Einzelzell-Sequenzierung

Die proprietäre GenSeqTM-Technologie von CD Genomics bietet umfassende Einzelzell-Sequenzierungsdienste. Diese globalen Genexpressionsmuster in Einzelzellen haben die Zellbiologie bereits dramatisch vorangebracht.

Was ist die Einzelzell-Sequenzierung?

Die Einzelzellsequenzierung stellt einen bedeutenden Fortschritt in unserem Verständnis von zellulärer Heterogenität und biologischen Prozessen dar. Diese ausgeklügelte Technologie ermöglicht die Untersuchung von Genomen, Transkriptomen, Epigenomen und Proteomen auf Einzelzellebene und liefert damit unvergleichliche Einblicke in zelluläre Funktionen und Interaktionen. Im Gegensatz zur herkömmlichen Bulk-Sequenzierung, die durchschnittliche Daten aus einer Mischung von Zellen liefert, offenbart die Einzelzellsequenzierung die einzigartigen molekularen Signaturen einzelner Zellen und enthüllt so die komplexe Vielfalt und Diversität, die in Geweben und Organismen vorhanden ist.

Warum Einzelzell-Sequenzierung durchführen

Das Transkriptom als Beispiel nehmend, traditionelle Bulk- RNA-Sequenzierung (Bulk-RNA-Seq) umfasst das Extrahieren und Sequenzieren der gemischten RNA aus Geweben, Organen oder Zellclustern, was durchschnittliche transkriptomische Daten für diese Zellpopulationen liefert. Zum Beispiel kann man mit Bulk-RNA-Seq unterschiedliche Genexpressionen zwischen Tumor- und benachbarten Nicht-Tumorgeweben identifizieren und Variationen in Onkogenen und Tumorsuppressorgenen feststellen. Innerhalb eines Tumors gibt es jedoch genetische und transkriptomische Variationen zwischen Zellen, die sich im Tumorkern, an der Peripherie, in lymphatischen Metastasen und in distalen Metastasen befinden. Diese Unterschiede können eine entscheidende Rolle bei der Invasion von Krebszellen, der Metastasierung und der Entwicklung von Arzneimittelresistenz spielen, was wiederum die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen beeinflusst.

Im Gegensatz dazu ermöglicht die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) die Untersuchung der Tumorheterogenität auf der Ebene einzelner Zellen. Diese Technik erleichtert das Studium der klonalen Evolution und Entwicklung von Krebszellen, der frühen Krebsinvasion, der Mutationsraten und -typen in Krebszellen, der Verfolgung von Metastasen und der Verbreitung, der Charakterisierung des Tumormikroenvironment und des Verständnisses der Evolution der Arzneimittelresistenz während der Krebsbehandlung.

Methoden für die Einzelzell-Sequenzierung

Frühe Ansätze zur Einzelzellsequenzierung beinhalteten die Isolierung einzelner Zellen, gefolgt von einer Bibliotheksvorbereitung mit niedrigem Input und Sequenzierung. Methoden zur Isolierung einzelner Zellen umfassten Techniken wie begrenzte Verdünnung, Durchflusszytometrie, Laser-Capture-Mikrodissektion und Mikromanipulation. Obwohl diese Methoden in der Lage sind, Einzelzellen zu isolieren, sind sie oft komplex, zeitaufwendig, kostspielig und haben eine geringe Durchsatzrate, was ihre weitreichende Anwendung im großen Maßstab behindert.

Wie man eine hochdurchsatzfähige Einzelzell-Erfassung erreicht

Zeitgenössische Strategien verwenden hauptsächlich DNA-Barcoding, um die Identifizierung einzelner Zellen zu erleichtern. Jede Zelle wird mit einer einzigartigen Barcode-Sequenz markiert, die den Aufbau einer gepoolten Bibliothek und die anschließende Differenzierung von Nukleinsäuren, die aus verschiedenen Zellen stammen, basierend auf ihrem Barcode ermöglicht. Dieser Ansatz erlaubt die gleichzeitige Analyse von Hunderten bis Tausenden einzelner Zellen mit einer einzigen Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung.

Hier besprechen wir zwei herausragende Techniken, die dieses Prinzip für die Einzelzell-Sequenzierung nutzen:

Mikroplattenbasierte Einzelzell-Sequenzierung:

Die zugrunde liegende Methode besteht darin, die Konzentration der Zellaufhängung zu steuern, um dissociated Zellen in einzelne Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zu verteilen. Sobald die Zellen am Boden sedimentieren, werden magnetische Perlen zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Diese Perlen sind mit Read1-Sequenzen, Barcodes, molekularen Barcodes und Fangsequenzen vorbeladen. In jeder Vertiefung durchlaufen Einzelzellen eine Lyse, wobei ihre Nukleinsäuren freigesetzt werden, die dann von den magnetischen Perlen eingefangen werden. Die Perlen werden anschließend für den Bibliotheksaufbau und die Sequenzierung zusammengeführt. Bemerkenswerte Methoden, die diese Technik verwenden, sind BD Rhapsody und Singleron.

2. Mikrotropfenbasierte Einzelzell-Sequenzierung:

Diese Technik beginnt mit der Dissoziation von Gewebe, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Mithilfe von Mikrofluidik-Chips werden Zellen und Fangperlen in Tropfen verkapselt, indem die Unmischbarkeit von Öl- und Wasserphasen ausgenutzt wird. Die Fangperlen innerhalb dieser Tropfen sind mit Read1-Sequenzen, Barcodes, molekularen Barcodes und Fangsequenzen ausgestattet. Innerhalb jedes Tropfens werden einzelne Zellen lysiert, ihre Nukleinsäuren freigesetzt und von den Perlen eingefangen. Diese Perlen werden dann für die Bibliotheksvorbereitung und anschließende Sequenzierung zusammengeführt. Aktuelle Methoden, die diese Strategie verwenden, umfassen Drop-seq, inDrop und 10× Genomics.

3. 10× Genomics Einzelzell-Lösungen:

10× Genomics dominiert den Markt für Einzelzellen und bietet eine Vielzahl von Produkten an, die Einzelzell-Transkriptomik (scRNA-seq), Einzelzell-Immunprofiling (siRNA-seq), Einzelzell-Chromatinzugänglichkeit (snATAC-seq), Multi-Omics (snRNA+ATAC) und Oberflächenproteinprofiling (scCITE-seq) auf Einzelzellebene erleichtern.

Unsere Einzelzell-Sequenzierungsdienste

Wir nutzen fortschrittliche Einzelzell-Sequenzierungstechnologien wie 10x Genomics Chromium, um umfassende Lösungen für das Profiling einzelner Zellen, die Analyse von Tumorheterogenität und das Studium von Entwicklungsprozessen bereitzustellen. Unser Expertenteam gewährleistet präzise und zuverlässige Ergebnisse durch sorgfältige Qualitätskontrolle.

• Einzelzell-RNA-Sequenzierung

  • scRNA-Sequenzierung erfasst die Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen und bietet ein klares Bild davon, wie jede Zelle zur Funktion eines Gewebes beiträgt. Sie ist besonders wertvoll für die Identifizierung seltener Zelltypen und das Verständnis der Nuancen des Zellverhaltens innerhalb komplexer biologischer Systeme.

• Einzelzell-DNA-Sequenzierung

  • Dieses Verfahren untersucht die genetische Zusammensetzung einzelner Zellen und deckt spezifische Variationen und Mutationen mit hoher Präzision auf. Es liefert entscheidende Einblicke in die genetische Vielfalt von Tumoren und hilft dabei, genetische Abnormalitäten zu identifizieren, die mit verschiedenen Krankheiten verbunden sind.

• Einzelzell-DNA-Methylierungs-Sequenzierung

  • Durch die Analyse von DNA-Methylierungsmustern auf Einzelzellebene zeigt dieser Ansatz, wie epigenetische Modifikationen die Genexpression beeinflussen und die Zellidentität aufrechterhalten. Er ist entscheidend für das Studium der Rolle der Epigenetik in der Entwicklung und Krankheit.

• 10x Genomics Einzelzell-Sequenzierung

  • Durch den Einsatz modernster mikrofluidischer Technologie und Barcode-Systeme liefert 10x Genomics umfassende Einzelzell-Daten. Diese Plattform zeichnet sich durch detaillierte Einblicke in transkriptomische, genomische und epigenomische Landschaften aus und verbessert unser Verständnis von zellulärer Vielfalt und komplexen biologischen Interaktionen.

Vorteile der Einzelzell-Sequenzierung

• Umfassender ArbeitsablaufEin vollständiger, durchgängiger Prozess, der für die gesamte Transkriptomanalyse einzelner Zellen entwickelt wurde.
• Maximaler DurchsatzErmöglicht die parallele Verarbeitung von bis zu 96 Einzelzellen pro Durchlauf, ein beispielloser Maßstab.
• Benutzerfreundlich: Erfordert weniger als drei Stunden praktische Zeit. Die direkte Verarbeitung von Einzelzellen ist möglich, ohne dass Schritte zur RNA-Zersetzung und -Reinigung erforderlich sind.
• KostenwirksamBietet eine erhebliche Kostenreduzierung und kostet nur ein Achtel des Preises anderer derzeit auf dem Markt erhältlicher Bibliotheksvorbereitungssysteme.
• SpitzentechnologieWir setzen die neuesten Einzelzell-Sequenzierungsplattformen ein, einschließlich 10x Genomics, um präzise und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten.
• Expertenunterstützung in BioinformatikUnser Bioinformatik-Team bietet robuste Datenanalysen und liefert Einblicke in zelluläre Heterogenität, Linienverfolgung und Dynamik der Genexpression.
• Anpassbare LösungenWir bieten maßgeschneiderte Lösungen, um die spezifischen Anforderungen Ihrer Forschung zu erfüllen, von der Versuchsplanung bis zur Dateninterpretation.

Anwendungen der Einzelzellsequenzierung

• Profilierung seltener klinischer Proben
• Messung der intratumoralen Heterogenität und Anleitung zur Chemotherapie
• Analyse der Evolution von Krebszellen während der Tumorprogression
• Präimplantationsdiagnostik (PID)
• Untersuchung der Vielfalt der Immunzellen
• Entwirrung der Entwicklungsbiologie
• Studium neurologischer Störungen
• Erforschung mikrobieller Ökosysteme

Einzelzell-Sequenzierungs-Workflow

Die Einführung der Durchflusszytometrie und der Laser-Capture-Mikrodissektion hat es ermöglicht, Einzelzellen zu erfassen, und die DNA oder RNA von Einzelzellen wurde für die Einzelzell-Sequenzierung amplifiziert. Der allgemeine Arbeitsablauf für die Einzelzell-Sequenzierung ist unten skizziert.

Musteranforderungen

Im Folgenden finden Sie die Musteranforderungen für einige unserer Einzelzell-Sequenzierungsdienste. Für detailliertere Informationen besuchen Sie bitte die spezifischen Dienstleistungsseiten oder die Richtlinien zur Probenübermittlung. Wenn Sie an unseren Dienstleistungen interessiert sind, kontaktieren Sie uns bitte, um die Anforderungen für Sequenzierungsproben zu bestätigen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in der Einzelzell-Sequenzierung für Ihr Schreiben (Anpassung)

Die Konferenz zur Einzelzellsequenzierung von CD Genomics untersucht die Zusammenhänge zwischen der zellulären Vielfalt in Geweben und der Funktionalität von Organen und beleuchtet die zugrunde liegenden Ursachen verschiedener Krankheiten. Bei weiteren Anfragen oder Wünschen zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

1. Das Prinzip, die Vorteile und Nachteile der Einzelzellgenomamplifikation.

i. MDA (Multiple Displacement Amplifikation)

Erfunden von Laskin et al. im Jahr 2001. Reagiert mit zufälligen sechs Polymer-Primer und φ29 DNA-Polymerase, die starke Kettenersatz-Eigenschaften aufweist und das DNA-Fragment von 50~100kb unter isothermen Bedingungen amplifizieren kann. Gleichzeitig hat die φ29 DNA-Polymerase aufgrund ihrer 3'-5' Exonukleaseaktivität und Korrekturleseaktivität eine hohe Genauigkeit. Die MDA-Methode bietet eine höhere Genomabdeckung.

ii. MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

Der quasilineare Amplifikationsprozess reduziert die Sequenzpräferenz der exponentiellen Amplifikation. Die 5'-Enden der amplifizierten Primer enthalten die gemeinsame Sequenz von 27 bp, und das 3'-Ende ist eine zufällige Sequenz von 8 bp, die bei niedrigen Temperaturen von 15 bis 20 °C mit der Vorlage kombiniert werden kann. Anschließend werden diese ringförmigen Amplicons nach der quasilinearen Amplifikation in 8 bis 12 Zyklen amplifiziert.

Der Vorteil der MALBAC-Methode besteht darin, dass die Sequenzpräferenz zwischen verschiedenen Zellen wiederholbar ist. Aufgrund ihrer besseren Homogenität der Amplifikation sind die Daten besser für die CNV-Analyse geeignet. Die Schwäche von MALBAC ist, dass die Genauigkeit der verwendeten Polymerase nicht so gut ist wie die von φ29-DNA-Polymerase, sodass MALBAC bei der Erkennung von SNVs mehr falsch-positive Ergebnisse liefert; außerdem geht aufgrund der wiederholbaren Sequenzpräferenz manchmal der Bereich mit geringer Amplifikation im Genom während des Amplifikationsprozesses verloren.

2. Probenanforderungen für die Einzelzell-Sequenzierung.

MDA-Verstärkung: Das Probenvolumen darf 2 μL nicht überschreiten. Das PCR-Röhrchen, das das Unternehmen bereitstellt, enthält 2 μL PBS. MALBAC-Verstärkung: Das Probenvolumen darf 1 μL nicht überschreiten. Stellen Sie sicher, dass die Proben frei von Ca2+ und Mg2+ sind; das Unternehmen stellt ein Röhrchen mit 4 μL Lysat zur Verfügung. Proben sollten möglichst unabhängig voneinander getrennt werden, um Zelladhäsion und Zellfragmente zu vermeiden, die die Qualität der Verstärkung beeinträchtigen könnten.

Einzelzellanalyse der zellulären Heterogenität und Interaktionen im verletzten Rückenmark von Mäusen

Zeitschrift: Zeitschrift für Experimentelle Medizin

Impact-Faktor: 12,6

Veröffentlicht: 16. Juni 2021

Hintergrund

Bei Rückenmarksverletzungen (SCI) treiben verschiedene Glia- und Gefäßzellen sowie infiltrierende Leukozyten den komplexen Wundheilungsprozess voran. Zu den Schlüsselphasen gehören eine frühe Immunantwort, ein Höhepunkt der glialen Proliferation sowie anschließende Fibrose und Gliosis. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet detaillierte Einblicke in Zelltypen und deren Interaktionen und verbessert unser Verständnis von SCI und anderen Verletzungen des zentralen Nervensystems.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

Die Autoren führten eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung an Proben von Rückenmarksverletzungen (SCI) durch, um die zelluläre Vielfalt zu analysieren. Dabei wurden 66.178 Zellen und 15 verschiedene Zelltypen identifiziert, darunter Immun-, Gefäß- und Gliazellen. Es wurden einzigartige molekulare Signaturen und verletzungsabhängige Genveränderungen beobachtet, die Einblicke in spezifische Zellreaktionen und potenzielle Biomarker bieten.

Abb. 1. Transkriptomische Identifizierung der Hauptzelltypen, die die Kontusionsstelle des mittleren thorakalen Rückenmarks der Maus zu akuten Zeitpunkten bilden.

Die Analyse ergab 12 myeloide Zellsubtypen, darunter vier Mikroglia- und zwei Makrophagentypen, mit signifikanten zeitlichen Veränderungen nach einer Rückenmarksverletzung (SCI). Mikroglia wechselten von einem homöostatischen in einen entzündlichen Zustand, während Makrophagen von chemotaxis-induzierenden zu entzündlichen Subtypen übergingen. Diese Ergebnisse wurden sowohl durch Immunhistochemie als auch durch Durchflusszytometrie bestätigt.

Abb. 2. Transkriptomische Identifizierung der wichtigsten myeloischen Subtypen akut nach SCI.

Die Analyse ergab neun Makroglia-Cluster mit unterschiedlichen Veränderungen nach der Verletzung. Astroependymale Zellen erreichten ihren Höhepunkt am 1. Tag nach der Verletzung (dpi) und nahmen dann ab, während Zellen der Oligodendrozytenlinie von OPCs zu reifen Formen übergingen. OPCs und Astrozyten reagieren zunächst ähnlich, entwickeln jedoch bis zum 7. dpi einzigartige Funktionen, wobei OPCs auch eine Rolle in der glialen Narbe spielen.

Abb. 3. Molekularer und zeitlicher Verlauf der Makroglialen Heterogenität akut nach Rückenmarksverletzung (SCI).

Fazit

Diese Studie verwendet Einzelzell-Transkriptomik, um Zelltypen und deren Rollen am Ort der Rückenmarksverletzung zu kartieren. Sie zeigt verschiedene Phasen des Verhaltens myeloider Zellen, einschließlich Entzündung und Migration, und identifiziert die Schlüsselrollen von Astrozyten und Spitzenzellen bei der vaskulären Umgestaltung. Trotz einiger Einschränkungen in der Genauigkeit der Zellrückgewinnung bietet die Daten neue Einblicke in zelluläre Interaktionen und Prozesse bei Rückenmarksverletzungen.

Referenz

1. Milich LM, Choi JS, Ryan C, et al. Einzelzellanalyse der zellulären Heterogenität und Interaktionen im verletzten Rückenmark von Mäusen. Journal für Experimentelle Medizin. 2021, 218(8):e20210040.