Richtlinien zur Einreichung von Proben
Was ist Polysome-Seq?
In der modernen Molekularbiologie hat sich die Forschung zur Genexpression weit über die bloße Quantifizierung von mRNA-Spiegeln hinaus entwickelt. Der Übersetzungsprozess – bei dem Ribosomen mRNA-Baupläne in Proteine dekodieren – macht mehr als die Hälfte aller genregulatorischen Ereignisse aus und hat einen tiefgreifenden Einfluss auf das Zellverhalten, die Proteinfunktion und die Krankheitsentwicklung. Dennoch reichen traditionelle transkriptomische Methoden oft nicht aus, um die wahre Landschaft der Proteinsynthese offenzulegen, wodurch Lücken zwischen dem gemessenen mRNA-Reichtum und der tatsächlichen Proteinproduktion entstehen.
Polysom-Sequenzierung (Polysome-seq) überbrückt diese kritische Lücke. Durch die Kombination von Polysom-Profiling mit Hochdurchsatz-Sequenzierung bietet Polysome-seq Forschern einen umfassenden, quantitativen Überblick darüber, wie Ribosomen mit Tausenden von mRNAs unter verschiedenen biologischen Bedingungen interagieren. Es enthüllt dynamische Einblicke in die translationale Regulation und ermöglicht eine präzise Untersuchung der Genexpression auf der Ebene, auf der Proteine – die ultimativen Effektoren der zellulären Funktion – tatsächlich produziert werden.Wie Polysom-Profilierung funktioniert
Polysom-Profiling ist eine analytische Methode, die zytoplasmatische RNA basierend auf der Anzahl der an jedes mRNA-Molekül gebundenen Ribosomen trennt. Durch die Verwendung von Sukrosegradienten-Ultrazentrifugation werden zelluläre Lysate in verschiedene Schichten fraktioniert, die Folgendes repräsentieren:
- Freie mRNA (nicht an der Translation beteiligt)
- 40S- und 60S-Ribosomenuntereinheiten
- 80S Monosomen (einzelne Ribosomen)
- Leichte und schwere Polysomen (mehrere Ribosomen, die eine einzelne mRNA übersetzen)
Ein Vergleich von translationalen Omik-Technologien
Die translationale Forschung hat sich erweitert und umfasst mehrere Hochauflösungstechnologien, die jeweils einzigartige Einblicke bieten:
| Technologie | Kernfokus | Hauptvorteile | Einschränkungen |
|---|---|---|---|
| Polysom-Profilierung / Polysom-seq | Misst die Ribosomenbesetzung, um die Übersetzungseffizienz abzuleiten. | - Effizienzmessung der direkten Übersetzung - Beibehaltung längerer RNA-Fragmente für nachgelagerte Analysen |
- Größere Stichprobe erforderlich - Keine ribosomalen Positionsdaten |
| Ribo-seq (Ribosomen-Profiling) | Karten präzise Ribosomenpositionen auf mRNA mit Codonauflösung. | - Erkennt Startstellen, ORFs, uORFs - Enthüllt translatio-nale Pausen und Dynamik |
- Technisch komplex - Kann aktive von stillstehenden Ribosomen nicht unterscheiden |
| RNC-seq (Ribosom-Nascent-Chain-Komplex-Sequenzierung) | Erfasst vollständige mRNAs, die an Ribosomen gebunden sind. | - Bewahrt die gesamte mRNA-Struktur - Erkennt alternative Spleißisoformen |
- Fehlt an ribosomaler Positionsinformation - Niedrigere Auflösung der Übersetzungsdynamik |
| Disome-seq | Erkennt Ribosomenkollisionen und translationales Pausieren. | - Beleuchtet co-translationalen regulatorischen Ereignisse | - Spezialisierte, neuere Technik mit weniger Anwendungen |
| TRAP-seq | Isoliert ribosomgebundene mRNAs in spezifischen Zelltypen über markierte Ribosomen. | - Zell- oder gewebespezifische Translationsprofilierung | - Erfordert transgene Modelle - Mögliche Beeinträchtigung der Ribosomenfunktion |
Unter diesen Technologien, Polysom-Sequenzierung hebt sich als idealer Kompromiss hervor – es bewahrt die RNA-Integrität, zeigt die Übersetzungseffizienz im gesamten Transkriptom und ermöglicht eine integrative Analyse zusammen mit Transkriptomik, Epitranskriptomik und Proteomik.
Wir bieten ein umfassendes Angebot an translationalen Profilierungsdiensten an, einschließlich Polysome-seq, Ribo-seq, RNC-seq, Disome-seq und TRAP-seq, um unterschiedlichen Forschungsbedürfnissen in allen Bereichen der Molekularbiologie gerecht zu werden..
Unser Polysom-Sequenzierungs-Workflow: Von der Probe zur Erkenntnis
1. Beratung & Experimentelles Design
Jedes Projekt beginnt mit einer detaillierten Diskussion zwischen unserem wissenschaftlichen Team und Ihrer Forschungsgruppe, um:
- Definieren Sie Ihre biologischen Fragen und Hypothesen.
- Wählen Sie geeignete experimentelle Bedingungen, Kontrollen und Wiederholungen aus.
- Wählen Sie zwischen Einzel-Fraktion- oder Multi-Fraktion-Polysom-Sequenzierungsstrategien.
- Richten Sie Ihr Projekt an Publikationsstandards aus.
2. Probenvorbereitung & Ribosomenstabilisierung
- Zellen oder Gewebe werden entnommen und mit Inhibitoren der Translationserweiterung (z. B. Cycloheximid) behandelt, um Ribosomen an ihrem Platz einzufrieren.
- Die schnelle Verarbeitung unter RNase-freien Bedingungen bewahrt Ribosomen-mRNA-Komplexe und verhindert deren Abbau.
3. Polysom-Profilierung mittels Sukrosegradienten-Ultrazentrifugation
- Zytoplasmatische Extrakte werden auf ein lineares Saccharosegradient (typischerweise 10-50%) geschichtet.
- Die Ultrazentrifugation trennt mRNA-Ribosomen-Komplexe basierend auf der Dichte und liefert Fraktionen, die unterscheiden.
- Die UV-Absorptionsprofilierung definiert präzise die Peaks, die jeder Fraktion entsprechen.
4. Fraktionensammlung & RNA-Extraktion
Einzelne Gradientfraktionen werden gesammelt, entweder:
- Als eine einzelne "gebündelte Polysomfraktion" (für kosteneffektives globales Profiling).
- Oder als mehrere Fraktionen (leichte vs. schwere Polysomen) für eine tiefere Auflösung von translationalen Verschiebungen.
- RNA wird aus jeder Fraktion extrahiert, wobei eine hohe Integrität für die nachgelagerte Sequenzierung sichergestellt wird.
5. Bibliotheksvorbereitung & Next-Generation-Sequenzierung
RNA unterliegt:
- rRNA-Depletion oder Poly-A-Selektion (je nach Studienziel).
- Fragmentierung und Adapterligierung.
- Reverse-Transkription und Bibliotheksamplifikation.
Bioinformatische Analyse und Dateninterpretation
Exzellenz in der Bioinformatik
- Strenge Qualitätskontrolle und Filterung
- Ausrichtung an Referenzgenomen oder Transkriptomen
- Transkriptquantifizierung über Fraktionen hinweg
- Berechnung der Übersetzungseffizienz (TE)
- Differenzielle Übersetzungsanalyse zwischen Bedingungen
- Integration mit:
- RNA-Seq
- Epitranskriptomik (z. B. m6A, m7G)
- Proteomik
Liefergegenstände umfassen:
- Veröffentlichungsbereite Diagramme und Abbildungen
- Umfassende statistische Berichte
- Experteninterpretation, die auf Ihre Studienziele zugeschnitten ist
Beispielanforderungen
| Probenart | Mindestbetrag | Notizen |
|---|---|---|
| Mammalianzelllinien | ≥ 4 × 10⁷ Zellen | Unter Standardbedingungen kultiviert; Überkonfluenz vermeiden. |
| Tiergewebe | ≥ 400 mg | Sofort nach der Dissektion schockgefrieren. |
| Pflanzengewebe | ≥ 400 mg | Entfernen Sie überschüssiges Wasser, bevor Sie es einfrieren. |
| Bakterienkulturen | ≥ 4 × 10⁷ Zellen | Ernten Sie während der Log-Phase für optimale Ribosomenaktivität. |
| Pilzkulturen | ≥ 4 × 10⁷ Zellen | Stellen Sie eine ordnungsgemäße Homogenisierung vor der Lyse sicher. |
| Isolierte Ribosomenkomplexe | Variable; anfragen | Benutzerdefinierte Protokolle verfügbar für spezialisierte Projekte. |
Probenhandhabungsrichtlinien
- Sofort nach der Ernte Proben in flüssigem Stickstoff schockfrosten.
- Bei -80 °C lagern bis zum Versand.
- Versenden Sie auf Trockeneis, um die RNA-Integrität zu gewährleisten.
- Kennzeichnen Sie alle Röhren deutlich und stellen Sie ein detailliertes Probenblatt zur Verfügung.
- Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
Was Sie von unserem Polysomen-Sequenzierungsdienst erhalten werden
- Roh-FASTQ-Dateien aus der Hochdurchsatz-Sequenzierung.
- BAM-Alignmentsdateien, die auf Referenzgenome oder Transkriptome abgebildet sind.
- Quantifizierte Genexpressionsdaten über Polysomfraktionen.
- Übersetzungseffizienz (TE) Berechnungen für jedes Transkript.
- Listen von Genen, die eine unterschiedliche Translation zwischen den Bedingungen zeigen.
- Polysomprofil-Diagramme, die die Ribosomenbesetzung veranschaulichen.
- Vulkanplots und Heatmaps zur Visualisierung von Translationsänderungen.
- Optionale Multi-Omics-Integration mit RNA-Seq, Epitranskriptomik oder Proteomik.
- Ein umfassender technischer Bericht mit Methoden, Ergebnissen und Interpretationen.
- Direkter Zugang zu unseren Wissenschaftlern für Datenüberprüfungen und Projektdiskussionen.
Warum sollten Sie unseren Polysom-Sequenzierungsdienst wählen?
Unübertroffene Übersetzungsinsights
- Gehe über die mRNA-Häufigkeit hinaus, um zu sehen, wie Gene tatsächlich auf der Ebene der Proteinsynthese exprimiert werden.
- Erfassen Sie die globalen Übersetzungsdynamiken und identifizieren Sie regulatorische Engpässe bei Krankheiten, Stressreaktionen und Entwicklungsprozessen.
Flexibilität für vielfältige Forschungsziele
- Einzel- oder Mehrfraktionsoptionen für eine maßgeschneiderte Analysevertiefung.
- Kompatibel mit einer Vielzahl von Organismen, von Säugetierzellen über Pflanzen bis hin zu Mikroben.
- Ultraniedrig-Eingangsprotokolle verfügbar für wertvolle oder begrenzte Proben.
Nahtlose Multi-Omics-Integration
Integrieren Sie Polysomdaten mit:
- Transkriptomik (RNA-seq)
- Epitranskriptomik (z.B. m6A, m7G Modifikationen)
- Proteomik
- Erhalten Sie einen ganzheitlichen Überblick über die Regulation der Genexpression.
Veröffentlichungsfertige Ergebnisse
- Hochwertige Abbildungen und statistische Analysen, die für wissenschaftliche Zeitschriften erstellt wurden.
- Klare Dokumentations- und Methodenabschnitte, die für die Aufnahme in ein Manuskript geeignet sind.
Expertenwissenschaftliche Unterstützung
- Direkter Zugang zu Doktoranden mit umfangreicher Erfahrung in der translationale Forschung.
- Personalisierte Anleitung von der Versuchsplanung bis zur Dateninterpretation.
- Schnelle Reaktionszeiten, um Ihr Projekt voranzutreiben.
Nachweisliche Erfolgsbilanz
- Unterstützte Hunderte von Publikationen in peer-reviewed Fachzeitschriften.
- Vertraut von Forschern weltweit in der Akademia, Pharma und Biotechnologie.
Anwendungen der Polysom-Sequenzierung
Krebsforschung – Entdecken Sie die translativen Umprogrammierungen, die das Tumorwachstum und die Therapieresistenz vorantreiben.
Studien zu RNA-Modifikationen – Entdecken Sie, wie m6A, m7G und andere Modifikationen die Übersetzungseffizienz beeinflussen.
Neurobiologie – Untersuchen Sie die translationale Kontrolle in der neuronalen Entwicklung, Plastizität und neurodegenerativen Erkrankungen.
Pflanzenwissenschaft – Untersuchen Sie Stressreaktionen, Entwicklung und Ertragseigenschaften auf translationaler Ebene in Pflanzen.
Stoffwechselforschung – Untersuchen Sie Übersetzungsverschiebungen bei Stoffwechselstörungen und Nährstoffwahrnehmung.
Stammzell-Differenzierung – Erforschen Sie translatonale Landschaften, die Zellschicksalsentscheidungen leiten.
Mikrobielle Physiologie – Analysiere die translationale Regulation von Bakterien und Pilzen unter Umweltveränderungen.
Nicht-kodierende RNA Übersetzung – Verborgene Peptide aus lncRNAs, circRNAs und anderen ncRNAs erkennen.
Stressreaktionsmechanismen – Profil globaler Translationsänderungen unter Hitzeschock, oxidativem Stress oder Hypoxie.
Studien zum Wirkmechanismus von Arzneimitteln – Bewerten Sie, wie therapeutische Verbindungen die Translationseffizienz und das Ribosomenengagement beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
1. Was ist Polysome-Seq und wie funktioniert es?
Polysome-Seq kombiniert Polysom-Profiling mit RNA-Sequenzierung, um den translationalen Status im gesamten Transkriptom zu bewerten – indem leichte und schwere ribosomale Fraktionen getrennt und deren mRNA-Gehalt zur Analyse der Translationseffizienz quantifiziert wird.
2. Wie unterscheidet sich Polysome-Seq von Ribo-Seq?
Polysome-Seq profiliert die Anzahl der Ribosomen auf jeder mRNA und bietet einen Überblick über die globale Translation. Im Gegensatz dazu kartiert Ribo-seq die Positionen der Ribosomenfußabdrücke mit Kodonauflösung – ideal zum Nachweis von Startstellen, uORFs und pausierter Translation.
3. Kann Polysome-Seq die Translation von nicht-kodierenden RNAs nachweisen?
Ja. Durch die Sequenzierung längerer mRNA-Fragmente aus Polysomfraktionen kann Polysome-Seq aktiv übersetzte lncRNAs, circRNAs und andere ncRNAs erfassen und versteckte Peptide aufdecken.
4. Welche Probenarten sind mit Polysome-Seq kompatibel?
Zu den gängigen Proben gehören kultivierte Zellen, tierische oder pflanzliche Gewebe, Bakterien, Pilze und sogar gereinigte Ribosomenkomplexe. Eine ordnungsgemäße Probenhandhabung und die Stabilisierung der Ribosomen sind entscheidend.
5. Wird spezielles Equipment benötigt?
Ja. Die Polysom-Profilierung basiert auf Ultrazentrifugation, Gradientenfraktionierung und UV-Detektion. Diese Schritte erfordern technisches Fachwissen und hochwertige Reagenzien – genau das, was unser Team bietet.
6. Welche bioinformatischen Analysen sind enthalten?
Unsere Pipeline umfasst Daten-QC, Genom-/Transkriptom-Ausrichtung, Transkriptquantifizierung, TE-Berechnung, differenzielle Übersetzungsanalyse und Visualisierungen. Eine Integration mit RNA-Seq, Epitranskriptomik oder Proteomik ist ebenfalls verfügbar für ein umfassendes translationales Profil.
7. Was sind die Einschränkungen von Polysome-Seq?
Potenzielle Herausforderungen umfassen große Anforderungen an die Stichprobengröße und eine moderate RNA-Rückgewinnungseffizienz. Darüber hinaus werden keine positionsbezogenen Ribosomdaten bereitgestellt – im Gegensatz zu Ribo-seq.
8. Können Polysome-Seq und Ribo-Seq zusammen verwendet werden?
Absolut. Die Kombination beider Methoden ergibt eine ganzheitliche Sicht: Polysome-Seq zeigt die translationale Aktivität, während Ribo-seq Details zur Ribosomenpositionierung und nicht-kanonischen Translationsevents liefert.
9. Wie werden Polysomprofil-Daten interpretiert?
Profile zeigen die Ribosomenverteilung über mRNA anhand von UV-Absorptionsspitzen. Das Verhältnis von Polysomen zu Monosomen weist auf die translationalen Aktivitäten hin. Die anschließende Sequenzierung ermöglicht eine quantitative Analyse der Translationseffizienz.
10. Welche Qualitätskontrollmaßnahmen sind vorhanden?
Wir führen strenge Kontrollen in jeder Phase durch – Reproduzierbarkeit des UV-Profils, RNA-Integrität (RIN-Score), Qualitätsmetriken der Bibliothek und bioinformatische Qualitätskontrolle. Diese gewährleisten zuverlässige, hochwirksame Ergebnisse.
Titel: METTL5 stabilisiert c-Myc, indem es die Translation von USP5 erleichtert, um den Glukosestoffwechsel umzuprogrammieren und das Fortschreiten des hepatozellulären Karzinoms zu fördern.
Bitte geben Sie den Text an, den Sie übersetzen möchten. Xia et al. Krebs-Kommunikation, 2023
Impact Faktor: 20,1
Studienhintergrund
- METTL5 ist eine 18S rRNA Methyltransferase.
- Wissenschaftler vermuteten, dass METTL5 Krebs fördern könnte, indem es beeinflusst, wie bestimmte mRNAs in Proteine übersetzt werden.
- Der Fokus lag auf c-Myc, einem kritischen Onkogen, und USP5, einer Deubiquitinase, die c-Myc stabilisiert.
Wichtige Forschungsfragen
- Beeinflusst METTL5 die c-Myc-Proteinspiegel durch translativen Regulation?
- Wie beeinflusst dies den Stoffwechsel von Krebszellen?
Verwendete Methoden
✅ Polysom-Profilierung + RNA-Seq
- Getrennte mRNAs in Fraktionen basierend auf der Ribosomenbeladung.
- Sequenzierte polysomgebundene mRNAs zur Bewertung der Translationseffizienz.
✅ qRT-PCR und Western Blot
- Verifizierte Änderungen in RNA- und Proteinspiegeln.
✅ ChIP-Analyse & Metabolomik
- Untersuchte regulatorische Mechanismen und metabolische Veränderungen.
✅ Patient-abgeleitete Xenografts (PDX)
- Validierte Ergebnisse in Tiertumormodellen.
Wesentliche Ergebnisse
- METTL5 reguliert die Translation von USP5-mRNA hoch, was zu höheren USP5-Proteinspiegeln führt.
- USP5 stabilisiert das c-Myc-Protein, indem es dessen Abbau verringert.
- Erhöhtes c-Myc fördert die gesteigerte Expression von glykolytischen Genen (z. B. LDHA, ENO1).
- Der Knockdown von METTL5 führt zu einem reduzierten Tumorwachstum bei Mäusen.
Auswirkungen der Polysom-Sequenzierung
Die Polysom-Sequenzierung war entscheidend, weil:
- Standard-RNA-seq allein würde die erhöhte Übersetzungseffizienz von USP5 nicht offenbaren.
- Nur durch die Analyse ribosombeladener Fraktionen konnten die Forscher feststellen, wie METTL5 die Produktion von USP5 steigert.
- Helfen Sie dabei, RNA-Methylierung (über METTL5) mit metabolischer Umprogrammierung zu verknüpfen – einem Schlüsselmerkmal von Krebs.
USP5 ist das Deubiquitinierungsenzym für c-Myc.
Warum es wichtig ist
✅ Polysome-seq deckt translatonale Regulation auf, die allein durch Transkriptomik unsichtbar bleibt.
✅ Ermöglicht die Entdeckung therapeutischer Ziele wie METTL5.
✅ Zeigt echte Auswirkungen in Krankheitskontexten, von molekularen Mechanismen bis zu Tumorergebnissen.
