfassendes Verständnis der genomischen Beiträge zu verschiedenen zellulären Aktivitäten.
• Gentherapie: Mit dem Fokus auf die Behebung pathogener Mutationen, die für erbliche Krankheiten verantwortlich sind, zielt die Gentherapie darauf ab, die normale Genfunktion wiederherzustellen und die Krankheitssymptome zu lindern.
• Agrarbiotechnologie: Diese Disziplin umfasst die Verbesserung von Pflanzeneigenschaften, wie Krankheitsresistenz und Ertrag, durch genetische Modifikationen, wodurch die landwirtschaftliche Produktivität und Nachhaltigkeit gefördert wird.
• Krebsforschung: Der Krebsforschung widmet sich der Aufklärung der Rollen von tumorverwandten Genen, untersucht die Mechanismen der Onkogenese und des Krebsfortschritts und ebnet den Weg für neuartige therapeutische Strategien.

CRISPR-Sequenzierungs-Workflow

Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement nach jedem Verfahren durch, um umfassende und genaue Ergebnisse sicherzustellen. Unser CRISPR-Mutations-Sequenzierungsworkflow ist unten aufgeführt und umfasst DNA-Isolation, PCR-Experimente, Tiefensequenzierung und Datenanalyse. Unsere CRISPR-Mutations-Sequenzierung ermöglicht es Forschern, die Bibliothek der Leitfäden zu validieren, CRISPR/Cas9-Ziele und Mutationseffizienz zu überprüfen sowie die vielversprechendsten Zielstandorte zu entdecken.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenarten: Zell- oder DNA-Proben nach CRISPR-Cas-Gentechnikanpassung DNA-Probe: ~1 μg (Konzentration ≥ 30 ng/μl; OD260/280=1,8~2,0) Zellprobe: 1×106 Zellen oder 10 cm2 Zellkultur Die Probenvorbereitungsverfahren umfassen die DNA-Isolierung, -Reinigung, -Quantifizierung und -Qualitätskontrolle. usw.. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Illumina HiSeq-Plattformen, paired-end 150 bp oder 300 bp; PacBio's SMRT-Plattform Sequenzierungstiefe: ≥ 1000x Analyse der Sequenzierungsqualitätsmetriken
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Rohdaten-QC Referenzausrichtung Validierung von CRISPR-Bibliotheken Analyse der Zielorte Analyse der vorhergesagten Off-Target-Loci Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur CRISPR-Sequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

CD Genomics bietet umfassende Dienstleistungen zur Erkennung potenzieller Off-Target-Effekte durch gezielte Anreicherung und tiefes Sequenzieren, alles zu wettbewerbsfähigen Preisen. Unsere fortschrittlichen Fähigkeiten ermöglichen es uns, Hunderte von Proben gleichzeitig zu sequenzieren, was eine effiziente Verarbeitung und hohe Durchsatzraten gewährleistet. Die Verteilungsmuster von Insertionen und Deletionen (InDels) werden sorgfältig analysiert, und Mutationen werden mit dem robusten CRISPResso-Tool verifiziert. Sollten Sie weitere Anforderungen oder Anfragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Demo-Ergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

CRISPR-Sequenz FAQ

1. Ist CRISPR-Cas9 Next-Generation-Sequencing?

Next-Generation-Sequenzierung (NGS) spielt eine integrale Rolle in verschiedenen Phasen der CRISPR-Cas9-Genome Editing-Workflows. Die Anwendungen reichen von umfassender Genomsequenzierung zur Analyse potenzieller Off-Target-Effekte von CRISPR bis hin zu gezielter Sequenzierung, die darauf abzielt, spezifische Gen-Knockouts und andere Änderungen zu bestätigen. Durch den Einsatz von NGS können Forscher eine detaillierte und präzise Validierung der durch CRISPR induzierten Modifikationen erreichen, was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit ihrer genetischen Veränderungen sicherstellt.

2. Was sind die ethischen Überlegungen zur CRISPR-Sequenzierung?

CRISPR-Sequenzierung wirft ethische Bedenken auf, insbesondere hinsichtlich des Potenzials für Off-Target-Mutationen und der Implikationen von Keimbahnbearbeitungen. Ethische Richtlinien betonen die Notwendigkeit strenger Sicherheitsbewertungen, informierter Einwilligung und Transparenz in der Forschung, die Gene Editing-Technologien betrifft.

3. Wie stellen Forscher die Spezifität der CRISPR-Sequenzierungsergebnisse sicher?

Forscher verwenden bioinformatische Werkzeuge, um Sequenzierungsdaten zu analysieren und echte durch CRISPR induzierte Mutationen von Hintergrundrauschen oder Sequenzierungsfehlern zu unterscheiden. Darüber hinaus werden Validierungstechniken wie Sanger-Sequenzierung oder Tropfen digitale PCR (ddPCR) kann das Vorhandensein von Mutationen an spezifischen genomischen Loci bestätigen.

4. Wie wird CRISPR-Sequenzierung in der klinischen Forschung und Therapie eingesetzt?

Im Bereich der klinischen Forschung spielt die CRISPR-Sequenzierung eine wesentliche Rolle bei der Weiterentwicklung therapeutischer Perspektiven für genetische Erkrankungen. Diese Technologie ermöglicht die präzise Validierung genomischer Modifikationen in patientenabgeleiteten Zellen, wodurch Forscher die Wirksamkeit und Sicherheitsprofile von Gentherapien vor klinischen Studien umfassend untersuchen können. Darüber hinaus ist die CRISPR-Sequenzierung entscheidend für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele, was ein tieferes Verständnis fördert, das die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien vorantreiben kann.

CRISPR-Sequenz-Fallstudien

Genomweite Off-Target-Analysen der CRISPR/Cas9-vermittelten T-Zell-Rezeptor-Engineering in primären menschlichen T-Zellen

Journal: Klinische & Translationale Immunologie

Impactfaktor: 5,8

Veröffentlicht: 23. Januar 2022

Hintergrund

Die Nutzung von T-Zellen zur Bekämpfung von Krebs ist ein herausragender Ansatz in modernen immuntherapeutischen Strategien. Die genetische Veränderung von T-Zell-Rezeptoren (TCRs) ermöglicht die Umleitung der T-Zell-Spezifität, die Eliminierung von Alloreaktivität und den Fortschritt der adoptiven T-Zell-Transfertherapie (ACT). Die Einführung von DNA-Doppelstrangbrüchen mittels CRISPR/Cas9-Technologie erleichtert Gen-Knockout- oder Knock-in-Manipulationen. Eine effektive Methode zur Feststellung der Sicherheit von konstruierten T-Zellen besteht in der Erkennung von Off-Target-Genen im gesamten Genom. Unter Nutzung von CRISPR/Cas9-Techniken setzten die Autoren die Lieferung von Ribonukleoproteinen ein, um den TCR auszuschalten, was ihnen ermöglichte, die Sicherheit genetisch veränderter T-Zellen zu bewerten. Whole-Genome-Sequenzierung wurde anschließend beauftragt zu untersuchen, ob CRISPR/Cas9-vermittelte Doppelstrangbrüche an TCR-Stellen mit Off-Target-Effekten in primären T-Zellen verbunden sind.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Abb. 1. Ganzgenomanalyse von gRNA-abhängigen Cas9-induzierten Off-Target-Effekten.

Abb. 2. Zielgerichtete Tiefensequenzierung von zuvor identifizierten Off-Target-Ereignissen aus der WGS.

Die Sicherheit der T-Zellen wurde durch die Untersuchung von unspezifischen Nuklease-induzierten Off-Target-Vorfällen bewertet. Mithilfe von Cas-OFFinder suchten die Autoren nach übereinstimmenden Stellen mit einer Abweichung von ≤ 4 zwischen der Leit-RNA (gRNA) und der Nicht-Ziel-DNA, die als mögliche Off-Target-Standorte betrachtet wurden. Anschließend wurde eine Ganzgenomsequenzierung sowohl an unbehandelten Proben als auch an MOCK-Proben durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Elektroporation allein keine signifikanten genomischen Variationen hervorrief.

Die Autoren führten dann eine Ganzgenomsequenzierung an Proben durch, die TRAC- und TRBC-Bearbeitungen unterzogen wurden, wobei die InDels in unbehandelten und MOCK-Proben ausgeschlossen wurden. Durch die Anwendung einer Ganzgenom-homologen Sequenzausrichtung basierend auf der Einzelguide-RNA (sgRNA) identifizierten sie 316 verschiedene InDels in den TRAC-bearbeiteten Proben und 272 verschiedene InDels in den TRBC-bearbeiteten Proben. Diese potenziellen Off-Target-Stellen wurden anschließend von den Autoren zusammengestellt.

Fazit

Zusammenfassend untersucht diese Studie die Sicherheit der CRISPR/Cas9-vermittelten genetischen Modifikation von T-Zell-Rezeptoren (TCR) mit dem Ziel, Off-Target-Effekte zu bewerten. Durch einen kombinierten Ansatz aus voreingeschätzter Zielvorhersage, unbeeinflusster Ganzgenomsequenzierung und gezielter Tiefensequenzierung bestätigte die Studie eine hohe Effizienz beim TCR-Knockout, ohne dass CRISPR/Cas9-induzierte Off-Target InDel-Mutationen nachgewiesen wurden. Weitere in vivo-Forschung ist jedoch notwendig, um die klinische Sicherheit genetisch modifizierter T-Zell-Produkte vollständig zu bewerten.

Referenz

1. Kaeuferle T, Stief T A, Canzar S, et al. Genomweite Off-Target-Analysen der CRISPR/Cas9-vermittelten T-Zell-Rezeptor-Engineering in primären menschlichen T-Zellen. Klinisch & Translationale Immunologie, 2022, 11(1): e1372.