Richtlinien zur Einreichung von Proben
Warum Poly(A) und TAIL Iso-seq wichtig sind
Poly(A)-Schwänze sind mehr als einfache RNA-Erweiterungen. Sie fungieren als wichtige Regulatoren der Lebensdauer, Stabilität und Translation von mRNA. Standard-RNA-Seq-Methoden verwerfen oder übersehen oft diese Informationen und verpassen wertvolle regulatorische Signale.
TAIL Iso-seq schließt diese Lücke. Es erfasst vollständige cDNA, einschließlich intakter Poly(A)-Schwänze, und bietet einen direkten Einblick in die Poly(A)-Länge, Heterogenität und assoziierte APA-Ereignisse. Forscher können Änderungen im 3'UTR mit miRNA-Bindungidentifizieren isoform-spezifische APA-Nutzungund untersuchen, wie die Schwanzlänge die Genexpression beeinflusst.
Dies macht TAIL Iso-seq zu einem wertvollen Werkzeug für:
- Untersuchung der RNA-Regulation in der Entwicklung
- Untersuchung der Stressreaktionen bei Pflanzen
- Untersuchung der RNA-Stabilität in Krebsmodellen
- Unterstützung der Entwicklung von RNA-Therapeutika und Impfstoffen
Vorteile von TAIL Iso-seq mit CD Genomics
Vollständige Präzision
TAIL Iso-seq erfasst das vollständige Transkript, einschließlich 5'UTR, kodierender Region, 3'UTR und Poly(A)-Schwanz. Dies beseitigt Zusammenbaufehler, die bei Kurzlese-RNA-seq häufig auftreten, und bietet eine Auflösung auf Isoform-Ebene.
Umfassende Poly(A)-Profilierung
Unser Service quantifiziert die Verteilungen der Poly(A)-Schwanzlängen im Transkriptom und erkennt nicht-A-Reste (U, G, C), die die RNA-Stabilität und die Übersetzungseffizienz beeinflussen. Dies ermöglicht es Forschern, die RNA-Dynamik mit unübertroffener Detailgenauigkeit zu untersuchen.
APA- und 3'UTR-Analyse
TAIL Iso-seq identifiziert alternative Polyadenylierung (APA) Stellen und charakterisiert Veränderungen in der Länge der 3'UTR. Dies hilft, APA mit Veränderungen in der miRNA-Bindung, RNA-Lokalisierung und post-transkriptioneller Regulation zu verknüpfen.
Umfangreiche bioinformatische Unterstützung
Wir liefern veröffentlichungsfertige Berichte mit Verteilungen der Schwanzlängen, APA-Karten, Isoformkatalogen und Analysen zur Anreicherung von Signalwegen. Visuelle Ausgaben erleichtern die Interpretation und können in Multi-Omics-Projekte integriert werden.
Technologie-Workflow
CD Genomics bietet einen vollständigen TAIL Iso-seq-Workflow, von der RNA-Extraktion bis zur bioinformatischen Berichterstattung. Jeder Schritt ist auf Genauigkeit und Reproduzierbarkeit optimiert, um zuverlässige Einblicke in die Poly(A)-Regulation und die Isoformenvielfalt zu gewährleisten.
RNA-QualitätskontrolleDie Eingangs-RNA wird auf Integrität (RIN ≥7) und Reinheit überprüft.
Vollständige cDNA-ErfassungProtokolle bewahren intakte poly(A)-Schwänze, und Barcodes können für multiplexe Projekte hinzugefügt werden.
Nanopore-LangzeitsequenzierungLiest vollständige Transkripte, einschließlich 5'UTR, CDS, 3'UTR und Poly(A)-Schwänzen.
TAIL Iso-seq-Workflow: von RNA-QC, Bibliotheksvorbereitung und Nanopore-Langsequenzierung bis hin zu umfassender bioinformatischer Analyse und publikationsfertigen Berichten.
Poly(A)-Schwanz-Sequenzierungsmethoden – Wann welche verwenden
| Methode | Plattform | Was es misst | Nicht-A-Reste | Durchsatz / Kosten (relativ) | Typische Stärken | Typische Einschränkungen | Gut für |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TAIL-seq | Illumina (3'-End-Sequenzierung) | Genomweite Schwanzlänge an 3'-Enden; 3'-Terminome | Erkennt terminale U/G-Zusätze | Hoch / $$ | Empfindliche Kartierung der 3'-Enden; verknüpft die Schwanzlänge mit dem Zerfall | Rohsignalverarbeitung und benutzerdefinierte Analyse erforderlich; keine vollständigen Isoformen | Deadenylierungs-/Uridylierungsstudien; Stabilitätstests |
| PAL-seq | Illumina + Fluoreszenzstandards | Schwanzlänge mit kalibrierter Fluoreszenz; Merkmale des 3'-Endes | Indirekt | Hoch / $$ | Interne Standards für kalibrierte Schwanzlängen; robuste Bulk-Profilierung | Hinzugefügte Biochemie; spezialisierte Einrichtung; nicht in voller Länge | Kalibrierte Verteilungen der Schwanzlängen von Bulk-Materialien; Methoden-Benchmarking |
| Poly(A)-Sequenzierung | Illumina (direkte Ablesung von poly(A) in cDNA) | Globale Profilierung von Poly(A)-Schwänzen; medianer Schwanz pro Gen | Nicht primärer Fokus | Hoch / $ | Einfachere Bibliothek vs. TAIL-seq; skalierbare Kohorten | Isoformen nicht aufgelöst; Herausforderungen bei Homopolymeren | Großkohorten-Screening von Veränderungen der Schwanzlänge |
| FLAM-seq | PacBio (Langzeit-Lese cDNA) | Vollständige mRNA einschließlich Poly(A)-Schwanz | Berichtet über nicht-A-Reste | Moderat / $$–$$$ | Links Isoformstruktur + Schwanzlänge pro Molekül | PacBio-Zugang; längere Laufzeiten | Isoform-resolvente Schwanzbiologie; Schwanzzusammensetzung pro Isoform |
| PAIso-seq / PAIso-seq2 | PacBio HiFi | Transkriptomweite Schwanzlänge von geringer Input; vollwertig | Kann die Schwanzzusammensetzung erfassen. | Moderat / $$–$$$ | Hochgenaue HiFi-Lesungen; niedrige Eingabe (z. B. Oocyten) | Plattform-spezifisch; Methodenkomplexität | Wertvolle/niedrig-input Proben; genaue Schätzungen des Endes |
| FLEP-seq2 | Nanopore (Langzeit-cDNA) | Vollständige RNA mit Schwanzlängen über Gewebe/Spezies hinweg | Erkennt Schwanzmuster | Moderat / $$ | Tiefe-freundlich; kreuzgewebliche Atlanten; nukleäre vs. zytoplasmatische Vergleiche | Handelsabgleich der Basisgenauigkeit von Nanoporen | Gewebeatlanten; Pflanzen und Nicht-Modellorganismen |
| Nano3P-seq | Nanopore (3'-End-Capture cDNA) | RNA-Häufigkeit + Schwanzdynamik (poly(A) und non-poly(A)) | Erkennt Nicht-A-Reste | Moderat / $$ | Erfasst polyadenylierte und nicht-polyadenylierte RNAs; pro-Molekül Schwänze | End-Erfassungsbias zum 3'-Ende; erfordert Toolchain | Entwicklungszeitverlauf; transkriptomweite Schwanzdynamik |
Bioinformatikanalyse
Unsere interne Pipeline integriert mehrere Informationsschichten:
- Isoform-Identifizierung: Entdeckung von Voll-Längen-Isoformen ohne Zusammenbau-Bias.
- Poly(A)-Schwanzanalyse: Verteilung, Medianlänge und Nachweis von Nicht-A-Resten (U, G, C).
- APA-Kartierung: Identifizierung von Polyadenylierungsstellen (PACs), Varianten der 3'UTR-Länge und APA-Wechselereignissen.
- Korrelationsanalyse: Verknüpfung der Poly(A)-Länge mit der Transkriptmenge, Stabilität und translationaler Effizienz.
- Funktionale Interpretation: GO- und KEGG-Anreicherung für von APA betroffene Gene, Vorhersagen zum Gewinn/Verlust von miRNA-Bindungsstellen.
Anwendungen von TAIL Iso-seq
- Entschlüsselung der Stressreaktion und Entwicklungsbiologie in Pflanzen – Profilierung, wie die Poly(A)-Schwanzlänge und die alternative Polyadenylierung (APA) unter Hitze, Trockenheit oder Entwicklungsübergängen (z. B. Arabidopsis-Hitzeschock-PAL-seq-Arbeiten) verändert werden.
- Verstehen Sie Krankheitsmechanismen und entdecken Sie Biomarker bei Krebs – identifizieren Sie neuartige Isoformen, veränderte Poly(A)-Schwanzdynamiken oder Fusionstranskripte, die die Pathologie antreiben oder als diagnostische/therapeutische Ziele dienen können (z. B. "Vollständige Länge und Einzelzell-Iso-Seq für die Krebsforschung").
- Optimierung von mRNA-basierten Therapeutika und Impfstoffkonstrukten – Gewährleistung der Transkriptintegrität, Einheitlichkeit der Schwanzlängen und Schwanzzusammensetzung (einschließlich Nicht-A-Resten), um die Translation und Stabilität zu verbessern.
- Entdeckung von Pflanzenmerkmalen und Verbesserung der Züchtung – Nutzung von Schwanzlängensignaturen und APA-Mustern zur Verknüpfung mit Ertrag, Hybridvitalität, Stressresistenz oder gewebespezifischer Expression in Pflanzen wie Reis, Mais und Sojabohnen.
Beispielanforderungen für den TAIL Iso-seq Service
| Probenart | Empfohlene Menge | Mindestmenge | Konzentration / Qualität | Notizen |
|---|---|---|---|---|
| Gesamt-RNA | ≥ 2 µg | 600 ng | ≥ 30 ng/µL | RIN ≥ 8, OD260/280 ≥ 1,8, DNA-frei |
| Zellen | ≥ 1 × 10⁶ | ≥ 5 × 10⁵ | Hohe Lebensfähigkeit (>80%) | Schnellgefrieren von Pellets in flüssigem Stickstoff |
| Gewebe (Tier/Pflanze) | ≥ 50 mg | ≥ 10 mg | RNA-Integrität RIN ≥ 8 | Verunreinigungen entfernen, sofort einfrieren |
| Pflanzengewebe (spezial) | 50–100 mg pro Aliquot | – | RNA-Integrität RIN ≥ 8 | Mit DEPC-Wasser waschen, in flüssigem Stickstoff einfrieren. |
| Bakterienkultur | ≥ 1 × 10⁷ Zellen | – | RNA-Integrität RIN ≥ 8 | Pellet, mit PBS waschen, in flüssigem Stickstoff einfrieren |
Allgemeine Richtlinien
- Reichen Sie Proben in RNase-freiem Wasser oder 10 mM Tris (pH 8,0) ein.
- Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
- Versenden Sie Proben auf Trockeneis, um die RNA-Qualität zu erhalten.
- Kennzeichnen Sie die Röhren deutlich mit kurzen Codes (≤4 alphanumerische Zeichen).
- Bitte stellen Sie die QC-Daten (Bioanalyzer/Tapestation-Traces) zusammen mit dem Einreichungsformular zur Verfügung.
Liefergegenstände
- Roh- und verarbeitete Sequenzierungsdaten (FASTQ, BAM).
- Isoform-Ebenen-Transkriptom-Katalog.
- Poly(A)-Schwanzlängenverteilungen und APA-Stellenkarten.
- Weganreicherungs-Tabellen und integrative Visualisierungen.
- Veröffentlichungsbereite Abbildungen und ein detaillierter technischer Bericht.
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Was ist TAIL Iso-seq und wie unterscheidet es sich von regulärem Iso-seq oder RNA-seq?
TAIL Iso-seq ist ein Long-Read-Sequencing-Service (auf Nanopore-Basis), der vollständige Transkripte einschließlich des nativen Poly(A)-Schwanzes erfasst und eine direkte Messung der Schwanzlänge, APA (alternative Polyadenylierung) Stellen und Isoformvielfalt ermöglicht. Reguläres RNA-seq verliert oft Schwanzinformationen und erfordert eine Lesezusammenstellung, während standardmäßiges Iso-seq möglicherweise die Transkriptstruktur erfasst, jedoch nicht immer die vollständige Poly(A)-Zusammensetzung und nicht-A-Reste.
Kann TAIL Iso-seq nicht-A-Nukleotide innerhalb oder am Ende von poly(A)-Schwänzen nachweisen?
Ja. Der Service umfasst die Erkennung von Nicht-Adenosin-Resten (wie U, G, C) sowohl an der terminalen Position als auch intern im Poly(A)-Schwanz. Diese Nicht-A-Reste geben Aufschluss über die Stabilität des Transkripts, den Abbau oder die Regulierung der Deadenylierung. Werkzeuge wie tailfindr, nanopolish und andere unterstützen diese Analyse.
Wie genau ist die Messung der Poly(A)-Schwanzlänge mit Nanopore-Langlesungen?
TAIL Iso-seq verwendet modernste Basiserkennung und Signalverarbeitungs-Pipelines, um die Schwanzlänge pro Molekül mit hoher Auflösung zu schätzen, oft mit einer Genauigkeit auf Einzel-Nukleotid-Ebene für kürzere Schwänze und guter relativer Genauigkeit für längere Schwänze. Die Genauigkeit hängt auch von der Probenqualität, dem Sequenzierungsergebnis (.fast5-Retention) und der Werkzeugwahl (tailfindr, nanopolish usw.) ab.
Benötige ich ein Referenzgenom, um TAIL Iso-seq zu verwenden?
Nein, aber das Vorhandensein eines Referenzgenoms oder einer Transkriptannotierung verbessert das Mapping, die Identifizierung von APA-Stellen und die Isoformauflösung. Bei Nicht-Modellorganismen ist eine de-novo-Langleseanordnung in Kombination mit referenzfreier Transkriptannotierung möglich, obwohl einige Analysen (z. B. die Vorhersage von miRNA-Bindungen) ohne gute Annotierung schwieriger sein können.
Was sind die Anforderungen an die Eingabemuster für TAIL Iso-seq?
RNA von hoher Integrität ist erforderlich (empfohlener RIN ≥ 7), frei von Verunreinigungen, mit ausreichender Menge je nach Organismus / Gewebe; geringerer Input ist mit optimierten Methoden möglich. Die RNA muss intakte poly(A)-Schwänze enthalten und eine minimale Degradation aufweisen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Wie gehen Sie mit PCR-Bias oder der Verkürzung von Poly(A)-Schwänzen in der Pipeline um?
Wir minimieren Verzerrungen, indem wir Long-Read-Sequenzierung verwenden (die die Fragmentzusammenstellung vermeidet), vollständige Transkripte erfassen, Rohsignal-Daten (.fast5) für die Schätzung der Schwanzlänge beibehalten und QC-Schritte anwenden, um verkürzte oder degradierte RNA herauszufiltern. Der Einsatz von Werkzeugen, die mit Rohsignal arbeiten, hilft, eine genaue Schwanzschätzung sicherzustellen.
Was ist der Unterschied zwischen der Analyse des Poly(A)-Schwanzes und der Analyse der alternativen Polyadenylierung (APA)?
Die Analyse des Poly(A)-Schwanzes konzentriert sich auf die Länge, Zusammensetzung und Modifikationen des Schwanzes selbst am Transkriptende. Die APA-Analyse befasst sich damit, wo die Polyadenylierung erfolgt – d.h. die Kartierung der Poly(A)-Schnittstellen, die unterschiedlichen Längen der 3' untranslatierten Regionen (3'UTR) zwischen Isoformen und wie dies die Regulation beeinflusst (z.B. miRNA-Bindung). Beide Ansätze sind komplementär.
Kann TAIL Iso-seq für vergleichende Studien über Bedingungen oder Arten hinweg verwendet werden?
Ja. Da es die Verteilungen der Schwanzlängen pro Isoform und die Nutzung von APA-Stellen pro Probe bereitstellt, unterstützt TAIL Iso-seq Vergleiche zwischen Geweben, Behandlungen oder Arten. Statistische Pipelines können auf Unterschiede in der Schwanzlänge oder der APA-Nutzung zwischen Gruppen testen.
Wie lange werde ich die Ergebnisse (Bioinformatik + Liefergegenstände) erhalten?
Typische Zeitrahmen hängen von der Anzahl der Proben, der Komplexität und der Sequierungstiefe ab. Der Bericht umfasst rohe und verarbeitete Sequierungsdaten, Verteilungen der Schwanzlängen, APA-Kartierungen, Isoformkataloge und Visualisierungen. (Spezifische Bearbeitungszeiten werden basierend auf dem Umfang im Projektangebot bereitgestellt.)
Wie skaliert die Kosten mit der Anzahl der Proben, der Tiefe oder der Komplexität des Zieltranskripts?
Die Kosten steigen in der Regel mit der Anzahl der Proben, der erforderlichen Lesetiefe und der Komplexität (z. B. Nicht-Modellorganismen oder Transkripte mit geringer Expression). CD Genomics bietet skalierbare Preise an; die Kunden können je nach benötigter Auflösung (Isoformentdeckung, Schwanzzusammensetzung, APA-Präzision) zwischen Standard- oder Premium-Analyseebenen wählen.
Fallstudie: "Ein Atlas der vollständigen RNA von Pflanzen zeigt gewebespezifische und evolutionär konservierte Regulation der Poly(A)-Schwanzlänge in Pflanzen"
Zitat: Jia J., Lu W., Liu B. u. a. Ein Atlas der vollständigen RNA von Pflanzen zeigt die gewebespezifische und die konservierte Regulation der Poly(A)-Schwanzlänge zwischen Monokotylen und Dikotylen., Natur Pflanzen 2022.
1. Hintergrund
Forscher fehlte eine umfassende, vollständige Transkriptomressource in Pflanzen, die umfasst Information zur Länge des poly(A)-Schwanzes über Gewebe und Arten hinweg. Frühere Methoden mit kurzen Reads konnten oft die poly(A)-Schwänze nicht erhalten oder verbanden die Schwänze nicht mit vollständigen Transkript-Isoformen. Diese Lücke schränkte die Erkenntnisse darüber ein, wie die Länge der poly(A)-Schwänze, APA (alternative Polyadenylierung) und die Stabilität von mRNA zwischen Geweben oder über Pflanzenarten hinweg variieren.
2. Methoden
- Verwendete eine poly(A)-anreicherungsfreie, Nanopore-basierte Methode (FLEP-seq2), um vollständige RNAs mit poly(A)-Schwänzen zu sequenzieren.
- Sieben verschiedene Gewebe von Arabidopsis thaliana sowie das Sprossgewebe von Mais, Sojabohne und Reis wurden entnommen. Insgesamt wurden über 120 Millionen polyadenylierte mRNA-Moleküle sequenziert.
- Verglichen wurden die Verteilungen der Poly(A)-Schwanzlängen zwischen Zellkern und Cytoplasma, verschiedenen Geweben und orthologen Genen in verschiedenen Arten. Außerdem wurde die Beziehung zwischen der mRNA-Halbwertszeit und der Schwanzlänge bewertet.
3. Ergebnisse
- In den meisten Geweben erreichten die Längen der Poly(A)-Schwänze Spitzen von etwa 20 nt und 45 nt; im Pollen waren die Spitzen unterschiedlich (etwa 55–80 nt).
- Nukleäre RNAs hatten Schwänze, die fast doppelt so lang waren wie die Schwänze der zytoplasmatischen RNAs.
- Gene mit kurzen mRNA-Halblebensdauern hatten im Allgemeinen längere Poly(A)-Schwänze, während stabile Transkripte Schwänze hatten, die bei etwa 45 nt ihren Höhepunkt erreichten.
- Der Vergleich zwischen Arten zeigte, dass orthologe Gene dazu neigen, eine ähnliche Regulation der Schwanzlängen beizubehalten, trotz der Unterschiede zwischen den Arten.
Abbildung: Nukleäre Poly(A)-Schwänze sind länger als zytoplasmatische SchwänzeDies zeigt die Verteilung der Längen der poly(A)-Schwänze in nuklearen vs. zytoplasmatischen Fraktionen über Pflanzenarten/-gewebe hinweg.
4. Schlussfolgerungen
- Die Regulation des Poly(A)-Schwanzes ist genspezifisch, gewebespezifisch und zeigt eine evolutionäre Erhaltung unter Pflanzen.
- Unterschiede in der Schwanzlänge zwischen Nukleus und Zytoplasma sowie zwischen Geweben deuten auf eine dynamische Regulation des Schwanzkürzens (Deadenylierung) und der APA hin.
- Der Datensatz bietet eine Ressource zur Untersuchung der mRNA-Stabilität, Translation, APA und nicht-kodierender regulatorischer Merkmale in Pflanzen.
- Unterstützt den Wert der vollständigen, langen Sequenzierung zur Verknüpfung der Schwanzlänge mit der RNA-Funktion.
Referenzen:
- Jia J, et al. Ein Atlas der vollständigen RNA von Pflanzen zeigt die gewebespezifische und die konservierte Regulation der Poly(A)-Schwanzlänge zwischen Monokotylen und Dikotylen.. Natur Pflanzen. 2022
- Wen H, Chen W, Chen Y, Wei G, Ni T. Integrative Analyse von Iso-Seq und RNA-seq zeigt dynamische Veränderungen von alternativen Promotoren, alternativer Spleißung und alternativer Polyadenylierung während der durch Angiotensin II induzierten Seneszenz in primären aortalen Endothelzellen von Ratten.. Front Genet2023 Jan 19;14:1064624.
- Kuo RI, Cheng Y, Zhang R, Brown JWS, Smith J, Archibald AL, Burt DW. Die dunkle Seite des menschlichen Transkriptoms mit Langlese-Transkript-Sequenzierung erhellen. BMC Genomik2020 Okt 30;21(1):751. doi: 10.1186/s12864-020-07123-7. PMID: 33126848; PMCID: PMC7596999.
