Richtlinien zur Einreichung von Proben
Der vollständige Workflow für eccDNA-Sequenzierung. Durch die Nutzung von Low-Pass-WGS-Technologie ermöglicht dieser Prozess die präzise Extraktion, Bibliothekskonstruktion und bioinformatische Erkennung von extrachromosomalen zirkulären DNA-Ereignissen.Was ist eccDNA-Sequenzierung?
Extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA) bezeichnet zirkuläre doppelsträngige DNA-Moleküle, die unabhängig von den kanonischen Chromosomen existieren. Diese Strukturen reichen in der Größe von mehreren Dutzend Basenpaaren (bp) bis zu Millionen von Basenpaaren (Mb). eccDNA ist ubiquitär in eukaryotischen Organismen vorhanden, einschließlich gesunder menschlicher Gewebe, neoplastischer Läsionen und normaler Blutproben.
Während die genauen molekularen Wege unvollständig charakterisiert sind, postuliert die aktuelle Forschung vier Haupthypothesen: a) Breakage-Fusion-Bridge (BFB) Zyklusmodell, b) Chromothripsis-Modell, c) Translokation-Löschung-Verstärkungsmodell, d) Episom-Modell.
Abb. 1: Mechanismen der eccDNA-Bildung. (Yiheng Zhao et al., 2022)
eccDNA kann verschiedene genetische Komponenten tragen, einschließlich Genfragmenten, nicht-kodierenden repetitiven Sequenzen, Exons, Introns, Promotoren und Enhancern. Durch chimäre Zirkularisierung und Reintegration in das lineare Genom beteiligt sich eccDNA an der genomischen Umgestaltung. Seine facettenreichen Funktionen können die Genexpression entscheidend regulieren, Super-Enhancer bilden, an DNA-Reparaturprozessen teilnehmen und zur Krebsentstehung beitragen.
Die eccDNA-Sequenzierung von CD Genomics ist ein Hochdurchsatzverfahren, das speziell entwickelt wurde, um eccDNA zu identifizieren, zu charakterisieren und zu analysieren, die unabhängig von Chromosomen im Zellkern existieren. eccDNA sind ubiquitär sowohl in gesunden als auch in erkrankten Geweben vorhanden und spielen insbesondere in der Krebsbiologie eine bedeutende Rolle – wie beispielsweise bei der Förderung der Onkogenamplifikation, der Verbesserung der Chromatinzugänglichkeit und der Teilnahme an genregulatorischen Netzwerken. Diese Sequenzierungstechnologie bietet somit einen wesentlichen technologischen Ansatz zur eingehenden Charakterisierung der Struktur, Ursprünge, Funktionen und Krankheitsimplikationen von eccDNA.
eccDNA-Sequenzierungsstrategien
Wir bieten mehrere Strategien für die Sequenzierung von eccDNA basierend auf Ihren Forschungsbedürfnissen an:
eccDNA-Sequenzierungsdienstleistungen Optionen
Wir bieten drei Hauptoptionen für die eccDNA-Sequenzierung an, um verschiedene Forschungsanwendungen zu unterstützen:
eccDNA-Sequenzierung für Gewebe-/Zellproben
A&A spaltenangereichertes eccDNA｜RCA-verstärkte Nachweisempfindlichkeit｜NGS-gestütztes umfassendes Profiling
eccDNA-Sequenzierung für Flüssigbiopsieproben
Tn5-Transposase-optimierter Bibliotheksworkflow｜Ultrasensitive Nachverfolgung von eccDNA｜Originale, mengenbewahrende Quantifizierung｜Probe aus Serum, Plasma, Urin, Liquor cerebrospinalis usw.
eccDNA-Methylierungssequenzierung für Flüssigbiopsieproben
Dual-Funktionsdetektion (eccDNA + Methylierung) | Proben-effizient (Tn5 + enzymatische Umwandlung) | Einzelbasengenauigkeit (Kosten-effektive Auflösung)
Standard-WGS vs. eccDNA-Sequenzierung
| Merkmal | Standard WGS (Tiefe Sequenzierung) | eccDNA-Sequenzierung (Angereicherter Low-Pass) | |
|---|---|---|---|
| Kernprinzip | Sequenzen aller DNA (linear + zirkulär) ohne Unterscheidung. | Bereichert zirkuläre DNA (entfernt lineare DNA) vor der Sequenzierung. | |
| Erkennungsempfindlichkeit | Niedrig. Erkennt nur hochkopierte oder große ecDNAs (z. B. bei Krebs). Verpasst seltene oder MikroDNAs. | Ultra-Hoch. Erkennt Spurenmengen, seltene eccDNAs und microDNAs (<1kb), die durch WGS übersehen werden. | |
| Lineares DNA-Hintergrund | Hoch (>95%). Der Großteil der Daten wird auf linearen Chromosomen verschwendet. | Minimal. Lineares DNA wird enzymatisch entfernt, wodurch die Reads auf eccDNA fokussiert werden. | |
| Daten Effizienz | Niedrig. Erfordert hohe Tiefe (30X-60X, >90Gb), um "zufällig" auf Kreise zu stoßen. | Hoch. Erreicht eine kreisförmige, tiefgehende Abdeckung mit nur 24 Gb (Tiefpass)-Daten. | |
| Breakpoint-Präzision | Mäßig. Schwer, präzise Verbindungen aufgrund von Hintergrundgeräuschen zu identifizieren. | Präzise. Hohe Anreicherung ermöglicht eine klare Identifizierung von "Kopf-zu-Schwanz"-Verbindungen. | |
| Kosten-Effektivität | Teuer für eccDNA-Forschung (Bezahlung für das gesamte Genom). | Kosteneffektiv. Sie zahlen nur für die relevanten zirkulären Daten. | |
| Beste Anwendung | Allgemeine genomische Profilierung (SNVs, Indels) und Erkennung großer CNVs. | Fokussierte eccDNA-Forschung, Entdeckung von Biomarkern und Mechanismusstudien. |
Anwendungen der eccDNA-Sequenzierung
Unsere eccDNA-Sequenzierung hat zahlreiche Anwendungen in verschiedenen Forschungsbereichen:
- KrebsforschungUntersuchen genetischer Veränderungen, die zur Krebsprogression beitragen.
- GenregulationsstudienVerstehen, wie eccDNA die Genexpression und zelluläre Funktionen beeinflusst.
- Infektiöse KrankheitUntersuchen Sie virale Genome oder identifizieren Sie zirkuläre DNA in Krankheitserregern.
- Genetische StörungenIdentifizieren Sie neuartige genetische Faktoren, die zu Krankheiten beitragen.
- Agrarbiologie:Nutzen Sie ingenieurtechnisch hergestelltes eccDNA zur Verbesserung von Pflanzen und zur biotechnologischen Genübertragung.
- EvolutionsbiologieUntersuchen Sie genetische Variationen zwischen verschiedenen Arten.
eccDNA-Sequenzierungsdienst-Workflow
Bei CD Genomics bieten wir einen nahtlosen, durchgängigen eccDNA-Sequenzierungsdienst an, der darauf ausgelegt ist, konsistente, hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Unser standardisierter Arbeitsablauf – von der Probenabgabe bis zur Datenlieferung – ist darauf ausgelegt, die Reproduzierbarkeit zu unterstützen, die Forschung zu optimieren und Entdeckungen in allen Arten von genomischen Studien zu beschleunigen.
Überblick über den Workflow für eccDNA-Sequenzierungsdienste.
eccDNA-Sequenzierung Bioinformatikanalyse
CD Genomics bietet umfassende und flexible Bioinformatikanalyse-Dienstleistungenvon der grundlegenden Datenverarbeitung bis hin zu fortgeschrittenen maßgeschneiderten Analysen. Unsere Lösungen ermöglichen eine eingehende Untersuchung genomischer Variationen und Funktionen.
- Rohdatenerfassung & QualitätskontrolleErwerb von Paar-End-Sequenzierungsdaten vom Sequenzierer, gefolgt von einer ersten Qualitätsbewertung unter Verwendung des Q30-Schwellenwerts.
- DatenvorverarbeitungAdapter-Trimming und Filterung von Low-Quality-Reads wurden mit cutadapt durchgeführt.
- Genom-AusrichtungAusrichtung der verarbeiteten sauberen Reads auf das Referenzgenom (HG38/hg38) unter Verwendung von bwa.
- eccDNA-DetektionErkennung von eccDNA in allen Proben mithilfe von Circle-Map, unter Ausnutzung von Alignmentsignaturen (z. B. diskordante Alignments, soft-clipped Reads), um die Existenz zirkulärer Moleküle und die Positionen der Bruchstellen abzuleiten.
- Zählen von soft-clippten ReadsQuantifizierung von rohen soft-clipped Reads an den Breakpoint-Junktionen mit samtools.
- Differenzielle eccDNA-FilterungNormalisierung über edgeR, gefolgt von der Identifizierung von differentiell exprimierten zirkulären DNA basierend auf p-Wert- und Fold-Change-Schwellenwerten.
- eccDNA-AnnotationGenomische Annotation von zirkulären DNA-Elementen mit bedtools.
- Funktionelle AnreicherungsanalyseGene-Ontologie (GO) Anreicherungsanalyse von Genen, die mit unterschiedlich exprimiertem zirkulärem DNA assoziiert sind.
- Methylierungsanalyse (Optional)Statistische Auswertung der Methylierungslevels von eccDNA.
- Benutzerdefinierte BerichteMaßgeschneiderte Zusammenfassungen, die analysierte Daten in einem klaren, umsetzbaren Format präsentieren.
Musteranforderungen für eccDNA-Sequenzierung
| Sequenzierungstyp | Beispielanforderungen |
|---|---|
| Zellen | 2× 10⁷ Zellen |
| Gewebe | 200 mg |
| DNA | ≥10μg, gelöst in nukleasefreiem H₂O oder TE-Puffer (pH 8,0); 260/280= 1,7–2,0; Abwesenheit von RNA, Kreuzarten- oder Kreuzindividuenkontamination |
| Serum | 5 ml |
| Plasma | 5 ml |
| Urin | 5~10 ml |
| Zerebrospinalflüssigkeit |
|
- Wenn Sie andere Arten von Proben verarbeiten möchten, kontaktieren Sie uns bitte.
Warum CD Genomics für eccDNA-Sequenzierung wählen?
Von fortschrittlichen Sequenzierungsplattformen bis hin zu hochwertiger Datenlieferung bietet CD Genomics eine effiziente, umfassende eccDNA-Lösung, die auf unterschiedliche Forschungsbedürfnisse zugeschnitten ist. Unser Team gewährleistet zuverlässige Ergebnisse mit flexibler Unterstützung.
- ExpertiseÜber 10 Jahre Erfahrung in DNA-Sequenzierung und -Analyse.
- SpitzentechnologieWir verwenden die neuesten Sequenzierungsplattformen und bioinformatischen Werkzeuge.
- Zuverlässige ErgebnisseUnsere strengen Qualitätskontrollen gewährleisten hochgenaue und reproduzierbare Daten.
- Flexibler ServiceUnterstützt alles von einzelnen Proben bis hin zu hochdurchsatzfähiger, paralleler Verarbeitung mehrerer Projekte.
Referenzen:
- Møller, Hans D., et al. "Zirkuläre DNA-Elemente chromosomalen Ursprungs sind in gesundem menschlichen somatischen Gewebe verbreitet." Naturkommunikation 9 (2018): 1069. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03369-8
- Deshpande, Vineet, et al. "Erforschung der Landschaft von fokalen Amplifikationen bei Krebs mit AmpliconArchitect." Naturwissenschaftliche Kommunikation 10 (2019): 392. https://doi.org/10.1038/s41467-018-08200-y
- Mann, Lena, et al. "ECCsplorer: eine Pipeline zur Erkennung von extrachromosomaler zirkulärer DNA (eccDNA) aus Daten der Next-Generation-Sequenzierung." BMC Bioinformatik 23 (2022): 40. https://doi.org/10.1186/s12859-021-04545-2
- Zhao, Yiheng, et al. "Extrachromosomale zirkuläre DNA: Aktueller Stand und zukünftige Perspektiven. eLife 11 (2022): e81412. https://doi.org/10.7554/eLife.81412
- Yang, Zhenzhen, et al. "Extrachromosomale zirkuläre DNA: Biogenese, Struktur, Funktionen und Krankheiten." Signaltransduktion und gezielte Therapie 7 (2022): 342. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00978-7
- Hung, King L., et al. "Koordinierte Vererbung von extrachromosomalen DNAs in Krebszellen." Natur 635 (2024): 201–210. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07861-8
Demo
Analyseergebnisse aus der eccDNA-Sequenzierung, die die Längenverteilung, charakterisierte eccDNA-Merkmale und differenzielle eccDNA-Ereignisse mit genassoziierten und repetitiven Regionen zeigen.
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
- Kann ich FFPE-Proben für die eccDNA-Sequenzierung verwenden?
Ja, aber mit Vorbehalten. FFPE-DNA ist oft fragmentiert, was die Wiedergewinnung und Nachweisempfindlichkeit von eccDNA beeinträchtigen kann, insbesondere bei größeren Zirkeln. Frisch gefrorenes Gewebe wird dringend bevorzugt. Wir optimieren Protokolle für FFPE, aber die Ergebnisse können variieren. Kontaktieren Sie uns, um die Machbarkeit zu besprechen.
- Welche Bioinformatik-Tools verwenden Sie hauptsächlich zur Erkennung von eccDNA?
Wir nutzen eine Kombination aus etablierten Algorithmen (wie Circle-Map, AmpliconArchitect) und proprietären Werkzeugen, die auf Empfindlichkeit und Spezifität optimiert sind. Unser Pipeline konzentriert sich auf Beweise für junctionale Reads und kreisspezifische Mapping-Muster, um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren.
- Hilft CD Genomics bei der nachgelagerten funktionalen Validierung von identifiziertem eccDNA?
Während unser Kerndienstleistung Sequenzierung und Bioinformatik ist, bieten wir auch Validierungsdienste wie FISH, inverse PCR, Droplet Digital PCR und Sanger-Sequenzierung an.
- Wie stellen Sie die Spezifität Ihrer eccDNA-Anreicherung sicher?
Unser optimiertes Protokoll kombiniert ATP-abhängige Exonuklease-Digestion (Abbau von linearem DNA) mit einer säulenbasierten Größenauswahl, die darauf abzielt, zirkuläre DNA-Moleküle anzureichern. Wir führen strenge Qualitätskontrollen durch, um die Anreicherungseffizienz zu bestätigen.
- Kann die Sequenzierung von eccDNA andere strukturelle Variationen (SVs) nachweisen?
Ja, die Analyse identifiziert von Natur aus Bruchstellen und strukturelle Variationen, die innerhalb der eccDNA selbst vorhanden sind. Sie ist jedoch speziell für zirkuläre Strukturen optimiert und erfasst möglicherweise nicht alle linearen SVs im gesamten Genom so effektiv wie eine dedizierte WGS-SV-Erkennung.
Fallstudie: Validierung von eccDNA als diagnostischen Biomarker für das Fortschreiten von kolorektalem Krebs
TitelExtrachromosomale zirkuläre DNA als neuer Biomarker für das Fortschreiten von kolorektalem Krebs
TagebuchMolekulare Medizin
Impact Faktor6.4(2024)
Veröffentlicht2025
DOI10.1186/s10020-025-01164-y
Hintergrund
Die frühzeitige Diagnose von kolorektalem Krebs (CRC) stellt erhebliche Herausforderungen dar. Die Koloskopie ist zwar effektiv, aber invasiv, und Stuhltests auf okkultes Blut (FOBT) weisen oft unzureichende Sensitivität und Spezifität auf. Darüber hinaus haben zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) Flüssigbiopsien Schwierigkeiten mit niedrigen Erfassungsraten, was ihre diagnostische Zuverlässigkeit einschränkt. In diesem Kontext hat sich extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA) als vielversprechender neuer Biomarker herauskristallisiert. eccDNA tritt in den frühen Stadien der Tumorigenese auf, und ihre Häufigkeit korreliert mit dem Fortschreiten von Krebs, was sie zu einem potenziell wertvollen Werkzeug für die frühzeitige CRC-Erkennung macht.
Projektziele
- Charakterisieren Sie die dynamischen eccDNA-Veränderungen während des Fortschreitens von CRC (von gesundem Gewebe über Polypen, Adenome bis hin zu Karzinomen).
- Bewerten Sie das Potenzial von eccDNA als frühen diagnostischen Biomarker für CRC.
Materialien und Methoden
Probenentnahme
- Klinische Proben: Gesunde menschliche intestinale Epithelgewebe (n=5); CRC-Patientengewebe: Polypen (n=17), Adenome (n=14), Tumoren (n=29), angrenzende normale Gewebe (n=5).
- Tiermodelle: AOM/DSS-induzierte Maus-CRC-Modelle zu den Zeitpunkten 0, 5, 8 und 11 Wochen.
Nukleinsäure vorbereiten und sequenzieren
- DNA-Extraktion, lineare DNA-Depletion, Rolling Circle Amplifikation (RCA), DNA-Bibliotheksvorbereitung.
- RNA-Extraktion, RNA-Bibliotheksvorbereitung.
- Sequenzierung auf dem Illumina NovaSeq™ 6000 (PE150).
Bioinformatische Analyse
- Datenfilterung und -ausrichtung.
- Identifizierung, Annotation und Berechnung der Häufigkeit von eccDNA.
- RNA-Seq-Analyse: Differenzielle Expressionsanalyse.
- Korrelation zwischen eccDNA und Genexpression, KEGG/GO-Pfad-Analyse.
Validierungsexperimente
- Breakpoint-spezifische PCR: Validierung von Kandidaten-eccDNA-zirkulären Strukturen.
- Tiermodellvalidierung: Dynamische eccDNA-Veränderungen in AOM/DSS-Mausmodellen.
Wesentliche Erkenntnisse
1.Progressive eccDNA-AkkumulationDie Häufigkeit nimmt mit dem Fortschreiten des kolorektalen Karzinoms zu (Karzinom > Adenom > Polyp > normal).
2.Krebsassoziierte GenübertragungeccDNA enthält Gene, die in tumorigene Signalwege angereichert sind (z. B. Nukleotid-Rettung und EGFR-Signalgebung).
3.HochleistungsdiagnosemodellEin Random-Forest-Klassifikator, der 10 mit eccDNA verwandte Gene (TAFA5/ADA/CRISPLD2) verwendet, erreichte eine AUC von 0,91 zur Unterscheidung von präkanzerösen Läsionen und Tumoren.
4.Bildungsmechanismus73 % der eccDNA-Bruchstellen enthalten direkte oder umgekehrte Wiederholungen (DR/RR-eccDNA), die die Zirkularisierung erleichtern.
Zitierte Abbildungen
Implikationen
- Früherkennungs-PotenzialErhöhte eccDNA-Spiegel in präkanzerösen Stadien unterstützen seine Nützlichkeit als Werkzeug für flüssige Biopsien.
- Technische ÜberlegenheitDie stabile zirkuläre Struktur von eccDNA ermöglicht eine effizientere Anreicherung und Detektion im Vergleich zu ctDNA.
- Klinische ÜbersetzungStiftung für eccDNA-basierte CRC-Screening-Kits (z.B. TAFA5/CRISPLD2-Biomarker).
Referenz:
- Qiu, Quanpeng, Yi Ding, Xiaolong Guo, Jing Han, Jiaqi Zhang, Yaping Liu, Junjun She und Yinnan Chen. "Extrachromosomale zirkuläre DNA als neuer Biomarker für das Fortschreiten von kolorektalem Krebs."Molekulare Medizin 31.123 (2025)." Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder DOI-Nummern abrufen oder übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.
