Menschliche gesamte Genom PacBio SMRT-Sequenzierung

CD Genomics bietet seit einigen Jahren einen genauen und erschwinglichen Dienst zur Neusequenzierung des menschlichen Genoms an. CD Genomics führt zuvor verborgene PacBio SMRT-Technologie das großes Anwendungspotenzial in der Neusequenzierung des menschlichen Genoms hat. Die langen Einzelmolekül-Lesungen zeigen strukturelle Varianten und liefern direkte Informationen zur Variantenphasenbestimmung über Haplotypblöcke und Methylierung. Dies ist sehr hilfreich, um die Nützlichkeit von Präzisionsmedizin-Bemühungen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit zu erweitern und die Entwicklung von menschlichen Ein-Gen-Erkrankungen, komplexen Erkrankungen und Tumorgenomen erheblich voranzutreiben.

Die Einführung der PacBio SMRT-Sequenzierung des gesamten menschlichen Genoms

eine umfassende Karte der menschlichen genomischen Variationen von größter Bedeutung für ein tiefgehendes Verständnis genetischer Merkmale und zur Unterstützung präziser Krankheitsforschung ist. Obwohl die Kurzlesesequenzierung kleine Variationen wie SNPs (Einzelnukleotid-Polymorphismen) und InDels (Einfügungen und Löschungen) zuverlässig erkennen kann, zeigt sie eine begrenzte Sensitivität bei der Identifizierung von CNVs (Kopienzahlvariationen) und SVs (strukturellen Variationen). In den letzten Jahren, Langzeit-Sequenzierung hat in der humangenetischen Forschung weit verbreitete Anwendung gefunden. Diese Technik entschlüsselt effektiv komplexe genomische Strukturen, einschließlich hochrepetitiver Genregionen und struktureller Genomvariationen, was eine umfassendere genomische Perspektive im Streben nach krankheitsassoziierten Variationen bietet. Die hohe Genauigkeit von Langzeit-Sequenzierung ermöglicht es, seltene Variationen zu entdecken, die bei der Kurzlesesequenzierung möglicherweise übersehen werden, und liefert somit genauere Informationen über genetische Variationen, die eine wesentliche Grundlage für die Präzisionsmedizin und deren grundlegende Forschung darstellen.

Die menschliche gesamte Genom-PacBio-SMRT-Sequenzierung (Single Molecule, Real-Time) von Pacific Biosciences ist eine fortschrittliche Technologie zur genomischen Analyse, die das proprietäre SMRT-Sequenzierung ansatz, der von Pacific Biosciences entwickelt wurde. Diese Technologie zeichnet sich durch ihre Fähigkeit aus, verlängerte Leselängen zu erzeugen, eine hohe Sequenzgenauigkeit zu demonstrieren und direkte Nachweise von epigenetischen Modifikationen zu bieten, wodurch eine umfassende und tiefgehende Analyse des menschlichen Genoms ermöglicht wird. Bemerkenswerterweise, PacBio SMRT-Sequenzierung ist in der Lage, außergewöhnlich lange Reads zu erzeugen, die typischerweise von 10 bis 15 Kilobasenpaaren (kb) reichen und in einigen Fällen sogar diese Länge überschreiten. Dieses Merkmal erweist sich als besonders vorteilhaft für das Entschlüsseln komplexer genomischer Strukturen, wie zum Beispiel Regionen, die durch einen hohen Grad an Sequenzwiederholung oder struktureller Variation gekennzeichnet sind.

CD Genomics beschäftigt jetzt PacBio SMRT-Sequenzierung zur Durchführung umfassender Analysen menschlicher Gesamtgenome. Mit der Fähigkeit, durchzuführen Whole-Genome-Sequenzierung Über verschiedene individuelle und bevölkerungsbezogene Proben hinweg, gefolgt von umfassenden bioinformatischen Analysen auf beiden Ebenen, ebnet diese Methode den Weg für die umfassende Erforschung genomischer Variationen. Zu diesen Variationen gehören Einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs), Insertionen und Deletionen (InDels), Kopienzahlvariationen (CNVs) und strukturelle Variationen (SVs). Die tiefgreifenden genomischen Einblicke, die aus dieser direkten und umfassenden Erkundung gewonnen werden, sind unverzichtbar für die Identifizierung sowohl pathogenetischer als auch Suszeptibilitätsgene sowie für das Verständnis der Mechanismen, die dem Ausbruch von Krankheiten und den Vererbungsmustern zugrunde liegen.

Vorteile der PacBio SMRT-Sequenzierung des gesamten menschlichen Genoms

• Langzeit-Lesungen. Sie sind vorteilhaft für die Variationsinformationsermittlung des gesamten Genoms, die genaue Analyse von chromosomalen strukturellen Varianten (SVs) und Fusionsgenen.
• Keine PCR-Amplifikation. Effektiv Vermeidung des Amplifikationsbias und einfaches Überbrücken von Regionen mit hohem GC-Gehalt und hoher Sequenzwiederholung, um die Integrität und Homogenität der Genomabdeckung sicherzustellen.
• Erkennt direkt epigenetische Modifikationen durch Messung der kinetischen Variation während der Baseneinfügung.

Anwendung der PacBio SMRT-Sequenzierung des menschlichen gesamten Genoms

1. SV-Erkennung

SVs repräsentieren genomische Umstellungen (typischerweise definiert als länger als 50 bp), und SVs können eine wichtige Rolle bei menschlichen Krankheiten, Evolution und genetischer Vielfalt spielen. Viele erbliche Krankheiten und Krebserkrankungen wurden in den letzten Jahren mit einer großen Anzahl von SVs in Verbindung gebracht. In den letzten 25 Jahren gab es enorme Fortschritte bei der Erkennung von Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs), aber strukturelle Varianten (SV) mittlerer Größe (50 bp bis 50 kb) bleiben eine Herausforderung bei der Analyse mit Kurzsequenzen. DNA-SequenzierungDie längste Leselänge der PacBio SMRT-Sequenzen beträgt 40~70 K, was es ermöglicht, hochgradig wiederholte und hochheterozygote Bereiche leicht abzudecken und somit die Möglichkeit zur Erkennung von SVs zu bieten.

2. Haplotyp-Genotypisierung

Ein Haplotyp (haploider Genotyp) ist eine Gruppe von Allelen in einem Organismus, die zusammen von einem einzelnen Elternteil vererbt werden. Der korrekte Genotypisierung Das Haplotype-Gen ist wichtig; zum Beispiel wird das Ergebnis einer Knochenmarktransplantation von einem nicht verwandten Spender durch die Übereinstimmung von Spender und Empfänger für HLA beeinflusst. PacBio-Langlese kann mehrere Einzel-Nukleotide und strukturelle Varianten abdecken, was die Varianten direkt in Haplotypen phasiert.

3. DNA-Methylierung

DNA-Methylierung ist ein Prozess, bei dem Methylgruppen an das DNA-Molekül angefügt werden. Sie ist entscheidend für die normale Entwicklung und ist mit einer Reihe von Schlüsselprozessen verbunden, darunter genomische Prägung, Inaktivierung des X-Chromosoms, Repression transposabler Elemente, Alterung und Karzinogenese. Es gibt viele Möglichkeiten, DNA-Methylierung nachzuweisen, einschließlich Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS), Methylierte DNA-Immunpräzipitations-Sequenzierung (MeDIP) und so weiter. Aber diese Methoden sind experimentell schwer zu bedienen.

Während die PacBio-Plattform die direkte Erkennung von DNA-Methylierung beschreiben kann, ohne dass eine Bisulfit-Konversion erforderlich ist, basierend auf dem Unterschied im Intervall des Fluoreszenzimpulses. Darüber hinaus die Langzeit-Sequenzierung ermöglicht eine gründlichere Bewertung der regionalen CpG-Methylierung und erhöht die Kapazität zur Untersuchung der Beziehung zwischen phasierten einzelner Nukleotidvarianten und allelspezifischer CpG-Methylierung.

Menschliches Ganzgenom PacBio SMRT Sequenzierungs-Workflow

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen DNA-Menge: ≥ 3 μg, Konzentration ≥ 80 ng/µL DNA Reinheit: OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 ohne Abbau oder RNA-Kontamination
	Sequenzierungsstrategie 20 KB Bibliothek ≥ 10-fache Genomabdeckungstiefe
	Bioinformatikanalyse CD Genomics bietet statistische und bioinformatische Datenanalysedienste für: SV-Erkennung Haplotyp-Genotypisierung DNA-Methylierung maßgeschneiderte bioinformatische Dienstleistungen

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur menschlichen gesamten Genom-PacBio-SMRT-Sequenzierung für Ihre Schrift (Anpassung)

CD Genomics bietet ein umfassendes Dienstleistungspaket für die vollständige Neusequenzierung des gesamten Genoms an, das die Standardisierung der Proben, den Bibliotheksaufbau, die Tiefensequenzierung, die Qualitätskontrolle der Rohdaten und Bioinformatik Analyse. Wir können diese Pipeline auf Ihr Forschungsinteresse zuschneiden. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

1. Wie tief ist die resequenzierung des gesamten menschlichen Genoms?

Die Sequenzierungstiefe wird durch den Forschungszweck, die Anzahl der Proben und Ihre Bedürfnisse bestimmt. Die allgemeine Tiefe der resequenzierten menschlichen Gesamterbmasse beträgt 30X. Für die Erkennung von Keimbahnvariationen empfehlen wir eine Sequenzierungstiefe von 30-50X, wie zum Beispiel bei Forschungen zu Ein-Gen-Krankheiten. Für Bevölkerungsstudien mit mehreren Proben, wenn Sie sich auf SNPs konzentrieren, reicht eine Sequenzierungstiefe von 10X aus. Wenn Sie sich auf strukturelle Variationen in Krebsgeweben konzentrieren, empfehlen wir eine Sequenzierungstiefe von mehr als 50X.

2. Welche Methoden können verwendet werden, um die Ergebnisse zu validieren?

Whole-Genome-Resequenzierung kann verschiedene Arten genetischer Variationen erkennen, einschließlich SNP, InDel, SV und CNV.

• PCR-Amplifikation und Sequenzierung oder SNP-Genotypisierung kann verwendet werden, um SNPs zu validieren.
• PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung kann verwendet werden, um kurze Fragmente von InDels zu validieren.
• Die Echtzeit-PCR ist nützlich zur Validierung von CNVs.
• Kleinmaßstäbliche SVs können durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung validiert werden, während großmaßstäbliche SVs durch mikroskopische Beobachtung, wie FISH, validiert werden müssen.

3. Was sind die Vorteile der Drittgeneration der gesamten Genomsequenzierung gegenüber der Zweitgeneration der gesamten Genomsequenzierung?

Im Gegensatz zur zweiten Generation Whole-Genome-Sequenzierung, das eine Bibliothekskonstruktion mit DNA-Fragmenten von etwa 350 Basenpaaren (bp) nutzt und einen paired-end 150 (PE150) Sequenzierungsansatz verwendet, befasst sich die dritte Generation der Ganzgenomsequenzierung typischerweise mit Fragmenten, die größer als 10 Kilobasen (Kb) sind, mit der Fähigkeit, bis zu mehreren Megabasen (Mb) zu erweitern. Dieses Merkmal bietet besondere Vorteile bei der Erkennung von großen segmentalen strukturellen Variationen und komplexen Regionenvariationen. Darüber hinaus macht die dritte Generation der Ganzgenomsequenzierung die PCR-Amplifikation überflüssig, wodurch die gleichzeitige Extraktion von Methylierungsinformationen ermöglicht wird.

4. Warum sollte man Long-Read-Sequenzierung zur Erkennung von strukturellen Variationen (SV) verwenden?

strukturelle Varianten (SV), die aus Deletionen, Insertionen, Duplikationen und Inversionen bestehen, machen den Großteil der Varianten-Basenpaare im menschlichen Genom aus. Viele Studien haben eine direkte oder indirekte Beziehung zwischen SVs, die mit der menschlichen Gesundheit in Verbindung stehen, und ihren assoziierten Phänotypen gezeigt. Folglich gehört die Identifizierung genetischer Varianten und das Verständnis ihrer funktionalen Implikationen zu den kritischsten Fragen in der menschlichen Genetikforschung. Angesichts der Tendenz von SVs, in Wiederholungsregionen aufzutreten, und der möglichen Komplexität der intra-SV-Struktur kann die Entdeckung dieser Varianten und die Genotypisierung erhebliche Herausforderungen mit sich bringen. Daher besteht der Bedarf nach Langzeit-Sequenzierungstechnologien Neue Untersuchungen zu SV-Strukturen einzuleiten und Analysen zur SV-Erkennung in menschlichen Populationen durchzuführen, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis von Krankheiten, die mit SVs in Zusammenhang stehen.

5. Wie wird die Datenqualitätskontrolle durchgeführt?

Die Datenqualitätskontrolle umfasst mehrere Schritte, um die hohe Qualität der Sequenzierungsdaten sicherzustellen:

• Bewertung der Längenverteilung von Reads: Überprüfung der Längenverteilung der generierten Reads, um sicherzustellen, dass sie den Erwartungen entspricht.
• Bewertung der Fehlerquote: Bewertung der Sequenzierungsfehlerquoten mithilfe interner Kontrollsequenzen oder Referenzgenomen.
• Deckungsbewertung: Untersuchung der Tiefe und Gleichmäßigkeit der Genomabdeckung, um eine ausreichende Datenabdeckung sicherzustellen.

6. Wie wählt man die geeignete Sequenzierungstiefe aus?

Die Wahl der Sequenzierungstiefe hängt von den spezifischen Anforderungen und Zielen der Studie ab:

• Whole Genome Assembly: Erfordert typischerweise eine höhere Abdeckungstiefe, um die Integrität und Genauigkeit der Assemblierung sicherzustellen.
• Variantenerkennung: Eine moderate Abdeckungstiefe kann ausreichen, um SNPs und InDels zu erkennen, jedoch kann zur Erkennung von CNVs und SVs eine höhere Abdeckung erforderlich sein.
• Epigenetische Modifikationsanalyse: Die Abdeckungstiefe sollte ausreichend hoch sein, um eine zuverlässige Erkennung von Modifikationssignalen zu gewährleisten.

Erkennung einer langen Insertion-Variante in SAMD12 durch SMRT-Sequenzierung: Auswirkungen der Langzeit-Whole-Genome-Sequenzierung auf Krankheiten mit Wiederholungsexpansionen

Zeitschrift: Zeitschrift für Humangenetik
Impactfaktor: 5,881
Veröffentlicht: 17. Dezember 2018

Hintergrund

Kurzlese Next-Generation-Sequenzierung (NGS) wird häufig in der medizinischen Forschung und genetischen Tests verwendet, um pathogene Einzel-Nukleotid-Varianten und kleine Einfügungen und Löschungen (Indels) zu erkennen. Diese Technologie kann jedoch strukturelle Variationen (SVs) über Hunderte bis Zehntausende von Basenpaaren hinweg übersehen. Langzeit-Sequenzierungstechnologie bietet vielversprechende Ansätze zur zuverlässigen Erkennung neuer SVs. BAFME, eine autosomal-dominant vererbte neurologische Erkrankung, die durch zitternde Myoklonien und seltene Anfälle gekennzeichnet ist, steht im Zusammenhang mit Wiederholungs-Expansionen in der SAMD12 Gen. PacBio SMRT-Sequenzierung, in der Lage, >10-kb DNA zu lesen, hat das Potenzial, die vollständige Abdeckung der SAMD12 Wiederholungserweiterung. Langzeitlese. Whole-Genome-Sequenzierung Die Verwendung von PacBio kann nützlich sein, um bekannte und neuartige pathogene SVs zu erkennen, selbst bei niedriger Abdeckung.

Methoden

Ergebnisse

In einer vier Generationen umfassenden japanischen Familie, die von BAFME betroffen ist, wurde eine heterozygote strukturelle Variante (SV) an der SAMD12 In dem betroffenen Individuum wurde eine intronische Wiederholungsregion identifiziert, was mit früheren Studien übereinstimmt. Die Größe der Wiederholungsdehnung war zwischen den Individuen nach der väterlichen Keimbahnübertragung ähnlich. Die PacBio SMRT-Sequenzierung konnte die beobachtete Wiederholungsgröße von 4 kb vollständig abdecken. Die Langread-Ganzgenomsequenzierung (WGS) mit dem Pacbio Sequel-System offenbarte zahlreiche Insertionen und Deletionen, einschließlich sechs SVs, die spezifisch für das betroffene Individuum in der mit BAFME1 verknüpften Region waren. Eine bemerkenswerte Insertion von 4661 bp wurde zwischen den repetitiven Sequenzen AluSq2 und (TAAAA)n identifiziert. Die Analyse zeigte, dass diese Insertion eine neuartige Sequenz und keine tandemduplizierte Sequenz umfasste, wobei ein hoher Anteil aus Sequenzen mit niedriger Komplexität bestand.

Abb. 1. Stammbaum einer Familie mit pathogener struktureller Variation von SAMD12.

Abb. 2. Bewertung von Langzeit-WGS.

Fazit

Die Long-Read-Sequenzierung liest jetzt DNA über 10 kb und ermöglicht die Erkennung großer struktureller Variationen. Die Autoren wendeten PacBio SMRT-Sequenzierung auf eine Familie mit benigner erwachsener familiärer Myoklonusepilepsie an und identifizierten sechs SVs in einer 7,16-Mb BAFME1-Region und bestätigten eine 4,6-kb. SAMD12 Wiederholte Einfügungen als Ursache. Langzeit-WGS bietet vielversprechende Möglichkeiten für eine umfassende SV-Analyse und das Aufdecken neuer krankheitsverursachender Varianten bei undiagnostizierten Erkrankungen.

Referenz:

1. Mizuguchi T, Toyota T, Adachi H, u. a.Erkennung einer langen Insertion-Variante in SAMD12 durch SMRT-Sequenzierung: Auswirkungen der Langzeit-Whole-Genome-Sequenzierung auf Krankheiten mit Repeat-Expansion. Zeitschrift für Humangenetik2019, 64(3):191-7.