Hochwertige TCR-Seq und BCR-Seq zur Profilierung des Immunspektrums

Häufige Darstellungen von TCR-bezogenen Daten. (Frank et al., 2023)

Wofür wird TCR-Sequenzierung verwendet?

Die TCR-Sequenzierung stellt einen entscheidenden technischen Ansatz zur Untersuchung der Diversität und klonalen Zusammensetzung von T-Zell-Rezeptoren (TCRs) sowie ihrer Funktionen während immunologischer Reaktionen und Krankheitsprozesse dar. Sie bietet ein effektives Werkzeug zur Überwachung des Status und der Funktion von T-Zellen bei Transplantatabstoßung, Infektionen und immunsuppressiver Therapie. Durch die Analyse der TCR-Repertoires im peripheren Blut oder Gewebe eines Patienten kann unser Verständnis der Wiederherstellung der Immunfunktion und des Krankheitsverlaufs erheblich verbessert werden.

Die TCR-Sequenzierung ermöglicht ein tieferes Verständnis der T-Zell-Reifung, -Differenzierung und -Funktion. Sie erlaubt es, die genetischen und epigenetischen Regulationsmechanismen der TCRs sowie deren Interaktionen mit anderen Immunzellen und Signalwegen zu enthüllen, indem die TCR-Diversität und die klonale Infrastruktur untersucht werden.

In Tumor Immuntherapie, Analyse der TCR-Zusammensetzung von Tumor Infiltrierende Lymphozyten (TILs) können dabei helfen, die potenzielle Reaktion eines Patienten auf die Immuntherapie zu bewerten. Darüber hinaus könnte die Analyse der T-Zell-TCR-Zusammensetzung eines Patienten bei Autoimmunerkrankungen dazu dienen, abnormale Immunantworten und klonale Proliferation aufzudecken.

Durch die Untersuchung der T-Zell-TCR-Zusammensetzung ist es möglich, wahrscheinliche Biomarker für die therapeutische Reaktion zu identifizieren und die pharmakodynamischen Auswirkungen von Behandlungen auf das Immunsystem weiter zu bewerten.

Wie wählt man Materialien für die TCR-Sequenzierungsforschung aus?

Die Methodik für TCR-Seq lässt sich in zwei herausragende Kategorien unterteilen, basierend auf dem verwendeten Ausgangsmaterial: DNA und RNA. DNA-basierte Methoden zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, einzelne TCR-Klone präzise zu quantifizieren, da jede Zelle eine einzigartige Vorlage enthält. Diese Einzigartigkeit könnte jedoch potenziell zu einem Anstieg der Gesamtkosten für TCR-Seq beitragen. Auf der anderen Seite bieten RNA-basierte Methoden ein hohes Maß an Sensitivität, das eine quantitative Schätzung sowohl der TCR-Häufigkeit als auch der Genexpression ermöglicht. Darüber hinaus können RNA-basierte Methoden leicht mit molekularen Barcodes kombiniert werden, um PCR-Bias zu reduzieren und die Genauigkeit der Identifizierung seltener Varianten zu verbessern.

Was sind die Vor- und Nachteile von zwei Strategien zur Konstruktion von TCR-Bibliotheken?

Die primären Methoden für die Sequenzierung des T-Zell-Rezeptors (TCR) sind Multiplex-PCR (mPCR) und 5' Rapid Amplification of cDNA Ends (5'RACE). mPCR, das sowohl DNA- als auch RNA-Initiierung unterstützt, umfasst normalerweise zwei Runden der PCR. Die erste Runde zielt darauf ab, das Rezeptorgenlokus zu amplifizieren und beinhaltet bekannte Sequenzen für die Primerstellen der zweiten Runde der PCR, wobei anschließend Sequenzierungsadapter und Indizes integriert werden. Die hohe Diversität an Primerstellen der Überlappungsstellen in der ersten Runde der PCR erfordert jedoch eine große Anzahl degenerierter Primer, was zu PCR-Bias führen kann.

Die 5'RACE-Technik hingegen verwendet RNA als Vorlage und benötigt nur ein Primerpaar pro PCR-Runde. Dies reduziert die PCR-Bias erheblich und stellt sicher, dass die Ergebnisse die authentischen Bedingungen der Proben genau widerspiegeln.

Was ist der Unterschied zwischen TCR und BCR?

T-Zell-Rezeptoren (TCR) und B-Zell-Rezeptoren (BZR) repräsentieren unterschiedliche Klassen von Immunrezeptoren, die erhebliche Unterschiede in Funktion und Struktur aufweisen. Wie ihre Namen schon andeuten, sind diese Rezeptoren auf den Oberflächen verschiedener Zelltypen vorhanden. Der TCR, ein relativ einfaches Konstrukt, besteht nur aus zwei Ketten, während der BCR besteht aus vier Ketten. Eine grundlegende Funktion des TCR besteht darin, Antigenpeptide zu erkennen, die spezifisch auf der Zelloberfläche präsentiert werden, typischerweise von Molekülen des Hauptgewebekompatibilitätskomplexes (MHC). Im Gegensatz dazu besteht die Hauptaufgabe des BCR darin, Antigenmoleküle zu identifizieren, die frei in einer Lösung schwimmen, einschließlich einer Vielzahl von molekularen Entitäten wie Proteinen, Polysacchariden und anderen.

Die durch TCRs vermittelte Immunantwort betrifft hauptsächlich die zellvermittelte Immunität, die die Erkennung und Beseitigung von infektiösen Mikroorganismen und Tumorzellen umfasst. Andererseits beziehen sich die durch BCRs vermittelten Immunantworten hauptsächlich auf die humorale Immunität, die die Bildung von Antikörpern sowie die Neutralisierung und Beseitigung von Antigenen umfasst. TCRs, die hauptsächlich auf T-Zellen im lymphatischen Gewebe exprimiert werden, tragen zur Modulation der zellulären Immunantworten bei. Im Gegensatz dazu sind die BCRs, die überwiegend auf B-Zellen exprimiert werden, an den humoralen Immunantworten beteiligt.

Die T-Zell-Rezeptor-Sequenzierung zeigt die immunologischen Merkmale des hepatozellulären Karzinoms entsprechend den Stadien des Barcelona Clinic Liver Cancer innerhalb des Lebergewebes und des peripheren Blutes.

Journal: Krebsforschung
Impactfaktor: 5,7
Veröffentlicht: 14. November 2023

Hintergründe

T-Lymphozyten, die die Moleküle des Hauptgewebekompatibilitätskomplexes (MHC) über den T-Zell-Rezeptor (TCR) auf ihrer Zelloberfläche erkennen, sind integraler Bestandteil der menschlichen adaptiven Immunantwort. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) rangiert weltweit an vierter Stelle in Bezug auf die krebsbedingte Sterblichkeit. Das immunologische Mikroumfeld des HCC umfasst verschiedene funktionale Subgruppen von T-Lymphozyten. Derzeit sind die klonalen Merkmale und die Vielfalt der TCRs in verschiedenen Stadien des HCC weitgehend unerforscht. Die neuesten Forschungsergebnisse, veröffentlicht in Cancer Science von dem Team unter der Leitung von Professor Wang Yijin an der Southern University of Science and Technology, zielen darauf ab, die immunologischen Merkmale von T-Zellen zu untersuchen, die aus verschiedenen Geweben in verschiedenen Stadien des HCC stammen. Diese Forschung wird dazu beitragen, die Mechanismen der HCC-Progression zu erhellen und den Weg für die Entwicklung von zellbasierten therapeutischen Methoden zu ebnen, die auf spezifische Neoantigene abzielen.

Methoden

Ergebnisse

1. Interpatient-Heterogenitätsanalyse von CDR3-Sequenzen

Diese Studie untersuchte gemeinsame CDR3-Sequenzen über alle Probenarten von 25 HCC-Patienten. Der Prozentsatz der gemeinsamen CDR3-Sequenzen zwischen benachbarten Geweben und Tumorgeweben betrug 4,3 %, und zwischen PBMCs und Tumorgeweben 1,5 %. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den gemeinsamen CDR3-Sequenzen zwischen benachbarten Geweben und Tumorgeweben oder zwischen PBMCs und Tumorgeweben in allen drei Stadien beobachtet. Während die gemeinsamen TCR-Klonotypen in benachbarten Geweben und PBMCs begrenzt waren, gab es in den Tumorgeweben des BCLC_C-Stadiums mehr gemeinsame TCR-Klonotypen im Vergleich zu den Stadien BCLC_A und BCLC_B. Die TCR-Ähnlichkeit wurde mit dem Jaccard-Index bewertet, der eine höhere Ähnlichkeit in Tumoren im Vergleich zu benachbarten Geweben, jedoch ähnlich zu PBMCs zeigte. Patienten im BCLC_C-Stadium wiesen eine erhöhte TCR-Ähnlichkeit über alle Probenarten auf. Der Morisita-Überlappungsindex wurde verwendet, um überlappende Klonotypen quantitativ zu bewerten, was auf einen höheren Grad an Überlappung bei Patienten im BCLC_C-Stadium im Vergleich zu den Stadien BCLC_A und BCLC_B hinwies, obwohl dies nicht statistisch signifikant war.

Abbildung 1. Analyse der Interpatienten-Heterogenität von CDR3-Sequenzen

2. Vielfalt und Klonalität von CDR3-Sequenzen

Die Studie untersuchte die Expression von V- und J-Gensegmenten und konzentrierte sich auf CDR3-Sequenzen, um die TCR-Diversität und Klonalität in verschiedenen Stadien des HCC zu bewerten. Es wurden hoch exprimierte Gensegmente identifiziert und die Häufigkeit der 100 häufigsten CDR3-Sequenzen in Tumorgeweben und PBMC-Proben über die Stadien hinweg analysiert, was auf eine höhere TCR-Klonalität im fortgeschrittenen HCC hinweist. Darüber hinaus zeigten detaillierte Analysen der Häufigkeitsverteilungen von CDR3 und der Klonfraktionen eine verringerte Diversität und erhöhte Klonalität in den fortgeschrittenen HCC-Stadien, unterstützt durch verschiedene quantitative Maße. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf einen allmählichen Rückgang der T-Zell-Diversität mit der Progression des HCC in PBMCs hin.

Abbildung 2. Quantifizierungsanalyse von CDR3-Sequenzen in den BCLC_A–C-Stadien in Tumoren, benachbarten Geweben und peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMCs)

3. CDR3-Länge und Aminosäurezusammensetzung

Aberrationen in der Länge und Zusammensetzung der komplementaritätsbestimmenden Region 3 (CDR3) können die adaptive Immunantwort eines Patienten erheblich beeinflussen. In allen drei Stadien - innerhalb des Tumors, in benachbarten Geweben und in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) - wurde kein signifikanter Unterschied in der Verteilung der CDR3-Längen beobachtet. Die Analyse ergab eine geringere Anreicherung von hydrophoben Aminosäuren an den Positionen 6 und 7 bei Patienten mit fortgeschrittenem hepatozellulärem Karzinom (HCC), was auf eine Beeinträchtigung der Entwicklung und Funktion von autoreaktiven T-Zellen hinweist.

Abbildung 3. Analyse der CDR3-Länge und der Aminosäurezusammensetzung.

4. Vergleich der TCR-Repertoires zwischen rückfälligen und nicht rückfälligen Patienten

Mit der Kaplan-Meier-Methode wurde das Gesamtüberleben (OS) für die Patientengruppen BCLC_B und BCLC_C berechnet. Das mediane OS betrug 13,0 Monate (95% CI 10,1–15,9) für das BCLC_B-Stadium und 5,5 Monate (95% CI 3,2–6,8) für das BCLC_C-Stadium. Die Analyse des Hazard Ratios zeigte deutliche prognostische Unterschiede zwischen den verschiedenen BCLC-Stadien, wobei niedrigere Risikoquoten für Patienten im BCLC_C-Stadium im Vergleich zu Patienten im BCLC_A- und BCLC_B-Stadium erkennbar waren. Weitere Analysen identifizierten eine Korrelation zwischen einer höheren Häufigkeit der Top 100 CDR3 und einer verbesserten Prognose. Unter den Patienten mit Rezidiv wiesen diejenigen mit dem Tumor und PBMC eine größere TCR-Diversität im Vergleich zu nicht-rezidivierenden Patienten auf, während die Häufigkeit hydrophober Aminosäuren bei rezidivierenden Patienten geringer war.

Abbildung 4 (A) Differenzanalyse der TCR-Repertoires bei rückfälligen und nicht rückfälligen Patienten. (B) Überlappung der CDR3-Sequenzen zwischen rückfälligen und nicht rückfälligen Patienten. (C) TCR-Sequenzierungsdaten zeigten die 100 häufigsten CDR3-Sequenzen. (D) Visualisierung der Klonanteile, die von den CDR3-Sequenzen belegt werden.

5. Analyse des TCR-Repertoires bei einem Patienten mit rezidiviertem Tumor

Die TCR-Sequenzierung, die an dem ursprünglichen Tumor eines wiederkehrenden Patienten (T1), neu entwickelten Tumoren (T2 und T3) sowie PBMCs (P1 und P2) durchgeführt wurde, zeigte einen hohen Grad an TCR-Klon-Überlappung in PBMCs, was möglicherweise auf eine Fülle der CATSDPSTGTTGELFF CDR3-Sequenz zurückzuführen ist. Klonale Indizes wiesen auf eine höhere Klonalität in P1 als in P2 hin und in T1 mehr als in T2 und T3, trotz statistisch insignifikanter Unterschiede. Die Rekombination von TRBV- und TRBJ-Genen zeigte eine erhöhte Ähnlichkeit zwischen T1, T2 und T3, was auf potenziell erhebliche Variationen in den TCR-Repertoires zwischen primären und wiederkehrenden Tumoren hindeutet.

Abbildung 5. Klonalitäts- und Diversitätsanalyse bei rückfälligen und nicht rückfälligen Patienten. Gruppe

Fazit

Die Forschung erläutert die unterschiedlichen Merkmale von T-Zell-Rezeptor (TCR)-Sequenzen in verschiedenen Geweben – einschließlich Tumorgeweben, angrenzenden nicht-tumorösen Geweben und peripheren Blutmononukleären Zellen (PBMCs) – in verschiedenen Stadien des Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) Staging-Systems. Eine systematische longitudinale Analyse unterschiedlicher zeitlicher Stadien, kombiniert mit einer Querschnittsanalyse über verschiedene Proben, zeigt die sich verändernde Landschaft der TCR-Eigenschaften während des Fortschreitens des hepatozellulären Karzinoms (HCC). Besonders bemerkenswert ist, dass die TCR-Klonalität in peripheren Blut-T-Zellen im Stadium BCLC_C im Vergleich zu früheren Stadien signifikant ansteigt, während die Diversität deutlich verringert ist. Dies deutet darauf hin, dass PBMCs eine aufschlussreichere Abgrenzung der TCR-Eigenschaften über unterschiedliche Tumorstadien bei HCC-Patienten bieten können, im Vergleich zu Tumorgeweben. Wir haben eine klare Beziehung zwischen TCR-Eigenschaften und der Prognose von HCC umrissen; Patienten mit erhöhter TCR-Klonalität haben ein geringeres Risiko für ein Tumorrezidiv, was zu einer verbesserten Prognose führt. Wir spekulieren, dass das Niveau der TCR-Klonalität in Geweben im Frühstadium ein wertvoller prädiktiver Marker für post-operative Rezidive bei Patienten sein könnte.

Referenz:

1. Li R, Wang J, Li X, et al. Die Sequenzierung von T-Zell-Rezeptoren zeigt die immunologischen Merkmale des hepatozellulären Karzinoms entsprechend den Stadien des Barcelona Clinic Liver Cancer innerhalb des Lebergewebes und des peripheren Blutes. Krebsforschung, 2024, 115(1): 94-108.