Can all eukaryotes undergo mRNA sequencing?

Eukaryotic mRNA contains a poly-A tail, and the common method for enriching eukaryotic mRNA involves capturing mRNA from total RNA using magnetic beads attached to poly-T oligos, followed by library construction for sequencing. Therefore, theoretically, all eukaryotes can undergo mRNA sequencing.

Why does mRNA sequencing require higher RNA integrity than whole transcriptome sequencing?

In mRNA sequencing library construction, RNA molecules with a poly-A tail are captured using magnetic beads. If RNA integrity is poor and mRNA is partially degraded, leading to poly-A tail loss, the captured mRNA from samples with lower integrity is reduced, resulting in lower gene coverage. Hence, a higher level of RNA integrity is required.

Can mRNA-seq detect non-coding RNA?

mRNA-seq primarily captures RNA molecules with a poly(A) tail; hence, theoretically, any poly(A)-tailed molecule expressed in the cell can be detected. This includes mRNA and long non-coding RNAs with poly(A) tails.

What is the difference between total RNA-seq and mRNA-Seq?

Total RNA-Seq , or whole transcriptome sequencing, is an exhaustive method that encompasses the sequencing of all RNA species after ribosomal RNA (rRNA) removal, including coding and non-coding RNAs. This encompasses RNA like rRNA, precursor mRNA (pre-mRNA), messenger RNA (mRNA), and a variety of non-coding RNAs (ncRNA) such as transfer RNA (tRNA), microRNA (miRNA), and long non-coding RNA (lncRNA). Conversely, mRNA-Seq specifically targets coding regions by enriching polyadenylated (poly(A)) RNA, making it a more cost-effective and streamlined approach for studies primarily focused on mRNA analysis.

Should you choose mRNA sequencing or total RNA sequencing?

For research involving eukaryotic organisms and with a primary interest in coding regions, mRNA-Seq is the optimal choice. The mRNA-Seq approach enriches mRNA through Poly(A) selection, reducing sequencing costs and complexity, particularly suitable for samples with limited starting material. On the other hand, if a comprehensive analysis encompassing all RNA, including coding and non-coding RNA molecules, is required, total RNA-Seq is the preferred option, despite its higher cost and greater sequencing data demand. The selection between methods should be based on specific experimental objectives, biological questions, sample types, and budget constraints.

mRNA-Sequenzierungsdienst

Was ist mRNA-Sequenzierung?

mRNA wird von protein-codierenden Genen transkribiert und dient als das intermediäre RNA-Molekül, das genetische Informationen von DNA zu Proteinen überträgt. In Eukaryoten wird DNA zunächst in prä-mRNA transkribiert, die eine Reihe von Verarbeitungsschritten durchläuft, um reife mRNA zu bilden. Die reife mRNA wird dann ins Zytoplasma transportiert und von Ribosomen in Proteine übersetzt. Die Reifung von mRNA umfasst drei Hauptverarbeitungsschritte: Spleißen, 5'-Capping und 3'-Polyadenylierung. Infolgedessen besitzen reife mRNA-Moleküle einen Poly(A)-Schwanz an ihrem 3'-Ende.

Fig 1. Definition of mRNA. Abb. 1. Was ist mRNA.

mRNA-seq ist ein Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie, die zur Erkennung von mRNA-Expression und -Verarbeitung entwickelt wurde. Die Untersuchung der mRNA-Sequenzierung bei Eukaryoten konzentriert sich auf die Sammlung von mRNAs, die aus spezifischen Zellen oder Geweben unter bestimmten funktionalen Zuständen transkribiert werden. Sie kann verwendet werden, um differenzielle mRNA-Expression zu untersuchen, strukturelle Variationen zu erkennen und molekulare Marker zu identifizieren, die mit Krankheiten oder Eigenschaften assoziiert sind. Sie kann auch die Komplexität des Transkriptoms aufdecken, Gene und Transkriptstrukturen, variables Spleißen, RNA-Bearbeitung, polyadenylierte nicht-kodierende RNAs und neuartige Transkripte bestimmen. Derzeit wird mRNA-seq in Bereichen wie Grundlagenforschung, molekularer Züchtung, klinischer Diagnostik und Arzneimittelentwicklung.

mRNA-seq Technisches Prinzip

Für RNA mit Poly(A)-Schwänzen, wie mRNA und einigen lncRNAs, wird eine Anreicherung mit Oligo dT durchgeführt, die die polyadenylierten RNA einfängt, auch bekannt als PolyA-Seq. Die angereicherte mRNA/lncRNA wird dann fragmentiert, revers transkribiert, mit gemeinsamen Sequenzierungsadaptern ligiert und PCR-amplifiziert, um Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen. Die resultierenden Sequierungsdaten werden einer bioinformatischen Analyse unterzogen, um Informationen über Genexpression, alternatives Spleißen, RNA-Bearbeitung und andere Merkmale, die in der RNA vorhanden sind, zu erhalten.

Fig 2. Overview of mRNA-seq Workflow. Abb. 2. Allgemeiner Arbeitsablauf von mRNA-seq.

Vorteile unseres mRNA-Sequenzierungsdienstes

Im Vergleich zu Genexpressions-Mikroarrays hat mRNA-Seq mehrere Vorteile in Transkriptomanalyse:
Es hat einen breiteren dynamischen Bereich, der sowohl die Empfindlichkeit als auch die Genauigkeit bei der Messung von Faltänderungen in der Genexpression erhöht.
Es kann sowohl bekannte Merkmale als auch neuartige Merkmale erfassen.
Es kann breit auf verschiedene Arten angewendet werden.
Neben der Berechnung der Genexpressionsniveaus kann es Sequenz- und Strukturvariationen in Transkripten erkennen.
Eine erhöhte Sequenzierungstiefe ermöglicht einen breiteren dynamischen Erfassungsbereich, der die Identifizierung und Quantifizierung sowohl hochabundanter als auch niedrigabundanter Transkripte über einen Bereich von sechs Größenordnungen hinweg ermöglicht.
Neben der Erkennung der Expressionsniveaus bekannter Transkripte kann es auch neuartige Transkripte entdecken.
Wenn es auf Arten ohne Referenzgenom angewendet wird, kann es neue Gene durch de novo Assemblierung entdecken.

mRNA-Sequenzierungsdienst-Workflow

Für mRNA-Seq bietet unser Unternehmen experimentelle Dienstleistungen an, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung basierend auf Geweben und Zelllinien sowie optimierte und maßgeschneiderte bioinformatische Analysen und Interpretationsdienste.

Workflow Diagram of mRNA Sequencing.

Dienstspezifikation

	Musteranforderungen Gesamt-RNA ≥ 500 ng, Mindestmenge: 200 ng, Konzentration ≥ 20 ng/µl Zellen ≥ 1×10⁶ Gewebe ≥ 50 mg, Mindestmenge: 10 mg OD A260/A280-Verhältnis ≥ 1,8, A260/230-Verhältnis ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Alle Gesamt-RNA-Proben sollten DNA-frei sein. RNA sollte in nukleasefreiem Wasser oder RNA Stable aufbewahrt werden. Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategien Illumina NovaSeq, PE 150 Sequenzierungsdatenmenge: 5 Gb Rohdaten
	Datenanalyse Wir bieten mehrere maßgeschneiderte bioinformatische Analysen an: Qualitätskontrolle Filtern Ausrichtung an das Referenzgenom mRNA-Quantifizierung Differenzielle Genanalyse Beispiel für eine Clusteranalyse Funktionelle Anreicherungsanalyse von differentiell exprimierten Genen Protein-Interaktionsanalyse von differentially exprimierten Genen Strukturanalyse von Interaktionsnetzwerken Hinweis: Die empfohlenen Datenausgaben und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen, bitte Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

The Data Analysis Pipeline of microRNA Sequencing.

Liefergegenstände

Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
Experimentelle Ergebnisse
Datenanalysebericht
Details in der mRNA-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Bei CD Genomics bieten wir hochmoderne mRNA-Sequenzierungsdienste an, die auf verschiedene Forschungsbedürfnisse zugeschnitten sind. Unser Service umfasst eine strenge Qualitätskontrolle der Proben, eine fachkundige Bibliotheksvorbereitung, Hochdurchsatz-Sequenzierungund detaillierte Datenanalysen. Wir legen Wert darauf, präzise und umfassende Ergebnisse zu liefern, die mit den spezifischen Zielen Ihrer Forschung übereinstimmen. Kontaktieren Sie uns, um zu erfahren, wie unsere mRNA-Sequenzierungslösungen Ihre wissenschaftlichen Bestrebungen unterstützen und verbessern können.

Demonstrationsergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Distribution graph showing sequencing quality metrics

Sequenzierungsqualitätsverteilung

Nucleotide distribution chart for A, T, G, and C bases

A/T/G/C-Verteilung

Genome visualization in IGV browser with sample data

IGV-Browser-Oberfläche

Sample correlation analysis scatter plot

Korrelationsanalyse zwischen Proben

PCA score plot visualizing sample group differences

PCA-Score-Diagramm

Venn diagram illustrating data overlap between groups

Venn-Diagramm

Volcano plot of differentially expressed gene analysis

Volcano-Diagramm

GO annotation statistics showing category breakdowns

Statistik Ergebnisse der GO-Annotierung

KEGG pathway classification of gene functions

KEGG-Klassifikation

mRNA-Seq FAQs

Können alle Eukaryoten eine mRNA-Sequenzierung durchführen?

Eukaryotische mRNA enthält einen Poly-A-Schwanz, und die gängige Methode zur Anreicherung eukaryotischer mRNA besteht darin, mRNA aus totalem RNA mithilfe von magnetischen Perlen, die an Poly-T-Oligos gebunden sind, zu isolieren, gefolgt von der Bibliothekskonstruktion für das Sequenzieren. Daher können theoretisch alle Eukaryoten eine mRNA-Sequenzierung durchlaufen.

Warum erfordert die mRNA-Sequenzierung eine höhere RNA-Integrität als die gesamte Transkriptom-Sequenzierung?

Bei der Konstruktion von mRNA-Sequenzierungsbibliotheken werden RNA-Moleküle mit einem Poly-A-Schwanz mithilfe von magnetischen Perlen erfasst. Wenn die RNA-Integrität schlecht ist und die mRNA teilweise abgebaut wird, was zu einem Verlust des Poly-A-Schwanzes führt, ist die erfasste mRNA aus Proben mit geringerer Integrität reduziert, was zu einer geringeren Genabdeckung führt. Daher ist ein höheres Maß an RNA-Integrität erforderlich.

3. Kann mRNA-Seq nicht-kodierende RNA nachweisen?

mRNA-seq erfasst hauptsächlich RNA-Moleküle mit einem Poly(A)-Schwanz; daher können theoretisch alle in der Zelle exprimierten Moleküle mit einem Poly(A)-Schwanz nachgewiesen werden. Dazu gehören mRNA und lange nicht-kodierende RNAs mit Poly(A)-Schwänzen.

4. Was ist der Unterschied zwischen totalem RNA-Seq und mRNA-Seq?

Gesamt-RNA-Seq, oder die gesamte Transkriptom-Sequenzierung, ist eine umfassende Methode, die die Sequenzierung aller RNA-Spezies nach der Entfernung von ribosomaler RNA (rRNA) umfasst, einschließlich kodierender und nicht-kodierender RNAs. Dazu gehören RNA wie rRNA, prä-mRNA, messenger RNA (mRNA) und eine Vielzahl von nicht-kodierenden RNAs (ncRNA) wie Transfer-RNA (tRNA), Mikro-RNA (miRNA) und lange nicht-kodierende RNA (lncRNA). Im Gegensatz dazu zielt mRNA-Seq speziell auf kodierende Regionen ab, indem es polyadenylierte (poly(A)) RNA anreichert, was es zu einem kostengünstigeren und effizienteren Ansatz für Studien macht, die sich hauptsächlich auf die mRNA-Analyse konzentrieren.

5. Sollten Sie sich für mRNA-Sequenzierung oder totale RNA-Sequenzierung entscheiden?

ist die mRNA-Seq-Methodik die optimale Wahl für Forschungsprojekte, die eukaryotische Organismen betreffen und ein primäres Interesse an kodierenden Regionen haben. Der mRNA-Seq-Ansatz reichert mRNA durch Poly(A)-Selektion an, was die Sequenzierungskosten und die Komplexität reduziert und besonders für Proben mit begrenztem Ausgangsmaterial geeignet ist. Wenn hingegen eine umfassende Analyse erforderlich ist, die alle RNA, einschließlich kodierender und nicht-kodierender RNA-Moleküle, umfasst, total RNA-Seq ist die bevorzugte Option, trotz der höheren Kosten und des größeren Bedarfs an Sequenzierungsdaten. Die Auswahl zwischen den Methoden sollte auf spezifischen experimentellen Zielen, biologischen Fragestellungen, Probenarten und Budgetbeschränkungen basieren.

mRNA-Seq Fallstudien

Molekularer Mechanismus der Differenzierung der Cadmiumtoleranz in Lentinula edodes wie durch mRNA- und miRNA-Analysen offenbart

Zeitschrift: Zeitschrift für gefährliche Materialien
Impactfaktor: 14,224
Veröffentlicht: 15. Oktober 2022

Hintergrund

Cadmium (Cd) ist ein weit verbreitetes giftiges Schwermetall, das in der Lage ist, mehrere Krankheiten im menschlichen Körper zu induzieren, wie Brustkrebs und Nierenkrebs. Mit der raschen Entwicklung industrieller und landwirtschaftlicher Aktivitäten ist die Cadmiumkontamination zu einem ernsthaften globalen Problem geworden. Daher ist es unerlässlich, Cd-kontaminierte Gebiete zu sanieren. Die fungale Sanierung ist eine neuartige und wichtige Wiederherstellungstechnik, doch die molekularen Mechanismen, die den Reaktionen von Pilzen auf Schwermetallstress zugrunde liegen, sind nach wie vor unklar. Diese Studie führte durch Transkriptom-Sequenzierung Um die differenzielle mRNA- und miRNA-Expression zwischen Cd-toleranten (YS119) und Cd-sensiblen (YS45) Pilzen zu analysieren. Die Ergebnisse liefern eine theoretische Grundlage für die weitere Erforschung der molekularen Mechanismen der Cadmiumtoleranz in Pilzen und helfen, die potenziellen Rollen von miRNAs in den Reaktionen von Pilzen auf Schwermetallstress zu erhellen.

Materialien & Methoden

Probenvorbereitung:

Cd-tolerante Pilz YS119
Cd-sensitives Pilz YS45
RNA-Extraktion

Sequenzierung:

mRNA-Sequenzierung
miRNA-seq

Datenanalyse:

PCA und Korrelationsanalyse
DEGs-Analyse
miRNA-Zielgenvorhersage
GO- und KEGG-Analyse
Integrierte Analyse von mRNAs und miRNAs

Ergebnisse

1. mRNA-Sequenzierungsanalyse

Insgesamt wurden 577.586.098 Rohdaten aus allen Proben gewonnen, was nach der Filterung zu 577.165.672 sauberen Daten führte. Die Pearson-Korrelationskoeffizienten und die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den biologischen Replikaten der Proben, was eine weitergehende Analyse ermöglichte (Abbildung 1A, B).

Figure 1 Analysis of Pearson correlation coefficient and PCA. (Shen et al., 2022) Abbildung 1 Pearson-Korrelationskoeffizient und PCA-Analyse.

Unter Cd-Stress zeigte YS45 eine stärkere Reaktion im Vergleich zu YS119, mit 2036 differentially expressed genes (DEGs) in YS45 (1034 hochreguliert, 1002 herunterreguliert) im Vergleich zu 370 DEGs in YS119 (239 hochreguliert, 131 herunterreguliert). GO- und KEGG-Analysen zeigten, dass beide Pilzsorten 170 gemeinsam hochregulierte DEGs hatten, die in 14 GO-Kategorien und einem KEGG-Weg angereichert waren, sowie 107 gemeinsam herunterregulierte DEGs, die in 12 GO-Kategorien und einem KEGG-Weg angereichert waren, was darauf hinweist, dass Gene, die an der Proteinstabilität, der Ionenbindung und der Redoxaktivität beteiligt sind, eine Rolle in der Cd-Stressreaktion spielen. Konkret hatte YS45 863 einzigartig hochregulierte Gene, die in 20 GO-Kategorien und 12 KEGG-Wegen angereichert waren, während YS119 64 einzigartig hochregulierte Gene hatte, die in 11 GO-Kategorien und einem KEGG-Weg angereichert waren.

Zusätzlich wies YS45 890 einzigartig herunterregulierte Gene auf, die in 22 GO-Kategorien und 8 KEGG-Wegen angereichert waren, während YS119 23 einzigartig herunterregulierte Gene in 7 GO-Kategorien ohne KEGG-Weg-Anreicherung hatte. Dies deutet darauf hin, dass die schwere Unterdrückung von Genen, die mit der Umgestaltung der Zellwand, DNA-Reparatur, Zuckerstoffwechsel und Proteolyse unter Cd-Stress in Verbindung stehen, die Cd-Toleranz von YS45 verringern könnte, wobei die differentielle Expression von Genen, die an der Transkriptionsregulation, dem Transport, dem Lipidstoffwechsel, der Metallbindung, dem Glutathionstoffwechsel und der Redox-Homöostase beteiligt sind, zu den Toleranzunterschieden zwischen den beiden Sorten beiträgt.

Figure 2 Analysis of DEGs. (Shen et al., 2022) Abbildung 2 DEGs-Analyse.

2. Integrierte Analyse von mRNA und miRNA

miRNAs regulieren die Genexpression, indem sie ihre Ziel-mRNAs abbauen oder hemmen. In YS45 sind unter 1620 DE miRNA-Zielen 216 DEGs, wobei 111 entgegengesetzte Ausdruckstrends zu den miRNAs zeigen (Abbildung 3A, B). Gene, die potenziell negativ von diesen miRNAs reguliert werden, umfassen solche, die Transkriptionsfaktoren, Transportproteine, Cytochrom P450s, DNA-Reparaturproteine wie MutL, Proteasen, Glutathion-S-Transferasen und carbohydrate-active enzymes (CAZymes) kodieren. In YS119 sind von 525 DE miRNA-Zielen nur 14 DEGs, wobei 3 entgegengesetzte Ausdruckstrends zeigen (Abbildung 3C, D), die Glycosidase, Zellulose-Wachstumsprotein und Retinol-Dehydrogenase kodieren.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass miRNAs die Expression der meisten Zielgene in Pilzen möglicherweise nicht signifikant beeinflussen. Der mRNA-Abbau könnte nicht der primäre regulatorische Mechanismus sein; stattdessen könnten die translationalen Hemmungen und der Wettbewerb mit endogenen RNAs um die Bindung von miRNAs eine Schlüsselrolle spielen.

Figure 3 Integrated mRNA and miRNA analysis. (Shen et al., 2022) Abbildung 3 Integrierte Analyse von mRNA und miRNA.

Fazit

Diese Studie untersucht die bemerkenswerten molekularen Mechanismen, die den Unterschieden in der Cadmium (Cd)-Toleranz zwischen zwei Pilzsorten, YS45 und YS119, zugrunde liegen. Unter Cd-Stress zeigte YS45 eine größere Proteinaggregation im Vergleich zu YS119, was die normalen zellulären Aktivitäten beeinträchtigte und die Cd-Toleranz des Pilzes verringerte. Vergleichende Analysen von mRNA und miRNA zeigten die Beteiligung von Genen oder miRNAs, die mit Zellwandumbau, Transport, Metallchelation, Redox-Homöostase, Signaltransduktion, transkriptioneller Regulation, Lipid- und Kohlenhydratstoffwechsel, Proteinabbau, DNA-Reparatur und Zellzyklusregulation in der Modulation der Cd-Toleranz assoziiert sind. Darüber hinaus bestätigte die Überexpression des LeAmy-Gens seine Rolle bei der Verbesserung der Cd-Toleranz in Pilzen. Die Ergebnisse legen eine theoretische Grundlage für ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen hinter den Unterschieden in der Cd-Toleranz bei Pilzen und unterstützen die Entwicklung von schwermetalltoleranten Pilzkulturen.

Referenz:

Shen N, Xu C, Zhang J, et al. Molekulare Mechanismen der Differenzierung der Cadmiumtoleranz in Lentinula edodes wie durch mRNA- und miRNA-Analysen offenbart. Zeitschrift für gefährliche Materialien, 2022, 440: 129841.