Mikrosatelliten-Genotypisierungsdienst

CD Genomics verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Unterstützung bei der Auswahl und dem Design von Mikrosatellitenmarkern für eine Vielzahl von Pflanzen- und Tierarten. Neben der Mikrosatellitengenotypisierung bieten wir auch an Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS) Methode, die Zeit und Ressourcen spart.

Die Einführung der Mikrosatelliten-Genotypisierung

Mikrosatelliten, auch bekannt als einfache Sequenzwiederholungen (SSRs) oder kurze tandemwiederholungen (STRs), sind aufgrund ihrer hohen Polymorphie beliebte Marker. Genotypisierung ist ein genauer, kosteneffizienter und schneller Ansatz zur Unterscheidung von Mikrosatellitenallelen, der durch fortlaufende technische Fortschritte, einschließlich Multiplex-PCR, unterstützt wird und Next-Generation-Sequenzierung Technologien. Der vollständige Workflow für die Mikrosatelliten-Genotypisierung umfasst die Erfassung von Sequenzierungsdaten, die Auswahl von SSR, die Primer-Design, die Primer-Validierung, die Multiplex-PCR und die kapillare Gel-Elektrophorese in Verbindung mit einer fluoreszenzbasierten Detektion sowie die Datenanalyse.

Die PCR-Reaktion wird mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt, anschließend können die PCR-Fragmente in einer Kapillare analysiert werden. DNA-Sequenzierung Maschine, und die Daten werden mit GeneMapper analysiert.^TM Software. Durch die Nutzung von Multiplexing nach Fragmentgröße und Farbstofffarbe sowie der Fähigkeit automatisierter fluoreszierender genetischer Analysegeräte, 16 Proben gleichzeitig aus 96- oder sogar 384-Well-Mikrotiterplatten zu laden, kann eine Hochdurchsatz-Markergenanalyse entworfen werden. Dieser Service wurde auf eine Vielzahl von Arten angewendet und kann für jede Art bereitgestellt werden, für die Mikrosatellitenmarker verfügbar sind.

Wenn Sie mehr über Mikrosatelliten-Genotypisierung erfahren möchten, können Sie unseren Artikel lesen "Einführung in Mikrosatelliten und Mikrosatelliten-Genotypisierung"."

Vorteile der Mikrosatelliten-Genotypisierung

Vorteile von Mikrosatelliten als genetische Marker:

• Universell und polymorph.
• Lokus-spezifisch (im Gegensatz zu Multi-Lokus-Markern wie Minisatelliten)
• Kodominant (Heterozygote können von Homozygoten unterschieden werden)
• PCR-basiert (benötigt nur winzige Mengen Gewebe und funktioniert mit degradiertem DNA)
• Vielfältige Anwendungen (von individueller Identifikation bis hin zu feinkörnigen Phylogenien)

Anwendung der Mikrosatelliten-Genotypisierung

Die riesige Menge an Daten, die für Tausende von Mikrosatellitenmarkern über Organismen hinweg verfügbar ist, macht die Mikrosatelliten-Genotypisierung zu einem weithin akzeptierten Werkzeug für:

• Verknüpfungsanalyse der Ko-Segration
• Diagnose und Identifizierung von menschlichen Krankheiten
• Forensische Identifizierung und Verwandtschaftstests
• Zelllinienidentifikation
• Bevölkerungsstudien

Mikrosatelliten-Genotypisierungs-Workflow

CD Genomics nutzt fortschrittliche Plattformen (ABI 3730xl DNA-Analyzer) und Strategien (Multiplex-PCR), um einen schnellen und genauen Mikrosatelliten-Genotypisierungsservice sowie bioinformatische Analysen anzubieten. Unser hochqualifiziertes Expertenteam führt ein Qualitätsmanagement durch, das jede Prozedur verfolgt, um zuverlässige und unvoreingenommene Ergebnisse zu gewährleisten. Der grobe Arbeitsablauf ist unten skizziert.

Dienstspezifikation

	Beispielanforderungen Gewebeproben, oder bereits extrahierte DNA, oder PCR-Produkte Genomisches DNA ≥ 500 ng, Mindestmenge: 200 ng, Konzentration ≥ 10 ng/μl, OD260/280 = 1,8 ~ 2,0 PCR-Produkte mit hoher Spezifität Alle DNA-Proben werden auf Reinheit und Menge validiert.
	Multiplex-PCR und Genotypisierung SSR-Auswahl aus Sequenzdaten Primerentwurf und -validierung Multiplex-PCR Kapillare Gel-Elektrophorese mit ABI 3730xl DNA-Analyzer
	Datenanalyse Größenpräzision Allele-Bestimmung und Binning Clusteranalyse Fehlerquoten messen und berichten Genetische Vielfalt und Populationsstudien Mehr auf Anfrage

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Vollständiges experimentelles Verfahren,
• PCR-Elektrophorese-Bilder
• Große Gel-Detektionsbilder
• Sequenzierungschromatogramme
• Datenanalyseergebnisse

CD Genomics bietet ein umfassendes Mikrosatelliten-Genotypisierungs-Servicepaket an, das das Entwerfen und Bestellen von fluoreszenzmarkierten Primerpaaren, die Primervalidierung, die Mikrosatelliten-Genotypisierung sowie die Datenanalyse umfasst. Wir können diesen Ablauf an Ihr Forschungsinteresse anpassen. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Was ist Mikrosatelliten-Genotypisierung?

Mikrosatelliten-Genotypisierung ist eine leistungsstarke Technik, die zur Erkennung und Bewertung von Variationen innerhalb von Mikrosatelliten, auch bekannt als Simple Sequence Repeats (SSRs), in DNA eingesetzt wird. Mikrosatelliten sind kurze sich wiederholende Sequenzen, die aus 1-6 Basenpaaren bestehen. Diese Sequenzen sind im gesamten Genom erheblich variabel und dienen daher als ausgezeichnete genetische Marker.

2. Was ist das Prinzip hinter der Mikrosatelliten-Genotypisierung?

Die Mikrosatelliten-Genotypisierung basiert auf dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation spezifischer Mikrosatellitenstellen. Diese Technik umfasst die Entwicklung spezifischer Primer zur Amplifikation gezielter Mikrosatellitenregionen. Anschließend werden die amplifizierten Produkte anhand von Größenvariationen durch Techniken wie Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese differenziert und typisiert.

3. Was sind die Vorteile der Mikrosatelliten-Genotypisierungstechnologie?

Die Verwendung von Mikrosatelliten-Genotypisierungstechnologie bietet mehrere deutliche Vorteile in Studien zur genetischen Variation:

• Prominenter Polymorphismus: Mikrosatelliten zeichnen sich durch ihren hohen Variabilitätsgrad aus und liefern somit eine Fülle genetischer Informationen.
• Präzise Auflösung: Diese Untersuchungstechnologie ermöglicht eine hochpräzise Differenzierung und hebt selbst geringfügige genetische Variationen zwischen einzelnen Organismen hervor.
• Breite Verbreitung: Mikrosatellitenmarker durchdringen das Genom umfassend, was diese Technik für verschiedene biologische Arten geeignet macht.

4. Wie unterscheidet sich die Mikrosatelliten-Genotypisierung von anderen Genotypisierungstechnologien?

Mikrosatelliten-Genotypisierung unterscheidet sich von Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) Genotypisierung in mehreren entscheidenden Aspekten:

• Erweitertes Polymorphismus: Im Vergleich zu SNP-GenotypisierungDie Mikrosatelliten-Genotypisierung weist ein überlegenes Maß an Polymorphismus auf, was sie außergewöhnlich gut für die Erforschung hochvariabler genetischer Regionen geeignet macht.
• Unterschiedliche Anwendungszwecke: Während SNP-Genotypisierung traditionell nützlich ist, um Punktmutationen zu analysieren, glänzt die Mikrosatelliten-Genotypisierung in Studien, die ein detaillierteres Verständnis der genetischen Variabilität erfordern.

5. Wie können Mikrosatelliten-Genotypisierungsdaten verarbeitet und analysiert werden?

Die Verfahren zur Verarbeitung und Analyse von Mikrosatelliten-Genotypisierungsdaten umfassen:

• Fragmentgrößenbestimmung: Die Messung der Fragmentgrößen aus Elektropherogrammen erfolgt mit spezieller Software.
• GenotypisierungBasierend auf der Fragmentgröße erfolgt die Identifizierung von Allelen an Mikrosatellitenloci.
• Statistische Analyse: Genotypische Daten werden mit statistischer Software analysiert, um genetische Variabilität und Populationsstruktur aufzudecken.

Hochauflösende, hochgenaue Mikrosatelliten-Genotypisierung ermöglicht eine präzise Risikoklassifizierung für Lungenkrebs.

Journal: Onkogen
Impactfaktor: 7,519
Veröffentlicht: 31. Juli 2017

Hintergrund

Mikrosatelliten sind eine Reihe von tandem angeordneten DNA-Sequenzen, die aus kurzen repetitiven Einheiten (1-6 bp) bestehen. Jüngste Forschungen haben die entscheidende Rolle hervorgehoben, die diese Mikrosatelliten im komplexen Prozess der genetischen Entwicklung bei einer Vielzahl von Krebsarten spielen. Das Hauptziel dieser Studie ist es, bestimmte Mikrosatellitenmarker zu identifizieren, die für die Risikostratifizierung von Lungenkrebs anwendbar sind. Dies soll erreicht werden, indem die Keimbahn-Exomsequenzen von Lungenkrebspatienten mit einer normativen Kontrollgruppe verglichen werden.

Methoden

Ergebnisse

Die angewandte Methodik ist hauptsächlich in zwei Phasen unterteilt: (i) Identifizierung von Mikrosatelliten (MST) Standorten und (ii) Validierung ihres Status als signifikante Marker. Unter Verwendung von Daten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA), das 488 Tumorproben von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs umfasst, und aus dem 1000 Genomes Project mit 399 Kontrollproben ohne Krebs, konzentrierte sich die erste Phase auf die Unterscheidung genetischer Variationen in MST-Standorten. Diese Analyse führte zur Enthüllung von 119 signifikanten MST-Standorten, was auf einen entscheidenden Genotypunterschied zwischen krebserkrankten und Kontrollproben hinweist. Durch ähnliche Analysemethoden wurden zusätzlich 144 MST-Marker in anderen Krebsarten identifiziert. Der Übergang zur zweiten Phase umfasste die Entwicklung eines maßgeschneiderten Zielanreicherungs-Kits mit 263 (119+144) MST-Markern, ergänzt durch 84 Kontroll-MST-Marker für die gezielte Erfassungsequenzierung. Die Durchführung einer Tiefensequenzierung von 30 Lungenkrebsproben und 89 Kontrollproben ohne Krebs, mit einer durchschnittlichen Sequierungstiefe von 579x ± 315, offenbarte ausgeprägte Unterschiede innerhalb von 21 (13+8) MST-Markern unter den 263 untersuchten.

Abb. 1. Die rechnerisch ermittelten MST-Loci von LUAD und LUSC unterscheiden ihren jeweiligen Krebs-Typ mit hoher Sensitivität (LUAD: 0,87, LUSC: 0,88) von 1000 Genom nicht-krebsartigen Kontrollproben.

Jüngste Studien heben hervor, dass unterschiedliche Krebsarten tatsächlich gemeinsame onkogene Merkmalspektren teilen können. Neben der Entdeckung von 13 Mikrosatelliten (MST)-Standorten, die zur Risikostratifizierung von Lungenkrebs beitragen, sowohl in Daten zu Lungenkrebs als auch zu Nicht-Krebs, untersuchte diese Studie auch 144 MST-Standorte aus anderen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Eierstockkrebs, Melanomen und Neuroblastomen. Nach rigoroser Überprüfung wurde festgestellt, dass 8 dieser Marker effektiv im Rahmen der Risikobewertung von Lungenkrebs genutzt werden können.

Tabelle 1 MST-Loci, die zwischen den Lungenkrebsproben und den Nicht-Tumorproben präzise unterscheiden können.

Abb. 2. Die 13 spezifischen MST-Loci für Lungenkrebs und 8 MST-Loci, die spezifisch für andere Krankheiten sind, können zwischen den Lungenkrebs- und den nicht-krebsartigen Kontrollgruppen unterscheiden.

Eine genauere Untersuchung dieser 13 MST-Stellen ergab ihre Lage im Intronbereich von Genen. Frühere Untersuchungen hatten angedeutet, dass MST im Intronbereich den Prozess der Splice-Variante und die Transkription von Genen beeinflussen könnte. Die Clusteranalyse dieser 13 Gene innerhalb der DAVID-Datenbank zeigte einen Überblick über eine signifikante Anreicherung sowohl in Splice-Varianten als auch in Transkriptprodukten. Eine Assoziationsanalyse dieser 13 Gene, die mit Lungenkrebs in Verbindung stehen, ergab, dass nur REL und ARID1B wurden in früheren Forschungen als mit Krebs in Verbindung stehend identifiziert. Die Implikationen der TCGA deuten darauf hin, dass diese beiden Gene das Auftreten von Lungenkrebs durch Mechanismen von DNA-Schäden und Chromatinumbau auslösen könnten.

Fazit

• Eine umfassende Analyse von krebsbezogenen Daten aus dem TCGA und dem 1000 Genomes Project erfasste 263 (119+144) MST-Stellen, die signifikante Genotypvariationen zwischen Krebs- und Kontrollproben aufwiesen.
• Durch den Einsatz von gezielter Capture-Sequenzierung wurde eine effektive Probenvalidierung für diese MST-Stellen durchgeführt, die 21 (13+8) MST-Marker enthüllte, die eine verbesserte Risikostratifizierung für Lungenkrebs ermöglichen.
• Die Analyse der 13 gesichteten MST-Standorte mittels Cluster- und Anreicherungsanalyse ließ den Schluss zu, dass sie möglicherweise DNA-Schäden und Chromatin-Remodeling-Mechanismen beeinflussen, die wiederum Lungenkrebs verursachen. Dieser Effekt erfolgt überwiegend durch REL und ARID1B.
• Die entdeckten MST-Stätten haben potenziell erheblichen klinischen Wert. Ihre Entdeckung ist entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele, die Vorhersage von Lungenkrebs und umfassende Prozesse zur Bewertung des Krebsrisikos.

Referenz:

1. Velmurugan KR, Varghese RT, Fonville NC, u. a.Hochauflösende, hochgenaue Mikrosatelliten-Genotypisierung ermöglicht eine präzise Risikoklassifizierung für Lungenkrebs. Onkogen2017, 36(46):6383-90.