What is the principle of degradome sequencing?

In animals, protein repression is believed to occur by translational inhibition along with mRNA degradation. In plants, miRNAs degrade their mRNA targets by precise cleavage between the 10th and 11th nucleotide s from the 5' end of the miRNA in the complementary region of the target transcript, generating a distinct peak of degradome sequence tag at the predicted cleavage site relative to other regions of the transcript. Based on this principal, the degradome sequencing is primarily used to globally identify remnants of small RNA-directed cleavage by sequencing the 5' ends of uncapped RNAs in plants.

What are the advantages of degradome sequencing for identification of miRNA targets?

Table 1. The comparison of degradome sequencing and traditional methods for miRNA target prediction.

How is degradome sequencing different from other RNA sequencing methods?

Degradome sequencing specifically focuses on RNA degradation products, while other RNA sequencing methods like RNA-Seq typically analyze the entire transcriptome. This makes degradome sequencing uniquely suited for studying miRNA/siRNA-mediated RNA cleavage events.

Degradom-Sequenzierung

CD Genomics kann jetzt den Degradom-Sequenzierungsdienst anbieten, um einen umfassenderen Einblick in die Landschaft der pflanzlichen Mikro-RNAs zu ermöglichen. Mit unserem Service können Sie die mRNA-Ziele der Mikro-RNAs auf eine hochsensible und genaue Weise nachweisen.

Die Einführung der Degradom-Sequenzierung

Mikro-RNAs (miRNAs) sind eine Klasse von endogenen nicht-kodierenden RNAs mit einer Länge von 20-24 Nukleotiden (nt), die durch hochpräzise Exzision aus Stem-Loop-Vorläufern produziert werden. Mikro-RNAs sind wichtige Regulatoren der Genexpression auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene. Die reife miRNA wird in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) rekrutiert, um mRNA-Ziele abzubauen und deren Translation zu unterdrücken. miRNAs sind aufgrund von Vergleichen zwischen verschiedenen Arten hochkonserviert. Es gibt auch nicht-konservierte und artspezifische miRNAs in Pflanzen. Nicht-konservierte miRNAs werden oft in niedrigen Mengen exprimiert, und daher werden viele in kleineren Sequenzierungsprojekten nicht identifiziert. Kleine RNA-Sequenzierung Die Technologie hat die Identifizierung von miRNAs mit geringer Häufigkeit ermöglicht.

Modifiziertes 5' RACE (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) wurde häufig zur Bestätigung von Zielen und zur Kartierung von Schnittstellen verwendet. Dennoch ist dieser Ansatz arbeitsintensiv, zeitaufwändig, kostspielig und nur für feingliedrige Untersuchungen anwendbar. Kürzlich hat sich das Degradom-Sequenzieren, auch bekannt als parallele Analyse von RNA-Enden (PARE), als eine leistungsstarke Methode herausgestellt, die beides kombiniert. Hochdurchsatz-Sequenzierung und modifizierte 5' RACE, um nach miRNA und ta-siRNA zu suchentrans-acting siRNA) Ziele in großem Maßstab. Bei dieser Methode wird degradiertes, gekapptes mRNA adapter-ligiert und rücktranskribiert. Die Fragmente werden dann mit Mmel verdaut, gereinigt, 3'-Adapter-ligiert und PCR-amplifiziert. Die Tiefensequenzierung der cDNA und die Degradom-Analyse liefern umfassende Informationen über ungecapte Transkripte, die in Pflanzen degradiert werden.

Vorteile der Degradom-Sequenzierung

Identifizierung bekannter und neuer miRNAs und ta-siRNAs
Identifizierung von miRNA-Zielen und regulatorischen Netzwerken
Statistische Zusammenfassung der mRNA-Abbaustellen
Untersucht neuartige Biomarker und regulatorische Netzwerke von circRNAs
Hochdurchsatz und hochauflösend

Degradom-Sequenzierungs-Workflow

Der allgemeine Arbeitsablauf für Degradom-Sequenzierung ist unten skizziert. Um eine Degradom-Sequenzierungsbibliothek zu erstellen, besteht der erste Schritt darin, PolyA-RNA-Proben mit einem RNA-Adapter zu ligieren, der eine 3'Mme I-Stelle enthält, und diese zu transkribieren. Nach der Synthese des zweiten Strangs, der Mme I-Digestion, der Gelreinigung und der PCR-Amplifikation wird der 3'-Adapter für die Tiefensequenzierung ligiert. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch und überwacht jeden Schritt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten.

Workflow Diagram of Degradome Sequencing.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenart: Totale RNA ohne Abbau oder DNA-Kontamination Gesamt-RNA ≥ 20 μg, Mindestmenge: 15 μg, Konzentration ≥ 100 ng/µL OD A260/A280-Verhältnis ≥ 1,8, A260/230-Verhältnis ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Alle Gesamtrna-Proben sollten DNA-frei sein. RNA sollte in nukleasefreiem Wasser oder RNA Stable aufbewahrt werden. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Degradome-Bibliotheksvorbereitung Illumina HiSeq SE50 Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Bioinformatikanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle von Rohdaten Referenzbasierte Zuordnung Identifizierung bekannter und neuer nicht-kodierender RNAs Verteilungsanalyse von Abbaufragmenten in der ausgewählten Region des Genoms Identifizierung von Ziel-mRNAs Statistische Zusammenfassung der mRNA-Abbaustelle GO/KEGG-Analyse Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

The Data Analysis Pipeline of Degradome Sequencing.

Liefergegenstände

Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
Experimentelle Ergebnisse
Datenanalysebericht
Details zur Degradom-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Unterstützt von unseren erfahrenen Wissenschaftlern und fortschrittlicher Technologie kann CD Genomics Ihnen helfen, kleine RNA-Ziele mit einer Einzelbasenauflösung gleichzeitig zu identifizieren durch die Hochdurchsatz-Sequenzierung durch strenge Qualitätskontrollen und fortschrittliche bioinformatische Analysen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Demonstrationsergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Distribution graph showing sequencing quality metrics

Sequenzierungsqualitätsverteilung

Nucleotide distribution chart for A, T, G, and C bases

A/T/G/C-Verteilung

Genome visualization in IGV browser with sample data

IGV-Browser-Oberfläche

Sample correlation analysis scatter plot

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA score plot visualizing sample group differences

PCA-Score-Diagramm

Venn diagram illustrating data overlap between groups

Venn-Diagramm

Volcano plot of differentially expressed gene analysis

Vulkan-Diagramm

GO annotation statistics showing category breakdowns

Statistik Ergebnisse der GO-Annotierung

KEGG pathway classification of gene functions

KEGG-Klassifikation

Degradome Seq FAQs

1. Was ist das Prinzip der Degradom-Sequenzierung?

Bei Tieren wird angenommen, dass die Proteinrepression durch translationale Hemmung sowie durch mRNA-Abbau erfolgt. Bei Pflanzen degradieren miRNAs ihre mRNA-Ziele durch präzise Spaltung zwischen dem 10. und 11. Nukleotid vom 5'-Ende der miRNA im komplementären Bereich des Zieltranskripts, wodurch ein ausgeprägter Peak des Degradom-Sequenz-Tags an der vorhergesagten Spaltungsstelle im Vergleich zu anderen Regionen des Transkripts entsteht. Basierend auf diesem Prinzip wird die Degradom-Sequenzierung hauptsächlich verwendet, um global Überreste von durch kleine RNA geleiteten Spaltungen zu identifizieren, indem die 5'-Enden von nicht gekappten RNAs in Pflanzen sequenziert werden.

2. Was sind die Vorteile der Degradom-Sequenzierung zur Identifizierung von miRNA-Zielen?

Tabelle 1. Der Vergleich von Degradom-Sequenzierung und traditionellen Methoden zur Vorhersage von miRNA-Zielen.

	Degradom-Sequenzierung	Luciferase-Reporter-Gen-Assay	Argonaute-RNA-Immunopräzipitation (AGO-RIP)	5' RACE (schnelle Amplifikation der cDNA-Enden)
Durchsatz	Hoch	Niedrig	Niedrig	Niedrig
Betrieb	Einfach	Kompliziert	Kompliziert	Einfach
Periode	Kurz	Lang	Lang	Lang
Genauigkeit	Hoch	Hoch	Relativ hoch	Relativ hoch

3. Wie unterscheidet sich die Degradom-Sequenzierung von anderen RNA-Sequenzierungsmethoden?

Degradom-Sequenzierung konzentriert sich speziell auf RNA-Abbauprodukte, während andere RNA-Sequenzierungsmethoden wie RNA-Seq Typischerweise wird das gesamte Transkriptom analysiert. Dies macht die Degradom-Sequenzierung besonders geeignet für das Studium von miRNA/siRNA-vermittelten RNA-Spaltungsevents.

Referenz

Riffo-Campos, Á.L., u. a.Werkzeuge zur sequenzbasierten Vorhersage von miRNA-Zielen: Was soll man wählen? Internationale Zeitschrift für Molekularwissenschaften, 2016, 17(12): 1987.

Degradome-Seq Fallstudien

Kleine RNA- und Degradom-Sequenzierung zeigt wichtige MikroRNA-Funktionen in Astragalus chrysochlorus Reaktion auf Selenstimuli

Journal: Pflanzenbiotechnologie-Journal
Impactfaktor: 6,305
Veröffentlicht: 21. Mai 2015

Zusammenfassung

Astragalus Arten, die als Hyperakkumulatoren von Se bekannt sind, indem sie es in nicht-amino-säurehaltige Verbindungen umwandeln. Aber wir haben keine Ahnung über die mit dem Se-Stoffwechsel verbundene Hyperakkumulation. Die Autoren versuchten zu verstehen, ob miRNAs eine Rolle bei der Se-Akkumulation in Pflanzen spielen. In dieser Studie identifizierten sie 418 bekannte miRNAs und 151 neuartige miRNAs, die durch Se-Exposition induziert wurden in Astragalus chrysochlorusDurch tiefgehende Degradom-Sequenzierung enthüllten die Autoren wichtige miRNA-Funktionen in Ein. Chrysochlorus Reaktion auf Selenstimuli.

Materialien & Methoden

Proben

Kallusgewebe von Ein. Chrysochlorus Samen;
Selenbehandlung.

Sequenzierung

RNA-Isolierung
RNA-Qualitäts- und -Mengenmessungen
Kleine RNA-Sequenzierung
Degradom-Sequenzierung

Datenanalyse

miRNA-Identifizierung
Zielvorhersage
Funktionsklassifizierung basierend auf GO- und KEGG-Analysen

Ergebnisse

1. miRNA-Identifikation und Expressionsprofile.

Insgesamt wurden 418 bekannte und 151 neuartige miRNAs identifiziert. Die Verteilung der miRNAs zwischen der Kontroll- und der Se-Behandlung ist in Abbildung 1 dargestellt. Die 418 miRNAs gehören zu 380 miRNA-Familien, und 160 miRNA-Familien wurden in beiden Proben (Kontrolle und Se-behandelt) unterschiedlich exprimiert. 30 neuartige miRNAs wurden nach der Se-Behandlung unterschiedlich exprimiert.

Figure 1. Distribution of miRNAs in control and Se-treated samples: (c) conserved miRNAs; (d) novel miRNAs. (Cakir et al., 2016) Abbildung 1. Verteilung der miRNAs zwischen Kontrolle und Se-Behandlung: (a) konservierte miRNAs; (b) neuartige miRNAs.

Figure 2. Small RNA expression profiles in control and Se-treated callus of A. chrysochlorus. (Cakir et al., 2016) Abbildung 2. Kleine RNA-Expressionsprofile von Kontroll- und mit Se-behandeltem Kallus von Ein. Chrysochlorus.

Figure 3. Expression profiles of randomly selected miRNAs with varying abundance in Se-treated A. chrysochlorus calli. (Cakir et al., 2016) Abbildung 3. Expressionsprofile von zufällig ausgewählten miRNAs mit unterschiedlicher Häufigkeit in Se-behandelten Ein. Chrysochlorus Insgesamt wurden 1339 vorhergesagte Stellen identifiziert, die von 499 miRNAs geschnitten werden. Die Zielgene wurden annotiert und als Transkriptionsfaktoren und deren Untereinheiten, enzymkodierende Gene, Resistenzproteine, Leucin-reiche Wiederholungen, Leucinzipper, Zinkfingerproteine sowie andere strukturelle und funktionelle Proteine klassifiziert.

Figure 4. Target plots (t-plots) illustrating miRNAs and their respective targets. (Cakir et al., 2016) Abbildung 4. Zielplots (t-Plots) von miRNAs und ihren Zielen. Die roten Pfeile zeigen die häufigsten Spitzen oder Spaltstellen an. (a) miR162-3p zielt auf das Endonuklease Dicer-Homolog-1-ähnliche Protein; (b) miR1513a zielt auf das blau licht-aktivierte Histidin-Kinase; (c) miR2118b zielt auf das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-ähnliche Protein; (d) miR172c zielt auf das putative ethylen-responsive Transkriptionsfaktor RAP-2-7-ähnliche Protein; (e) miR159b-3p zielt auf ein hypothetisches Protein 11M9.5; (f) miR166 h-3p zielt auf das Homeobox-Leucin-Zipper-Protein ATHB-15-ähnliches Protein.

3. GO- und KEGG-Pfadanalysen

Die Ziele der identifizierten miRNAs wurden einer GO- und KEGG-Analyse unterzogen, um ihre biologischen Rollen zu verstehen. Die Zielgene sind an 47 Arten von Zellkomponenten, 103 Arten von molekularen Funktionen und 144 Arten von biologischen Prozessen beteiligt.

Figure 5. Gene Ontology (GO) classifications of miRNA targets in A. chrysochlorus. (Cakir et al., 2016) Abbildung 5. GO-Klassifikationen der miRNA-Ziele in Ein. Chrysochlorus.

Figure 6. KEGG plant-pathogen interaction pathway highlighting novel and known miRNAs identified in this study that potentially target genes involved in this pathway. (Cakir et al., 2016) Abbildung 6. KEGG-Pflanzen-Pathogen-Interaktionsweg und neuartige sowie bekannte miRNAs, die in dieser Studie identifiziert wurden und möglicherweise die in diesem Weg beteiligten Gene anvisieren.