Absolute quantitative 16s/18s/ITS Amplicon-Sequenzierung

Die Einführung der Quantifizierung von Mikroorganismen durch Amplicon-Sequenzierung

16S-rRNA-Gen-Sequenzierung wird häufig zur Identifizierung, Klassifizierung und Quantifizierung von Mikroben innerhalb komplexer biologischer Mischungen verwendet. Kurz gesagt, die hypervariablen Regionen der 16S-rDNA in Prokaryoten werden durch PCR amplifiziert. Anschließend werden die Amplifikate sequenziert auf Hochdurchsatz-Sequenzierung Plattform. Die Datenanalyse dieser einzigartigen hypervariablen Regionen wird durchgeführt, um die relative Häufigkeit jedes Taxons in einer Gemeinschaft zu bestimmen und das taxonomische Profil zwischen Gruppen von Interesse zu vergleichen. Diese Analyseebene kann helfen, Veränderungen im gesamten mikrobiellen Profil im Laufe der Zeit oder zwischen Behandlungsgruppen zu erfassen. Diese Methode spielt somit eine entscheidende Rolle beim Studium der Zusammensetzung und dynamischen Veränderungen von Mikrobiomen in komplexen Umweltproben.

Abbildung 1. Die Regionen und Primer der 16S rRNA.

In letzter Zeit hat das Problem der absoluten Quantifizierung einer bestimmten Gruppe von Mikroorganismen in einer spezifischen Umweltprobe zunehmend Aufmerksamkeit erregt. In der Vergangenheit wurde dies durch die absolute Quantifizierung von qPCR spezifischer Arten nachgewiesen, jedoch sind die Ergebnisse der qPCR oft instabil, und es müssen spezifische Primer für die qPCR spezifischer Arten entworfen werden, was eine höhere Primer-Spezifität erfordert. Derzeit ist die allgemeine 16S rRNA-Sequenzierung Die Methode kann relative Häufigkeitsdaten nur durch das Verhältnis der Anzahl der Sequenzen eines bestimmten OTUs zur Gesamtanzahl der Sequenzen erhalten.

Die CD-Genomik kann die Quantifizierung von Mikroorganismen durch Amplicon-Sequenzierung basierend auf 16S-Standardsequenzen ermöglichen, um absolute Abundanzdaten für Arten in der Probe zu erhalten. Die 16S-Amplicon-Bibliothek wird erstellt und sequenziert, indem eine synthetische Sequenz mit bekanntem Kopienzahl zur DNA der Probe hinzugefügt wird, und anschließend wird eine Standardkurve basierend auf der Anzahl der Amplicon-Reads und der absoluten Kopienzahl der externen Standardsequenz erstellt. Schließlich wird die absolute Kopienzahl des 16S-rRNA-Gens der entsprechenden Art der OTU-Vertretersequenz in der Probe berechnet.

Vorteile der absoluten quantitativen 16s/18s/ITS-Amplikon-Sequenzierung

• Die praktische Umsetzung ist einfacher, mit höherem Durchsatz und breiterer Anwendbarkeit;
• Es kann die Auswirkungen von Faktoren wie PCR-Amplifikation und Sequenzierung auf die quantitative Analyse von bakteriellen Gemeinschaften in Proben effektiv reduzieren;
• Es kann die genaue Zusammensetzung von bakteriellen Gemeinschaften innerhalb von Proben präzise widerspiegeln und bietet genauere Datenreferenzen für die Forschung.

Anwendung der absoluten quantitativen 16s/18s/ITS Amplicon-Sequenzierung

Die absolute quantitative 16S-Amplikon-Sequenzierung bietet eine präzisere Möglichkeit, die tatsächliche Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften innerhalb von Proben nachzuvollziehen. Ihre Anwendung geht über herkömmliche Nachweismethoden hinaus und umfasst verschiedene Aspekte wie:

• bakterielle Verteilung und Dynamik,
• funktioneller Stoffwechsel,
• sowie ökologische und evolutionäre Einblicke in bakterielle Populationen.

Absolute quantitative 16s/18s/ITS Amplicon-Sequenzierungs-Workflow

Der analytische Prozess beginnt mit der Entnahme von Proben und der Extraktion von mikrobieller DNA, gefolgt von der Erstellung von Bibliotheken, die gezielte Regionen wie 16S/18S rRNA-Gene oder ITS-Regionen amplifizieren, was zur Bildung von Sequenzierungsbibliotheken führt. Daraufhin erfolgt das Hochdurchsatz-Sequencing der Amplicons. Die anschließende Phase umfasst eine umfassende Datenanalyse, die die Überprüfung der Sequenzdatenqualität, das Clustern oder Denoising von Sequenzen zur Erstellung von OTUs oder ASVs, die taxonomische Zuordnung und die präzise Quantifizierung von Mikrobenarten beinhaltet.

Dienstspezifikationen

	Beispielanforderungen Probenart: reguläre Bodenproben und Stuhlproben, andere Probenarten müssen bewertet werden. Boden ≥ 5 g; Stuhl ≥ 2 g gDNA-Menge: > 500ng; gDNA-Konzentration ≥ 20ng/μL Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.
Klicken	Sequenzierungsstrategie Empfohlene Region: V3/V4/V3+V4/V4+V5 MiSeq PE250/PE300, HiSeq PE150 oder MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 ≥ 15W Lesevorgänge pro Probe
	Bioinformatische Analyse Filtern Sequenzierungsdaten-QC Liest Zusammenstellungen, erhalte eindeutige Tags OTU-Generierung und statistische Analyse OTU-Quantifizierung Artenzusammensetzungsanalyse Alpha-Diversitätsanalyse Beta-Diversitätsanalyse Vielfaltstatistiken …… Fortgeschrittene Bioinformatik: Meta-Analyse Multi-Omics-Integration Cluster-Algorithmen …… Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details zur absoluten quantitativen 16s/18s/ITS-Amplikon-Sequenzierung für Ihre Schreibanpassung.

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

Die Taxonomieverteilung aller Proben auf der Phylum-Klassifikationsebene.

Artenhäufigkeit Wärmekarte.

Seltenheitskurve der sequenzierten Reads für Proben (Die obige Abbildung) & Die Tiefe der Sequenzierungsproben (Die untere Abbildung).

Boxplot-Analyse basierend auf Bray-Curtis (A), binärem Jaccard (B), ungewichteten Unifrac (C) und gewichteten Unifrac (D).

PCoA-Analyse basierend auf Bray-Curtis (A), binärem Jaccard (B), ungewichteten Unifrac (C) und gewichteten Unifrac (D).

UPGMA-Baum.

Mittelwert der behandelten und der Kontrollgruppe.

Kladogramm.

LDA-PUNKTZAHL.

1. Wie unterscheidet sich die absolute quantitative Amplicon-Sequenzierung von der traditionellen Amplicon-Sequenzierung?

Traditionell Amplicon-Sequenzierung liefert Daten zur relativen Häufigkeit, die irreführend sein können, da sie keine Variationen in der Gesamtmikrobenlast zwischen den Proben berücksichtigt. Die absolute quantitative Amplicon-Sequenzierung verwendet interne oder externe Standards, um absolute Zählungen von mikrobiellen Taxa bereitzustellen, was ein genaueres Bild der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft vermittelt.

2. Welche Arten von Proben sind für die Analyse mittels absolut quantitativer Amplicon-Sequenzierung geeignet?

Diese Methodik ist vielseitig und kann effektiv bei einer Vielzahl von Probenarten eingesetzt werden, einschließlich Boden, Wasser, Luft, menschlichen und tierischen Geweben, Pflanzenproben sowie einer Reihe von Umwelt- und Industriematrizen.

3. Was ist die Maßeinheit für die absolute Quantifizierung in der 16S-Amplikon-Sequenzierung?

Die Maßeinheit für die absolute Quantifizierung kann entweder 16S-Kopien/g Probe oder 16S-Kopien/ng DNA sein. Die Verwendung von 16S-Kopien/g Probe ist jedoch im Allgemeinen genauer und vorzuziehen. Dieser Ansatz berücksichtigt Variationen in der Menge des Ausgangsmaterials, was zu zuverlässigeren und besser interpretierbaren Ergebnissen in der Analyse von mikrobiellen Gemeinschaften führt.

4. Was sind OTUs und ASVs?

Operationale taxonomische Einheiten (OTUs) dienen als konsolidierte Cluster ähnlicher Sequenzen, die basierend auf einem vordefinierten Ähnlichkeitsschwellenwert, häufig auf dem 97%-Marke, abgegrenzt werden. Im Gegensatz dazu stellen Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) Sequenzen von höchster Präzision auf der Ebene einzelner Nukleotide dar; sie werden durch Denoising-Algorithmen abgeleitet und verkörpern daher unterschiedliche Sequenzvarianten.

5. Was sind die Vorteile der Integration von absoluter Quantifizierungsanalyse mit Metabolomik?

Die Analyse der absoluten Quantifizierung liefert die absolute Häufigkeit von Arten, während aktuelle Metabolomik-Techniken, wie gezielte und ungezielte Metabolomik, die absoluten Konzentrationen von Metaboliten ergeben. Die Integration von Mikrobiom- und Metabolom-Daten beinhaltet typischerweise die Korrelation der relativen Häufigkeiten von Arten mit den absoluten Konzentrationen von Metaboliten, was zu fehlerhaften Schlussfolgerungen führen kann. Daher wird dringend empfohlen, nachfolgende Korrelationsanalysen auf den absoluten Häufigkeiten von Arten und den absoluten Konzentrationen von Metaboliten zu basieren. Dieser Ansatz liefert genauere und zuverlässigere Ergebnisse.

Synthetische Gemeinschaft, die aus dem Rhizosphärenbereich von veredeltem Wassermelonenpflanzen stammt, bietet unveredelten Wassermelonenpflanzen Schutz gegen Fusarium oxysporum durch mikrobielle synergistische Effekte

Journal: Mikrobiom
Impact-Faktor: 16,837
Veröffentlicht: 05. Juni 2024

Hintergrund

Forschungen haben die bedeutende Rolle von mikrobielle Gemeinschaften im Wurzelraum für die Gesundheit und das Wachstum von Pflanzen hervorgehoben. Strategien wie der Anbau resistenter Pflanzen und die Transplantation von Rhizosphärenmikrobiota (RMT) werden als effektive Werkzeuge zur Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen anerkannt. Neueste Studien haben das Konzept des "Kernmikrobioms" in den Rhizosphären von Pflanzen betont, das aus mikrobiellen Arten besteht, die eng mit der Wirtspflanze in verschiedenen Umgebungen verbunden sind. Das Auftreten von synthetischen Gemeinschaften (SynComs) bietet einen neuartigen Ansatz zur Verbesserung der Pflanzengesundheit in nicht-sterilen Umgebungen. Diese Studie hatte zum Ziel, die Auswirkungen von mikrobielle Gemeinschaften im Wurzelraum von veredelten Wassermelonen auf die Krankheitsresistenz zu untersuchen und die Wirksamkeit von SynComs zur Förderung der Pflanzengesundheit zu bewerten. Darüber hinaus wurde eine effiziente Methodik zur Konstruktion und Vereinfachung funktioneller SynComs entwickelt, die auf synergistischen Wechselwirkungen zwischen den Mitgliedern der Gemeinschaft basiert.

Methoden

Ergebnisse

Die schützenden Effekte des SynCom wurden untersucht, indem die mikrobielle Gemeinschaftszusammensetzung der Rhizosphäre und die metagenomischen Profile zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen verglichen wurden. Die Inokulation mit SynCom normalisierte die mikrobielle Vielfalt als Reaktion auf die Befall mit Pathogenen, wobei bemerkenswerte Zunahmen der relativen Häufigkeiten von nützlichen Gattungen wie Pseudomonas und Streptomyces zu verzeichnen waren. Darüber hinaus führte die Inokulation mit SynCom zu komplexeren Mikrobiom-Netzwerken mit verbesserter Stabilität und erhöhter Gemeinschaftszusammenhalt, was möglicherweise die Krankheitsresistenz fördert.

Abb. 1. Veränderungen in der Zusammensetzung der mikrobielle Gemeinschaft im Rhizosphäre und im Funktionsprofil von Pflanzen, die mit SynCom inokuliert wurden.

Die metagenomische Analyse zeigte unterschiedliche funktionale Eigenschaften, die durch das SynCom in der Rhizosphären-Gemeinschaft ausgelöst wurden. Es wurden signifikante Unterschiede in der Häufigkeit der KEGG-Weg-Abundanz zwischen den mit SynCom behandelten und den Kontrollgruppen beobachtet, mit angereicherten Wegen, die mit dem Zwei-Komponenten-System und der Biofilmbildung in Verbindung stehen. Besonders Pseudomonas zeigte nach der Inokulation mit SynCom einen bemerkenswerten Anstieg der Häufigkeit, was eine effektive Kolonisierung und eine negative Korrelation mit Rhizosphärenpathogenen demonstriert. Weitere Analysen hoben die Anreicherung von Genen hervor, die mit dem Weg zur Biofilmbildung von Pseudomonas assoziiert sind, hauptsächlich aus Mitgliedern des SynCom stammend, was auf eine entscheidende Rolle von Pseudomonas bei der Krankheitsunterdrückung und dem Wachstum von Wassermelonenpflanzen hinweist.

Die synergistischen Wechselwirkungen zwischen SynCom-Mitgliedern und Pseudomonas tragen zum Wachstum und zur Kolonisierung von Pseudomonas in der Rhizosphäre bei und fördern das Pflanzenwachstum. Die Analyse des Konkurrenzpotenzials und der Wechselwirkungen zwischen den Kernstämmen ergab eine geringe Konkurrenz und positive Korrelationen. In vitro Co-Kultur-Experimente zeigten, dass bestimmte SynCom-Stämme das Wachstum anderer Stämme förderten, wobei metabolomische Analysen potenzielle Kreuznahrungsmetaboliten identifizierten. Insgesamt heben diese Ergebnisse die Bedeutung der metabolischen Erleichterung für die Förderung synergistischer Kooperationen zwischen SynCom-Mitgliedern und Pseudomonas hervor.

Abb. 2. In-vitro-Interaktionsmatrix und Substratverarmungsprofile zwischen einzelnen SynCom-Stämmen.

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigt, dass zentrale Rhizosphärenbakterien von veredelten Wassermelonenpflanzen ein SynCom bilden, das effektiv Krankheiten kontrolliert und das Wachstum bei unveredelten Pflanzen fördert. Eine erhöhte Häufigkeit von Pseudomonas und eine verbesserte Biofilmbildung deuten auf ihre entscheidende Rolle für die Pflanzengesundheit hin. In vitro-Tests zeigen eine metabolische Erleichterung zwischen den Mitgliedern des SynCom und Pseudomonas, was zu einem vereinfachten SynCom mit erhaltenen wachstumsfördernden Effekten führt. Dies hebt das Potenzial von SynComs zum Schutz von Pflanzen vor biotischen Stressfaktoren hervor und betont die Bedeutung des Verständnisses und der Manipulation mikrobieller Interaktionen in der Rhizosphäre für das ökologische Pflanzenmanagement.

Referenz

1. Qiao Y, Wang Z, Sun H, et al. Eine synthetische Gemeinschaft, die aus dem Rhizosphärenbereich von veredeltem Wassermelonenpflanzen stammt, bietet unveredelter Wassermelone Schutz gegen Fusarium oxysporum durch mikrobielle synergistische Effekte. Mikrobiom, 2024, 12(1): 101.