Degradom-Sequenzierung

CD Genomics kann jetzt den Degradom-Sequenzierungsdienst anbieten, um einen umfassenderen Einblick in die Landschaft der pflanzlichen Mikro-RNAs zu ermöglichen. Mit unserem Service können Sie die mRNA-Ziele der Mikro-RNAs auf eine hochsensible und präzise Weise nachweisen.

Die Einführung der Degradom-Sequenzierung

Mikro-RNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogener nicht-kodierender RNAs mit einer Länge von 20-24 Nukleotiden (nt), die durch hochpräzise Exzision aus Stem-Loop-Vorläufern produziert werden. Mikro-RNAs sind wichtige Regulatoren der Genexpression auf transkriptionaler und post-transkriptionaler Ebene. Die reife miRNA wird in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) rekrutiert, um mRNA-Ziele abzubauen und deren Translation zu unterdrücken. miRNAs sind aufgrund von Vergleichen zwischen verschiedenen Arten hochgradig konserviert. Es gibt auch nicht-konservierte und artspezifische miRNAs in Pflanzen. Nicht-konservierte miRNAs werden oft in niedrigen Mengen exprimiert, und daher werden viele in kleineren Sequenzierungsprojekten nicht identifiziert. Kleine RNA-Sequenzierung Die Technologie hat die Identifizierung von miRNAs mit geringer Häufigkeit ermöglicht.

Modifiziertes 5' RACE (schnelle Amplifikation der cDNA-Enden) wurde häufig zur Bestätigung von Zielen und zur Kartierung von Schnittstellen verwendet. Dennoch ist dieser Ansatz arbeitsintensiv, zeitaufwendig, kostspielig und nur für feingliedrige Untersuchungen anwendbar. Kürzlich hat sich die Degradom-Sequenzierung, auch bekannt als parallele Analyse von RNA-Enden (PARE), als leistungsstarke Methode herausgestellt, die beides kombiniert. Hochdurchsatz-Sequenzierung und modifizierte 5' RACE, um nach miRNA und ta-siRNA zu suchentrans-aktives siRNA) Ziele in großem Maßstab. In diesem Verfahren wird degradiertes, gekapptes mRNA adapter-ligiert und revers-transkribiert. Die Fragmente werden dann mit Mmel verdaut, gereinigt, 3'-adapter-ligiert und PCR-amplifiziert. Die Tiefensequenzierung des cDNA und die Degradom-Analyse liefern umfassende Informationen über ungecapte Transkripte, die in Pflanzen abgebaut werden.

Vorteile der Degradom-Sequenzierung

• Identifizierung bekannter und neuer miRNAs sowie ta-siRNAs
• Identifizierung von miRNA-Zielen und regulatorischen Netzwerken
• Statistische Zusammenfassung der mRNA-Abbaustellen
• Erforscht neuartige Biomarker und regulatorische Netzwerke von circRNAs.
• Hochdurchsatz und hochauflösend

Degradom-Sequenzierungs-Workflow

Der allgemeine Arbeitsablauf für Degradom-Sequenzierung ist unten skizziert. Um eine Degradom-Sequenzierungsbibliothek zu erstellen, besteht der erste Schritt darin, PolyA-RNA-Proben an einen RNA-Adapter mit einer 3'Mme I-Stelle zu ligieren und zu transkribieren. Nach der Synthese des zweiten Strangs, der Mme I-Digestion, der Gelreinigung und der PCR-Amplifikation wird der 3'-Adapter für die Tiefensequenzierung ligiert. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch und überwacht jeden Schritt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten.

Dienstspezifikationen

	Musteranforderungen Probenart: Gesamtes RNA ohne Abbau oder DNA-Kontamination Gesamt-RNA ≥ 20 μg, Mindestmenge: 15 μg, Konzentration ≥ 100 ng/µL OD A260/A280-Verhältnis ≥ 1,8, A260/230-Verhältnis ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Alle Gesamt-RNA-Proben sollten DNA-frei sein. RNA sollte in nukleasefreiem Wasser oder RNA Stable aufbewahrt werden. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Degradome-Bibliotheksvorbereitung Illumina HiSeq SE50 Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle von Rohdaten Referenzbasierte Zuordnung Identifizierung bekannter und neuer nicht-kodierender RNAs Verteilungsanalyse von Abbaufragmenten in der ausgewählten Region des Genoms Identifizierung von Ziel-mRNAs Statistische Zusammenfassung der mRNA-Abbaustelle GO/KEGG-Analyse Hinweis: Die empfohlenen Datenausgaben und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Orientierung. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur Degradom-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Unterstützt von unseren erfahrenen Wissenschaftlern und fortschrittlicher Technologie kann CD Genomics Ihnen helfen, kleine RNA-Ziele mit einer Einzelbasenauflösung gleichzeitig zu identifizieren durch die Hochdurchsatz-Sequenzierung durch strenge Qualitätskontrolle und fortschrittliche bioinformatische Analysen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, können Sie sich gerne an uns wenden.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Sequenzierungsqualitätsverteilung

A/T/G/C-Verteilung

IGV-Browser-Oberfläche

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA-Score-Diagramm

Venn-Diagramm

Volcano-Diagramm

Statistik Ergebnisse der GO-Anmerkung

KEGG-Klassifikation

1. Was ist das Prinzip der Degradom-Sequenzierung?

Bei Tieren wird angenommen, dass die Proteindämpfung durch translationalen Hemmung sowie mRNA-Abbau erfolgt. Bei Pflanzen degradieren miRNAs ihre mRNA-Ziele durch präzisen Schnitt zwischen dem 10. und 11. Nukleotid vom 5'-Ende der miRNA im komplementären Bereich des Zieltranskripts, was einen ausgeprägten Peak des Degradom-Sequenztags an der vorhergesagten Schnittstelle im Vergleich zu anderen Regionen des Transkripts erzeugt. Basierend auf diesem Prinzip wird die Degradom-Sequenzierung hauptsächlich verwendet, um global Reste von kleinen RNA-gesteuerten Schnitten zu identifizieren, indem die 5'-Enden von nicht gekappten RNAs in Pflanzen sequenziert werden.

2. Was sind die Vorteile der Degradom-Sequenzierung zur Identifizierung von miRNA-Zielen?

Tabelle 1. Der Vergleich von Degradom-Sequenzierung und traditionellen Methoden zur Vorhersage von miRNA-Zielen.

3. Wie unterscheidet sich die Degradom-Sequenzierung von anderen RNA-Sequenzierungsmethoden?

Degradom-Sequenzierung konzentriert sich speziell auf RNA-Abbauprodukte, während andere RNA-Sequenzierungsmethoden wie RNA-Seq Typischerweise wird das gesamte Transkriptom analysiert. Dies macht die Degradom-Sequenzierung besonders geeignet für das Studium von miRNA/siRNA-vermittelten RNA-Spaltungsevents.

Referenz

1. Riffo-Campos, Á.L., u. a.Werkzeuge zur sequenzbasierten Vorhersage von miRNA-Zielen: Was sollte man wählen? Internationale Zeitschrift für Molekularwissenschaften, 2016, 17(12): 1987.

Kleine RNA- und Degradom-Sequenzierung zeigt wichtige Funktionen von Mikro-RNA in Astragalus chrysochlorus Reaktion auf Selenstimuli

Journal: Pflanzenbiotechnologie-Journal
Impactfaktor: 6,305
Veröffentlicht: 21. Mai 2015

Zusammenfassung

Astragalus Arten, die als Hyperakkumulatoren von Selen bekannt sind, indem sie es in nicht-amino-säurehaltige Verbindungen umwandeln. Aber wir haben keine Ahnung von der selenmetabolismusbezogenen Hyperakkumulation. Die Autoren versuchten zu verstehen, ob miRNAs eine Rolle bei der Selenakkumulation in Pflanzen spielen. In dieser Studie identifizierten sie 418 bekannte miRNAs und 151 neuartige miRNAs, die durch die Exposition gegenüber Selen induziert wurden in Astragalus chrysochlorusDurch tiefes Degradom-Sequencing enthüllten die Autoren wichtige miRNA-Funktionen in Ein. Chrysochlorus Antwort auf Selenstimuli.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

1. miRNA-Identifikation und Expressionsprofile.

Insgesamt wurden 418 bekannte und 151 neuartige miRNAs identifiziert. Die Verteilung der miRNAs zwischen der Kontroll- und der Se-Behandlung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die 418 miRNAs gehören zu 380 miRNA-Familien, und 160 miRNA-Familien wiesen in den Kontroll- und Se-behandelten Proben unterschiedliche Expressionsmuster auf. 30 neuartige miRNAs waren nach der Se-Behandlung unterschiedlich exprimiert.

Abbildung 1. Verteilung der miRNAs zwischen Kontroll- und Se-Behandlung: (a) konservierte miRNAs; (b) neuartige miRNAs.

Abbildung 2. Kleine RNA-Expressionsprofile von Kontroll- und Se-behandeltem Kallus von Ein. Chrysochlorus.

Abbildung 3. Expressionsprofile von zufällig ausgewählten miRNAs mit unterschiedlicher Häufigkeit in Se-behandelten Ein. Chrysochlorus Insgesamt wurden 1339 vorhergesagte Stellen identifiziert, die von 499 miRNAs geschnitten werden. Die Zielgene wurden annotiert und als Transkriptionsfaktoren und deren Untereinheiten, enzymkodierende Gene, Resistenzproteine, Leucin-reiche Wiederholungen, Leucin-Zipper, Zinkfingerproteine und andere strukturelle und funktionale Proteine klassifiziert.

Abbildung 4. Zielplots (t-Plots) von miRNAs und ihren Zielen. Die roten Pfeile zeigen die häufigsten Spitzen oder Spaltstellen an. (a) miR162-3p, das das Endonuklease Dicer-homologe Protein 1-like anvisiert; (b) miR1513a, das die blau lichtaktivierte Histidin-Kinase anvisiert; (c) miR2118b, das das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-like Protein anvisiert; (d) miR172c, das den putativen ethylenreaktiven Transkriptionsfaktor RAP-2-7-like anvisiert; (e) miR159b-3p, das das hypothetische Protein 11M9.5 anvisiert; (f) miR166 h-3p, das das Homeobox-Leucin-Zipper-Protein ATHB-15-like anvisiert.

3. GO- und KEGG-Pfadanalysen

Die Ziele der identifizierten miRNAs wurden einer GO- und KEGG-Analyse unterzogen, um ihre biologischen Rollen zu verstehen. Die Zielgene sind an 47 Arten von Zellkomponenten, 103 Arten von molekularen Funktionen und 144 Arten von biologischen Prozessen beteiligt.

Abbildung 5. GO-Klassifikationen der miRNA-Ziele in Ein. Chrysochlorus.

Abbildung 6. KEGG-Pflanzen-Pathogen-Interaktionsweg und neuartige sowie bekannte miRNAs, die in dieser Studie identifiziert wurden und möglicherweise die in diesem Weg beteiligten Gene anvisieren.

Referenz

1. Cakir O, Candar-Cakir B, Zhang B. Die Sequenzierung von kleinen RNAs und Degradomen zeigt eine wichtige Funktion von Mikro-RNAs in Astragalus chrysochlorus Reaktion auf Selenstimuli. Pflanzenbiotechnologie-Journal, 2016, 14(2): 543-556.