RNA-Seq

CD Genomics bietet seit Jahrzehnten einen genauen und erschwinglichen RNA-Seq (RNA-Sequenzierung) Service an. Wir kombinieren beides Illumina (kurze Lesungen) und PacBio (long reads) Plattformen zur Erfassung des Transkriptoms, die eine de novo Assemblierung oder Neusequenzierung ermöglichen für BakterienPflanzen, Tiere und Menschen.

Was ist RNA-Seq?

RNA-Seq, ein entscheidendes Werkzeug, das verwendet wird Next-Generation Sequencing (NGS) Technologien, die entwickelt wurden, um detaillierte Karten und Quantifizierungen der Transkriptom, wodurch Informationen wie Gen-Transkriptionsniveaus, die Struktur und Expression von Transkripten, RNA-Modifikationen und nicht-kodierende RNA sowie andere Aspekte aufgedeckt werden. Das Transkriptom, eine umfassende Sammlung aller Transkripte in einer Zelle, bietet wichtige Informationen über Transkriptlevels in bestimmten Entwicklungsstadien oder physiologischen Zuständen. Das Verständnis des Transkriptoms ist entscheidend, um die funktionalen Elemente des Genoms zu interpretieren sowie biologische Entwicklungen und Krankheiten zu verstehen. Zu den Hauptzielen der Transkriptomik gehören die Katalogisierung aller Transkriptarten, die Bestimmung der transkriptionalen Struktur von Genen und die Quantifizierung der Expressionsniveaus jedes Transkripts unter unterschiedlichen Bedingungen.

Durch die Bereitstellung einer unverzerrten hochauflösenden Sicht auf globale Transkriptionsmuster führt RNA-Seq eine kostengünstige und genaue Methode zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der differentiellen Genexpression über mehrere Probengruppen ein. Es ermöglicht die Identifizierung neuartiger und zuvor unvorhergesehener Transkripte, unabhängig von einem Referenzgenom, und erleichtert somit die de novo Assemblierung ununtersuchter Transkriptome. Darüber hinaus ermöglicht es die Entdeckung neuer Genarchitekturen, alternativ gespleißter Isoformen, Genfusionen, SNP/InDel und allelspezifischer Expressionen (ASE).

Vorteile von RNA-Seq

• Quantitative und präzise Messungen von RNA-Molekülen mit einer Auflösung auf Einzel-Basenpaar-Ebene
• Entdeckung neuer Transkripte, Spleißvarianten und Genfusionen
• Bemerkenswerterweise ist diese Strategie auf jede Art anwendbar, unabhängig von der Verfügbarkeit des Referenzgenoms.
• Eine Praxis, die vergleichbare oder sogar niedrigere Kosten im Vergleich zu vielen anderen Methoden bietet.
• Der Ansatz erkennt geschickt verschiedene RNA-Typen, die sich erstrecken über mRNAmiRNA, lncRNA und andere bieten einen umfassenden Überblick über die RNA, die in Zellen oder Geweben vorhanden ist.
• Bemerkenswert ist die Fähigkeit, mehrere Proben gleichzeitig zu analysieren und dabei effizient umfangreiche Daten zu sammeln – ein Merkmal, das seinen tiefgreifenden Nutzen in der Hochdurchsatz-RNA-Analyse unterstreicht.

RNA-Seq-Entwicklung

Die Sequenzierungstechnologie hat im Laufe der Zeit erhebliche Veränderungen und Fortschritte erfahren, insbesondere in den letzten zwei bis drei Jahrzehnten. Zunächst, Sanger-Sequenzierung wurde als die Methode der ersten Generation für die Sequenzierung etabliert. Durch die Nutzung reversibler Terminierungs-Synthesereaktionen in der binären Chemie ermöglichte die Sanger-Sequenzierung die Bestimmung von Basensequenzen an den DNA-Termini in Übereinstimmung mit der RNA-Sequenz. Die 1990er Jahre markierten bemerkenswerte Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie, die mit dem Beginn der Projekte zur Sequenzierung des gesamten Genoms einhergingen. Einführung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattformen wie die 454-Sequenzierung, Illumina-Sequenzierungund Ion Torrent-Sequenzierung erleichterten die Machbarkeit der RNA-Sequenzierung. Traditionelle RNA-Sequenzierungstechnologien erforderten oft ein erhebliches Volumen an Zellen, um eine zufriedenstellende Menge an RNA für die Sequenzierung zu erhalten, was die Heterogenität zwischen verschiedenen Zellen in den Hintergrund drängte. Im Wesentlichen decken diese Techniken die Merkmale der Genexpression unterschiedlicher Zelltypen und -zustände auf.

Die Anwendungen von RNA-Seq

RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist eine weit verbreitete Technik, die in verschiedenen Bereichen der biologischen und medizinischen Forschung anwendbar ist. Im Folgenden sind mehrere gängige Anwendungen von RNA-seq aufgeführt:

• Genexpressionsanalyse
• Differenzielle Genexpressionsanalyse
• Entdeckung neuer Gene
• Analyse des alternativen Spleißens
• Biomarker Entdeckung
• Forschung zu nicht-kodierenden RNAs
• Aufklärung der Genfunktion
• Populationsgenetik und Evolutionsbiologie

In der Tat erweitert sich der Anwendungsbereich von RNA-seq mit den technologischen Fortschritten unaufhörlich.

RNA-Seq-Workflow

CD Genomics kombiniert sowohl Illumina HiSeq als auch PacBio-Systeme um eine schnelle und präzise RNA-Seq- und bioinformatische Analyse für jede Art bereitzustellen. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt das Qualitätsmanagement durch und befolgt jeden Schritt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten. Der allgemeine Arbeitsablauf für RNA-Seq ist unten skizziert.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen und Vorbereitung RNA-Menge ≥ 2 μg, RNA-Konzentration ≥ 50 ng/μl, OD260/280=1,8~2,0 Alle RNA-Proben werden auf Reinheit und Menge validiert.
Klicken	Sequenzierung Regulär: Illumina HiSeq PE150 Differenzielle Genexpressionsstudie: Illumina HiSeq 50 Vollständiges Transkript: PacBio SMRT Mehr als 80 % der Basen mit einem ≥Q30-Qualitätswert
	Bioinformatische Analyse Wir bieten maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an, einschließlich: Statistiken zur Sequenzierungstiefe und -abdeckung De-novo-Assemblierung und Referenzgenom-Kartierung Genannotationen und Genexpressionsniveaus Vorhersage neuartiger RNA und Identifizierung von Varianten Test auf differentielle Genexpression Bewertung der allele-spezifischen Expression Identifizierung von expressionsquantitativen Merkmal-Loci (eQTLs)

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in RNA-Seq für Ihr Schreiben (Anpassung)

CD Genomics bietet ein umfassendes RNA-Sequenzierungsdienstleistungspaket an, das die Standardisierung von Proben, den Bibliotheksaufbau, tiefes Sequenzieren, die Qualitätskontrolle der Rohdaten, die Genomassemblierung und maßgeschneiderte bioinformatische Analysen umfasst. Wir können diesen Ablauf an Ihr Forschungsinteresse anpassen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Marguerat S, Bähler J. RNA-Seq: Von der Technologie zur Biologie. Zell- und Molekularbiowissenschaften, 2010, 67: 569-579.
2. Hrdlickova R, Toloue M, Tian B. RNA-Seq-Methoden zur Transkriptomanalyse. Wiley Interdisziplinäre Reviews: RNA, 2017, 8(1): e1364.
3. Saliba A E, Westermann A J, Gorski S A, et al. Einzelzell-RNA-Sequenzierung: Fortschritte und zukünftige Herausforderungen. Nukleinsäureforschung, 2014, 42(14): 8845-8860.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Sequenzierungsqualitätsverteilung

A/T/G/C-Verteilung

IGV-Browser-Oberfläche

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA-Score-Diagramm

Venn-Diagramm

Volcano-Diagramm

Statistik Ergebnisse der GO-Anmerkung

KEGG-Klassifikation

1. Wie viele biologische Replikate benötige ich für jede Bedingung?

Wir empfehlen Ihnen, mindestens 3 Replikate pro Probe einzureichen, um das Vertrauen zu erhöhen und experimentelle Fehler zu reduzieren. Beachten Sie, dass dies nur als Richtlinie dient und die endgültige Anzahl der Replikate von Ihnen basierend auf Ihren endgültigen experimentellen Bedingungen festgelegt wird.

2. Welche Vorteile hat NGS gegenüber Mikroarray?

Es wurden verschiedene Technologien zur Analyse des Transkriptoms entwickelt, wie zum Beispiel Mikroarray und NGS. Im Vergleich zu Mikroarray hat NGS mehrere Vorteile, darunter:

i. RNA-Seq ist ein sensibles Werkzeug zur Profilerstellung der Genexpression. Im Vergleich zu Mikroarrays bietet RNA-Seq eine digitale Ablesung, die für die gesamte Genexpression genauer ist.

ii. Mikromatrizen können nur begrenzte Informationen zur Genexpression bieten (d.h. die in den Chip integrierten Gene), während NGS einen umfassenderen Ansatz darstellt, der zusätzliche Informationen zu neuartigen Genvarianten und Transkripten mit geringer Abundanz liefert.

iii. NGS liefert weitaus reproduzierbarere und zuverlässigere Ergebnisse als Mikroarray. Es ist nicht erforderlich, nach RNA-Seq qPCR durchzuführen, während dies ein Standardverfahren für Mikroarray um Ergebnisse zu überprüfen.

3. Wann ist es notwendig, rRNA vor dem Sequenzieren zu eliminieren?

Ribosomale RNA (rRNA) macht über 90 % der gesamten RNA aus. Die Durchführung von RNA-Seq ohne Anreicherung für Poly-A oder Depletion von rRNA führt dazu, dass die meisten Reads überwiegend aus rRNA stammen. Zum Beispiel würden weniger als ein Zehntel der Reads nützliche Informationen enthalten. Transkripte aus rRNA-depletierten Transkriptomen werden konventionell als totale RNA betrachtet, die umfasst mRNA und nicht-kodierende RNA. Folglich ist die Poly-A-Anreicherung oder die rRNA-Depletion für jede Sequenzierungsplattform unerlässlich.

4. Was ist die konventionelle Pipeline für die RNA-Seq-Datenanalyse?

Die herkömmliche Pipeline für RNA-Seq-Daten umfasst die Qualitätskontrolle der Rohdaten, die Ausrichtung, die Assemblierung, die Genexpressionsprofilierung und weitere Analysen.

Abbildung 1. Übersicht über die RNA-Seq-Datenanalyse (Kukurba und Montgomery 2015).

Die Unterscheidung zwischen DNA-Sequenzierung und RNA-Sequenzierung resultiert aus ihren unterschiedlichen analytischen Fähigkeiten. Die DNA-Sequenzierung ermöglicht es uns, die Zusammensetzung der Gene im Genom eines Organismus zu verstehen, ihre Funktionen zu erkennen und ein umfassendes Wissen über intergenetische Beziehungen zu erlangen. Andererseits verfeinert die RNA-Sequenzierung unser Verständnis biologischer Mechanismen und Veränderungen, die in Lebensprozessen auftreten. Dies wird erreicht, indem man die Expressionsniveaus, die Vielfalt und die Regulationsmechanismen untersucht.

RNA-Sequenzierung zielt speziell auf RNA-Moleküle ab, enthüllt die Struktur und Funktion des Transkriptoms und identifiziert Variationen in der Genexpression. Im Prozess werden RNA-Moleküle in ihre komplementären DNA-Gegenstücke (bekannt als cDNA) transkribiert, die dann sequenziert werden. Zu den häufigen Komponenten der RNA-Sequenzierung gehören in der Regel die vollständige Transkriptomsequenzierung, die Analyse der differentiellen Expression und andere.

Referenz:

1. Kukurba K R, Montgomery S B. RNA-Sequenzierung und Analyse. Cold Spring Harbor Protokolle, 2015(11): pdb. top084970.

Transkriptomcharakterisierung durch RNA-Sequenzierung identifiziert eine wesentliche molekulare und klinische Unterteilung in der chronischen lymphatischen Leukämie.

Journal: Genomforschung
Impactfaktor: 11,92
Veröffentlicht: online am 21. November 2013

Zusammenfassung

Die Autoren führten eine tiefgehende RNA-Sequenzierung in verschiedenen Subpopulationen normaler B-Lymphozyten und Zellen der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) aus einer Kohorte von 98 Patienten durch. Sie entdeckten Tausende von Transkriptionselementen, die unterschiedlich zwischen den CLL- und normalen B-Zellen exprimiert wurden oder spezifische Splicing-Muster der CLL aufwiesen. Zudem identifizierten sie eine wesentliche molekulare und klinische Unterteilung in der CLL.

Methoden

Ergebnisse

1. Die Genexpressionslandschaft von CLL

Die Autoren fanden 1089 Gene, die zwischen den CLL- und normalen B-Zellen unterschiedlich exprimiert sind (Tabelle 1). Wie erwartet sind die am stärksten unterschiedlich exprimierten Gene Immunglobuline, was auf die Klonalität der CLL-Zellen zurückzuführen ist. Pfadanalysen zeigten, dass Gene, die an Stoffwechselwegen beteiligt sind, in CLL eine höhere Expression aufwiesen, während Gene, die mit dem Spliceosom, dem Proteasom und dem Ribosom in Zusammenhang stehen, in CLL erheblich herunterreguliert waren.

Tabelle 1. Unterschiede in der Expression und Spleißung zwischen den verschiedenen analysierten Gruppen.

Abbildung 1. Transkriptionale Landschaft der CLL. (A) Das Kodierungspotenzial von differentiell exprimierten Genen zwischen den CLL- und normalen Proben. (B) Normalisierte Expression von transponierbaren Elementen (TEs). (C) Gene mit bedingungsspezifischen Spleißverhältnissen. (D) Allelspezifische Expression somatischer Mutationen.

2. Die Spleißlandschaft von CLL

Die Autoren identifizierten 2000 Gene mit signifikanten Unterschieden in den relativen Verhältnissen von alternativen Spleißisoformen zwischen den CLL- und normalen Zellen, einschließlich Gene mit gut bekannten alternativen Isoformen als Krebsbiomarker, wie RAC1, CD44 und BCL2L1. Veränderungen im BCR-Signalweg wurden auf der Ebene der Expression und der Spleißung identifiziert (Abbildung 2).

Abbildung 2. Spleißänderungen im BCR-Weg zwischen normalen (N) und Tumor (T) Proben.

Transkriptionale Chimären in CLL

Genfusionen, die zu chimären Proteinen führen, stellen einen wichtigen Mechanismus der Karzinogenese dar. Die Autoren identifizierten 122 chimäre Junctions, die ausschließlich in CLL-Zellen mittels RNA-seq-Analyse vorhanden sind. Sie wählten zwei Chimären (die chimäre Junction FCRL2-FCRL3 und die chimäre Junction GAB1-SMARCA5) zur weiteren Validierung durch PCR und Sanger-Sequenzierung aus.

Abbildung 3. Chimäre Übergänge zwischen FCRL2-FCRL3 und GAB1-SMARCA5.

4. Identifizierung von zwei Haupttranskriptionalen CLL-Subgruppen

Die hierarchische Clusteranalyse der RNA-seq-Proben basierend auf der Genexpression trennte deutlich normale Zellen von Tumorproben (Abbildung 4A). Das Clustering offenbarte zwei große, klar definierte Untergruppen innerhalb der CLL-Proben, was durch multidimensionale Skalierung und Hauptkomponentenanalyse weiter unterstützt wurde.

Abbildung 4. Haupttranskriptionale CLL-Subgruppen. (A) Clusterung von CLL- und normalen Proben. (B) Konsenscluster. (C) Multidimensionale Skalierung von CLL- und normalen Proben basierend auf der Genexpression. (D&E) Anreicherungswertdiagramm.

5. Klinische Relevanz der C1- und C2-CLL-Gruppen

Die Autoren bewerteten die klinischen Auswirkungen der CLL-Gruppen C1 und C2. Im Vergleich zu C1-Patienten wiesen C2-Patienten eine höhere Häufigkeit von Mutationen in Genen auf, die mit einem ungünstigen Verlauf in Verbindung stehen, und hatten eine höhere Wahrscheinlichkeit, sich im fortgeschrittenen Binet-Stadium zu befinden.

Abbildung 5. Klinisches Verhalten der C1- und C2-Subgruppen.

Fazit

Wir identifizierten eine differentielle Expression von Tausenden von Transkriptionselementen zwischen CLL- und normalen B-Zellen, einschließlich protein-codierender Gene, nicht-codierender RNAs und Pseudogene. Darüber hinaus wiesen die meisten Gene CLL-spezifische Spleißmuster auf. Durch die Clusteranalyse von RNA-Sequenzierungsdaten erkannten wir zwei molekulare Subgruppen, C1 und C2, die eng mit klinischen biologischen Merkmalen und der Behandlungsdauer verbunden sind. Nachfolgende Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Aktivierung des B-Zell-Rezeptors (BCR) im Mikroumfeld der Lymphknoten möglicherweise die Quelle der Unterschiede zwischen C1 und C2 ist.

Referenz:

1. Ferreira P G, Jares P, Rico D, et al. Die Charakterisierung des Transkriptoms durch RNA-Sequenzierung identifiziert eine wesentliche molekulare und klinische Unterteilung in der chronischen lymphatischen Leukämie. Genomforschung, 2014, 24(2): 212-226.