Einführung in Mikrosatelliten und Mikrosatelliten-Genotypisierung

Was sind Mikrosatelliten?

Mikrosatelliten, auch bekannt als kurze tandemwiederholte Sequenzen (STRs) oder einfache Sequenzwiederholungen (SSRs), sind tandemwiederholte Sequenzen, bei denen die wiederholende Einheit aus ein bis sechs Nukleotiden besteht. Die Anzahl der Wiederholungen ist in Populationen und innerhalb der Allele eines Individuums sehr variabel, da Mikrosatelliten während der DNA-Replikation anfällig für Gleiten sind. Trotz der Mikrosatelliteninstabilität, die in allen sich teilenden Zellen auftritt, bleiben Mikrosatelliten aufgrund des MMR-Systems, das eine wichtige Rolle bei der Reparatur von Fehlern in der DNA-Replikation und der Regulierung von Rekombinationsevents spielt, in ihrer Länge stabil.

Mikrosatelliten: informative genetische Marker

Mikrosatelliten sind wichtige genetische Marker, da sie tendenziell hoch polymorph sind und als geschlechtsspezifische Marker, populationsspezifische Marker usw. verwendet wurden. Mit dem Aufkommen der PCR haben Mikrosatellitenmarker-Polymorphismen die RFLPs als Marker zum Erstellen von Verknüpfungskarten ersetzt. Die flankierenden Regionen sind entscheidend, da sie es den Forschern ermöglichen, locus-spezifische Primer zu entwerfen, um die Mikrosatelliten über PCR zu amplifizieren. Das heißt, die Primer für die PCR sind die Sequenzen aus den einzigartigen flankierenden Regionen. Durch die Entwicklung eines Vorwärts- und eines Rückwärtsprimers auf beiden Seiten des Mikrosatelliten sind wir in der Lage, eine locus-spezifische Mikrosatellitenregion zu amplifizieren, um die Mikrosatellitenvariation zu bestimmen.

Vorteile von Mikrosatelliten als genetische Marker:

• Hochgradig polymorph. Der Grund scheint die Slippage-Replikation zu sein.
• Lokus-spezifisch. Lokus-spezifische Primer ermöglichen es uns, lokus-spezifische Mikrosatelliten zu amplifizieren.
• Kodominant (im Gegensatz zu RAPDs und AFLPs, die „binär, 0/1“ sind).
• PCR-basiert. Wir arbeiten mit winzigen Mengen DNA und kostengünstigen Laborinstrumenten.
• Ein Spektrum von Skalen von individueller Identifikation bis hin zu feinkörnigen Phylogenien

Anwendungen von Mikrosatellitenmarkern

Mikrosatellitenmarker sind sehr nützlich (i) in Studien zur biologischen Vielfalt, die auf der Grundlage genetischer Distanzen gemessen werden; (ii) um den Genfluss und die Rekombinationsraten zu schätzen; (iii) um infraspezifische genetische Beziehungen abzuleiten; (iv) um Kopplungspläne zu erstellen und DNA-Fingerabdrücke von Sorten zu definieren; (v) um Loci, die an quantitativen Merkmalen beteiligt sind, zu kartieren; (vi) um den Verwandtschaftsgrad zu bestimmen; (vii) in der Zucht unter Verwendung von markergenützter Selektion. Das heißt, diese Marker sind insbesondere nützlich in Studien zur Populationsstruktur, genetischen Kartierung und Evolution.

Abbildung 1. Arbeitsablaufschritte der SSR (Mikrosatellit) Markerentwicklung.

Mikrosatelliten-Genotypisierung

Genotypisierung ist der Prozess zur Identifizierung des Genotyps jedes Mikrosatelliten. Der Arbeitsablauf von Mikrosatelliten-Genotypisierung beinhaltet im Allgemeinen die spezifische Primer-Design, die Amplifikation von Mikrosatelliten und die Polymorphismustests.

• Spezifische Primer-Design

Wenn jemand SSR-Primer für eine eng verwandte Art entwickelt hat, sind diese Primer auf jeden Fall einen Blick in Ihrer Art wert. Wenn jedoch keine Primer für verwandte Arten entwickelt wurden, müssen Sie möglicherweise Ihre eigenen entwerfen. Es ist notwendig, zuerst die Nukleotidsequenzen zu haben, entweder aus Ihrem eigenen Sequenzierungsprojekt oder aus der NCBI-Nukleotiddatenbank. SSR-Motive können mit dem MIcroSAtellite Identification (MISA)-Tool (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa) identifiziert werden. Locus-spezifische SSR-Primer können mit SSRLocator v1.0 entworfen werden.

• Amplifikation von Mikrosatelliten

Sobald die SSR-Primer entwickelt wurden, ist es notwendig, diese Primer mittels PCR-Amplifikation zu validieren. Jede 20 µL SSR-PCR-Reaktionsmischung besteht aus DNA-Polymerase, 1×Reaktionspuffer, 2 mmol L^-1 MgCl2, 40 µmol L^-1 dNTP-Mix, 0,5 µmol/L^-1 Vorwärtsprimer, 0,5 µmol/L^-1 Reverse-Primer und 50 ng genomische DNA. Die thermische Zyklen werden in einem PCR-Gerät unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten, 36 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 50 Sekunden, Annealing bei optimaler Temperatur für 1 Minute und Verlängerung bei 72°C für 1 Minute sowie eine abschließende Verlängerung bei 72°C für 7 Minuten.

• Polymorphismus-Testung

Die PCR-Ergebnisse können durch Agarose-Gelelektrophorese oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) visualisiert werden. Die Genotypisierung mittels PAGE ist arbeitsintensiv, bietet jedoch eine gute Auflösung. Für feingliedrige Studien können markierte SSR-Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff synthetisiert werden, um die Genotypisierung durch Kapillarelektrophorese unter Verwendung von Geräten wie dem ABI 3730 DNA-Analyzer durchzuführen. In diesem Fall wird jedes PCR-Produkt in eine Kapillare geladen, die eine Polyacrylamidmatrix enthält, in der die Elektrophorese durchgeführt wird. Die emittierte Fluoreszenz wird erfasst und die Molekularmasse des PCR-Produkts bestimmt. Anschließend wird ein Elektropherogramm erzeugt, das Lumineszenzspitzen zeigt, die jedem amplifizierten Allel entsprechen.

Referenzen:

1. Vieira M L C, Santini L, Diniz A L, u. a.Mikrosatellitenmarker: was sie bedeuten und warum sie so nützlich sind. Genetik und Molekularbiologie, 2016, 39(3): 312-328.
2. Saha D, Rana R S, Chakraborty S, u. a.Entwicklung eines Satzes von SSR-Markern zur Erkennung genetischer Polymorphismen und interspezifischer Hybridzüchtung von Jute. The Crop Journal, 2017, 5(5): 416-429.
3. Guichoux E, Lagache L, Wagner S, u. a.Aktuelle Trends in der Mikrosatelliten-Genotypisierung. Molekulare Ökologie-Ressourcen, 2011, 11(4): 591-611.