Was ist die Sequenzierung des B-Zell-Rezeptor-Repertoires?

Was ist BCR-seq?

Die B-Zell-Rezeptor-Sequenzierung (BCR-seq) stellt eine fortschrittliche und schnelle Methode zur umfassenden Erkennung von zielamplifizierten B-Zell-Rezeptoren (BCRs) dar, die durch die Integration von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie und Bioinformatik ermöglicht wird. Durch die Analyse der Häufigkeit jeder Sequenz enthüllt BCR-seq die Komplexität der von B-Zellen vermittelten humoralen Immunantworten und die dynamische Vielfalt der Veränderungen von Immunglobulinen. Diese hochmoderne Technologie ermöglicht eine gründliche Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen, die das Vermögen des Immunsystems steuern, zu reagieren und sich anzupassen, und eröffnet neue Wege für ein tieferes Verständnis der Dynamik des Immunsystems.

CD Genomics bietet auch einen TCR-Sequenzierungsdienst basierend auf der Next-Generation-Sequenzierung und der Langlesesequenzierung an.

BCR-Struktur

Der B-Zell-Rezeptor (BCR) fungiert als membranständiges Immunglobulin (Smlg) und spielt eine zentrale Rolle bei der Antigen-Erkennung durch B-Zellen. Strukturell ist der BCR ein Tetramer, der aus zwei schweren Ketten (H) und zwei leichten Ketten (L) besteht, wobei die leichte Kette entweder κ oder λ sein kann. Die H-Kette setzt sich aus vier Genfragmenten zusammen: 65-100 Typen von variablen Regionen (VH), zwei Typen von Diversitätsregionen (DH), sechs Typen von Verbindungsregionen (JH) und konstanten Regionen (CH).

Die L-Kette hingegen umfasst drei unterschiedliche Genfragmente, einschließlich variabler Regionen (VH), Verbindungsregionen (JH) und konstanter Regionen (CH). Genauer gesagt besteht die L-Kette aus variablen Regionen (VH), Verbindungsregionen (JH) und konstanten Regionen (CH), wobei jede Region zur Gesamtfunktionalität des BCR beiträgt. Diese sorgfältige Anordnung gewährleistet die Fähigkeit des BCR, eine Vielzahl von Antigenen zu erkennen, und bildet eine kritische Komponente in der komplexen Maschinerie der Immunantwort.

Cryo-EM-Karten des IgM BCR. (Dong et al., 2022)

BCR-Vielfalt

• Vielfalt, die aus der Umordnung von Genfragmenten (V, D und J) entsteht

Die variablen (V) Regionen sowohl der schweren (H) als auch der leichten (L) Ketten spielen eine entscheidende Rolle in der BCR-Vielfalt. Diese Regionen bestehen jeweils aus drei Aminosäuren und weisen eine hohe Variabilität auf, wodurch komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) — CDR1, CDR2 und CDR3 — gebildet werden. Alle drei CDRs sind aktiv an der Antigen-Erkennung beteiligt und bestimmen gemeinsam die antigen-spezifische Reaktivität des BCR. Besonders bemerkenswert ist das Gen, das CDR3 kodiert, das an der Verbindung zwischen der variablen Kette V und J oder der schweren Kette V, D und J-Fragmenten positioniert ist und die BCR-Vielfalt durch die Einbeziehung von Nukleotid-Einfügungen oder Spleißungen während der V(D)J-Umordnungen und V-D- sowie D-J-Verbindungen erhöht.

• Vielfalt, die aus Kombinationen von Nukleotidsequenzen resultiert

Die BCR-Vielfalt wird zusätzlich durch die Kombination zahlreicher V-Regionen-Genfragmente sowohl in leichten als auch in schweren Ketten bereichert. Darüber hinaus tragen die unterschiedlichen Kombinationen von V-, D- und J-Genen erheblich dazu bei. Während der Umordnung kann jedes Gen nur in einem Fragment verwendet werden, was die Gesamtvielfalt der BCRs verstärkt.

• Vielfalt, die durch hochfrequente somatische Zellmutationen induziert wird

Reife B-Zellen in den Keimzentren peripherer lymphatischer Organe unterliegen einer erhöhten Mutationsfrequenz im umgeordneten V-Regionen-Gen (CDR3) bei Stimulation durch Antikörper. Diese als hochfrequente Mutationen in somatischen Zellen bezeichneten Mutationen, die überwiegend Punktmutationen sind, treten nicht zufällig auf. Dieser Prozess trägt zur dynamischen Anpassungsfähigkeit der BCRs bei und verbessert deren Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Antigenen zu reagieren.

Der Workflow der B-Zell-Rezeptor (BCR) Sequenzierung

• Isolation und B-Zell-Erfassung

B-Zellen werden sorgfältig aus Blut- oder Gewebeproben isoliert, und ihre RNA wird extrahiert.

• Reverse Transkription zu cDNA

Die extrahierte RNA unterliegt einer reversen Transkription, bei der sie in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt wird.

• Vorbereitung der Rezeptor-Bibliothek

Unter Verwendung der cDNA als Vorlage wird eine Rezeptor-Bibliothek sorgfältig erstellt. Spezifische Primer, strategisch mit Markern flussaufwärts und flussabwärts basierend auf den Genmerkmalen entworfen, werden eingesetzt. Nach der PCR-Amplifikation wird eine umfassende Rezeptor-Bibliothek etabliert. Alle resultierenden Produkte, die zur Identifizierung markiert sind, sind bereit für die anschließende Reaktionssequenzierung.

• Hochdurchsatz-Sequenzierung

Unter Verwendung modernster Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien werden die erhaltenen cDNA-Sequenzen sorgfältig erfasst.

• Bioinformatische Datenverarbeitung

Die gewonnenen Sequenzierungsdaten unterliegen einer anspruchsvollen bioinformatischen Analyse. Dies umfasst eine sorgfältige Filterung der Sequenzierungsdaten, Sequenzspleißung, VDJ-Sequenzvergleich und letztendlich die Bestimmung und Übersetzung der Sequenzstrukturen.

Ansätze zur BCR- und TCR-Repertoire-Sequenzierung. (Seah et al., 2018)

Anwendungen der BCR-Sequenzierung

• Aufdeckung der Pathogenese und frühe Krankheitsüberwachung

Die BCR-Sequenzierung dient als leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der Komplexität der Krankheits-Padogenese und ermöglicht eine frühe Überwachung und Diagnose.

• Dynamische Überwachung der BCR CDR3 Rezeptor-Bibliothek für die Wirksamkeit von Medikamenten

Die dynamische Überwachung der BCR CDR3 Rezeptor-Bibliothek bietet einen wertvollen Ansatz zur Beobachtung der therapeutischen Wirksamkeit von Medikamenten.

• Korrelation der Gene Loci des B-Zell-Rezeptors mit dem Auftreten von Krankheiten

Die Untersuchung der Korrelation zwischen den Genloci des B-Zell-Rezeptors und dem Auftreten sowie dem Fortschreiten spezifischer Krankheiten bietet wichtige Einblicke für die frühe Überwachung und das Verständnis der Krankheits-Padogenese.

• Analyse der Tumorhomologie

Die BCR-Sequenzierung spielt eine zentrale Rolle bei der Analyse der Tumorhomologie innerhalb eines Organismus und trägt zu unserem Verständnis der Krebsbiologie und -progression bei.

• Screening somatischer Zellmutationen bei primären Immundefizienzen

Sie erleichtert das Screening somatischer Zellmutationen, insbesondere bei Patienten mit primären Immundefizienzen wie isolierter IgA-Defizienz, und unterstützt personalisierte medizinische Ansätze.

• Toleranzbewertung bei Transplantationsabstoßung

Die BCR-Sequenzierung trägt zur Bewertung der Toleranz in Transplantationsabstoßungsszenarien bei. Sie hilft, Abstoßungsereignisse vorherzusagen und leitet rechtzeitige und effektive Interventionsstrategien.

Referenzen:

1. Dong, Ying, et al. "Strukturelle Prinzipien der Assemblierung von B-Zell-Antigenrezeptoren." Nature 612.7938 (2022): 156-161.
2. Seah, Yu Fen Samantha, Hongxing Hu und Christoph A. Merten. "Mikrofluidische Einzelzelltechnologie in der Immunologie und Antikörper-Screening." Molekulare Aspekte der Medizin 59 (2018): 47-61.