RAD-seq Dienst

RAD-seq bietet eine kostengünstige Möglichkeit, genetische Variationen aufzudecken und genetische Karten zu erstellen. CD Genomics bietet fortschrittliche RAD-seq-Techniken an, darunter dd-RAD und 2b-RAD, um hochwertige genomische Einblicke zu liefern, die auf Ihre Forschungsbedürfnisse zugeschnitten sind.

Was ist RAD-Seq?

Restriction-site-associated DNA-Sequenzierung (RAD-seq) ist eine robuste Methode zur Analyse von genomischem DNA an Stellen, die von spezifischen Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Ursprünglich 2008 von Baird et al. eingeführt, umfasst der traditionelle RAD-seq-Ansatz eine einmalige Restriktionsenzymverdauung von genomischem DNA, gefolgt von der Zugabe von Adaptern und anschließendem zufälligem Zerschneiden dieser Fragmente durch Sonikation. Diese Methodik liefert hauptsächlich Lese 1-Sequenzen, die genau mit den Erkennungsstellen des Enzyms übereinstimmen, während Lese 2-Sequenzen aufgrund der zufälligen Fragmentierung erhebliche Variabilität aufweisen.

RAD-seq bietet erhebliche Vorteile in Studien mit Arten ohne Referenzgenom. Einer seiner Hauptvorteile ist die signifikante Senkung der Sequenzierungskosten im Vergleich zu Whole-Genome-Sequenzierungwährend sie gleichzeitig eine Fülle von genomweiten Variationsdaten bereitstellt. Diese Eigenschaften machen RAD-seq besonders wertvoll in verschiedenen Anwendungen, wie der Entwicklung molekularer Marker, dem Aufbau genetischer Karten, der Kartierung von Genen und quantitativen Merkmalsloci (QTL). genomweite Assoziationsstudien (GWAS), Populationsgenetikund molekulare Züchtung.

Variationen von RAD-seq, einschließlich Double Digest-RAD (dd-RAD), 2b-RAD, und spezifisch lokus amplifizierte Fragmente-RAD (SLAF-RAD), wurden entwickelt, um unterschiedlichen experimentellen Bedürfnissen gerecht zu werden. Die Unterschiede zwischen diesen Techniken betreffen hauptsächlich die Anzahl der verwendeten Enzyme, das Vorhandensein oder Fehlen von zufälligen Fragmentierungsschritten und das Design von Adaptern mit oder ohne Barcodes. Trotz dieser Variationen bleibt das grundlegende Prinzip konstant: Alle beinhalten die Verdauung des Genoms mit Restriktionsenzymen und die Sequenzierung der resultierenden Fragmente.

• dd-RADDiese Methode verwendet eine Kombination aus seltenen und häufigen Schneide-Restriktionsenzymen, um das Genom zu verdauen, wodurch der Bedarf an einem nachfolgenden Fragmentierungsschritt entfällt. Sie ermöglicht eine genauere Kontrolle über die Fragmentgröße und liefert reproduzierbare Ergebnisse.
• 2b-RADVerwendet Typ-IIB-Einschränkungsenzyme, die DNA-Fragmente einheitlicher Größe erzeugen. Diese Einheitlichkeit vereinfacht nachgelagerte Prozesse und verbessert die Konsistenz und Vergleichbarkeit der Ergebnisse.
• SLAF-RADTeilt Ähnlichkeiten mit dd-RAD im Verdauungsschritt, verwendet jedoch unspezifische Adapter während der Bibliotheksvorbereitung. Dieser Ansatz zielt darauf ab, Spezifität mit Flexibilität in verschiedenen experimentellen Setups in Einklang zu bringen.

Abbildung 1. Schritt-für-Schritt-Darstellung von fünf RAD-seq Bibliotheksvorbereitungsprotokollen. (Andrews et al., 2016)

Wofür wird RAD-Seq verwendet?

RAD-seq ist ein vielseitiges Werkzeug, das in einer Vielzahl von genomischen Anwendungen eingesetzt wird:

• Entwicklung molekularer Marker: Genutzt zur Entdeckung genetischer Marker, die für Zuchtprogramme und genetische Forschung entscheidend sind.
• Genetische Kartierung: Ermöglicht die Erstellung von hochdichten genetische Verknüpfungskarten, die eine detaillierte Analyse von genetischen Verknüpfungen und Vererbungsmustern ermöglicht.
• Gen-/QTL-Kartierung: Hilft dabei, QTL und spezifische Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Merkmalen verbunden sind.
• GWAS: Hilft bei der Identifizierung genetischer Varianten, die mit komplexen Merkmalen oder Krankheiten in Populationen verbunden sind.
• Populationsgenetik-Analyse: Ermöglicht die Untersuchung der genetischen Vielfalt, der Populationsstruktur und der evolutionären Beziehungen zwischen Individuen und Arten.

Vorteile unseres RAD-Seq-Services

• Bietet die gesamte genetische Distanz der Karte und ist verantwortlich für die Lokalisierung von Merkmalen für die Kunden.
• Bietet Kunden Texte für den Methodenabschnitt ihrer Artikel sowie projektbezogene Tabellen und Abbildungen.
• Flexible Preisstrategie.
• Umfangreiche Erfahrung in der Analyse großer Tier- und Pflanzengenome.
• Integration umfassender Genomik-Analysen, die verschiedene Omik-Technologiedienstleistungen anbieten, einschließlich Genomik, Transkriptomik und Epigenetik, sowie fortschrittliche und maßgeschneiderte Lösungen für Genomik-Analysen.
• Optimierte Prozesse mit kürzeren Projektzyklen.
• Kostenersparnis durch gemeinsame Analyse von Musterinformationen mit öffentlichen Datenbanken.

RAD-Seq-Workflow

RAD-seq umfasst eine strukturierte Reihe von Phasen, einschließlich:

• Fragmentierung von genomischer DNA unter Verwendung von Restriktionsendonukleasen.
• Anliegende P1-Adapter an die fragmentierte DNA.
• Aggregieren und zufällig Fragmentieren von enzymatisch gespaltenen Segmenten aus allen Proben.
• Aussortieren von Fragmenten geeigneter Dimensionen (typischerweise im Bereich von 300 bis 700 Basenpaaren).
• Ligieren von P2-Adaptern an die ausgewählten Fragmente.
• Implementierung der PCR-Amplifikation zur Anreicherung.

Der Workflow von RAD-Seq bei CD Genomics umfasst mehrere wichtige Schritte:

Dienstspezifikationen

Unsere Dienstleistungsspezifikationen umfassen hauptsächlich drei Aspekte: Probenanforderungen, Sequenzierungsstrategie und bioinformatische Analyse.

Beispielanforderungen

1. Variantenidentifikation:

DNA-Probenmenge: ≥ 3 µg.

Verdauung mit EcoRI (GAATTC).

Empfohlene Sequenzierungstiefe: ≥ 1X pro Probe (≥ 5X für Assemblierungsproben).

2. Genetische Kartierung:

DNA-Probenmenge: ≥ 3 µg.

Sequenzierungstiefe: Eltern 2-5X, Nachkommen 0,8X pro Individuum (F1, F2 usw., temporäre Populationen), 0,6X pro Individuum (RIL, DH usw., permanente Populationen).

Anwendbar auf: Haploide oder diploide Arten, alle Mapping-Populationen (F1, F2; RIL, DH usw.) mit Populationen von 100 Individuen oder mehr.

3. Bevölkerungsentwicklung:

DNA-Probenmenge: ≥ 3 µg.

Sequenzierungstiefe: ≥ 1X pro Individuum (≥ 5X für Assemblierungsproben).

Anwendbar auf: Verschiedene Subpopulationen innerhalb haploider oder diploider Arten, unterschiedliche Untergruppen von Subpopulationen, repräsentative Individuen innerhalb derselben Subpopulation. Ungefähr 10 Proben pro Subpopulation (bei Tieren ≥ 10, bei Pflanzen ≥ 15), mit insgesamt mindestens 30 Proben.

4. Probeninformationen:

DNA-Proben: Bitte stellen Sie DNA mit einer Konzentration von > 100 ng/μl und einer Gesamtmenge von > 3 μg zur Verfügung, OD 260/280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0.

Stellen Sie sicher, dass die DNA nicht degradiert ist, keine signifikanten RNA-Banden bei der Elektrophorese zeigt und klare, intakte genomische Banden aufweist, wobei das Hauptband über 100 kb liegt. Kontamination durch Polysaccharide oder Glykoproteine kann erhebliche Herausforderungen bei der DNA-Fragmenteierung darstellen und die Entfernung erschweren. Daher ist es unerlässlich, dass die bereitgestellten Proben frei von Kontamination durch Polysaccharide oder Glykoproteine sind.

Pflanzenproben: Wählen Sie junge Pflanzengewebe aus, wobei jede Probe mehr als 500 mg wiegt. Lagern und versenden Sie die Proben auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff.

Tiersamples: Frische Tiergewebe sind erforderlich, wobei fettreiche Gewebe vermieden werden sollten, und jede Probe muss mehr als 50 mg wiegen.

Für häufige Arten wählen Sie Gewebe wie Leber, Niere und Blut. Für seltene Arten stellen Sie Ohrproben oder Haarproben (mit Haarwurzeln) mit geringerem Fettgehalt zur Verfügung. Um die Auswirkungen individueller Variationen auf die anschließende Zusammenstellung zu minimieren, ist es vorzuziehen, von demselben Individuum zu entnehmen. Wenn die Arten klein sind und die DNA-Extraktionsmenge von einem Individuum für die Sequenzierung unzureichend ist, versuchen Sie, die Anzahl der entnommenen Individuen zu reduzieren, während Sie die erforderliche Menge aufrechterhalten. Stellen Sie Gewebeproben von > 50 mg zur Verfügung; bieten Sie eine ausreichende Menge an, da verschiedene Arten unterschiedliche Mengen an DNA bei der Extraktion liefern können.

Hinweis: Musterbeträge sind nur zur Referenz aufgeführt. Für detaillierte Informationen wenden Sie sich bitte an Kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Sequenzierungsstrategie

Bioinformatische Analyse

• Entwicklung molekularer Marker: Identifizierung einzelner SNPs, Identifizierung einzelner InDel-Marker, Integration von Populations-SNP-Markern.
• Hochdichte genetische Kartierung: Differenzierung von Kopplungsgruppen, Anordnung großer Markeranzahlen und Screening von verzerrten Segregationsloci.
• Populationsgenetik-Analyse: Durchführung von populationsgenetischen Analysen von SNP-Daten, einschließlich Baumkonstruktion, Analyse der Populationsstruktur und PCA-Analyse.
• Genomische Skizzenkartierung: Zusammenstellung von genomischen Skizzen und Genannotation.

Hinweis: Die empfohlenen Datenoutputs und Analyseinhalte, die angezeigt werden, dienen nur zur Referenz. Für detaillierte Informationen bitte kontaktieren Sie uns mit Ihren maßgeschneiderten Anfragen.

Analyse-Pipeline

Liefergegenstände

• Die ursprünglichen Sequenzierungsdaten
• Experimentelle Ergebnisse
• Datenanalysebericht
• Details in RAD-seq für dein Schreiben (Anpassung)

Referenz

1. Andrews KR, Good JM, Miller MR, et al. Die Kraft von RADseq für ökologische und evolutionäre Genomik nutzen. Nature Reviews GeneticsFeb 2016;17(2):81-92.

Demonstrationsergebnisse

Teilweise Ergebnisse sind unten aufgeführt:

RAD-seq häufig gestellte Fragen (FAQs)

Welche Überlegungen sind bei der Entwicklung von hochdichten SNP-Markern von größter Bedeutung?

A: Die wesentlichen Voraussetzungen und Leitprinzipien für die Entwicklung hochdichter SNP-Marker drehen sich um das Gebot, eine ausgewogene Verteilung von Fragmenten im gesamten Genom zu erreichen. Durch die Identifizierung von Sequenzen, die umfassende genomische Informationen treu repräsentieren, kann systematisch eine Vielzahl von Tausenden von SNP-Markern generiert werden. In den Anfangsstadien werden bioinformatische Techniken eingesetzt, um das Referenzgenom der Zielart (oder bekannte BAC-Sequenzen) methodisch zu bewerten. Geleitet von Faktoren wie dem GC-Gehalt des Genoms, den Eigenschaften repetitiver Sequenzen und den Attributen von Genen werden geeignete Restriktionsenzyme und Sequenzierungsbibliothekstypen ausgewählt, wobei das Hauptziel darin besteht, sicherzustellen, dass die Dichte, Konsistenz und Gesamteffizienz der molekularen Marker mit den strengen Anforderungen der genetischen Analyse und der molekularen Züchtung übereinstimmen.

Q: Was sind die Anwendungsbereiche von RAD-seq?

A: RAD-seq findet vielseitige Anwendung in verschiedenen Forschungsbereichen, einschließlich der Erstellung genetischer Karten, phylogeografischer Analysen von Polymorphismen, Assoziationsstudien und QTL-Kartierung, unabhängig davon, ob Referenzgenomdaten für eine bestimmte Art vorhanden sind oder nicht. Die breite Reichweite der RAD-Seq-Technologie erstreckt sich auf Untersuchungen zur Entdeckung von Variationen, den Bau genetischer Karten, die Erforschung funktioneller Gene und das Studium der Populationsentwicklung.

Q: Was sind die Vorteile der Anwendung von RAD-seq im Kontext von Studien zur Populationsentwicklung?

A: Bevölkerungsentwicklung Studien umfassen typischerweise eine beträchtliche Anzahl von Proben. RAD-seq bietet in dieser Hinsicht eine Reihe von deutlichen Vorteilen. Es verringert effektiv die Komplexität des Genoms, was zu geringeren Ausgaben für die Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung führt. Sein unkomplizierter Arbeitsablauf optimiert den Prozess. Darüber hinaus macht seine Unabhängigkeit von Referenzgenomen es anwendbar auf ein breiteres Spektrum von Arten. Besonders hervorzuheben ist, dass RAD-Seq bei Untersuchungen mit umfangreichen Stichprobengrößen hervorragend abschneidet und somit einen robusten Rahmen für umfassende Datenerfassung durch Technologien der Whole-Genome-Resequenzierung bietet.

F: Was unterscheidet die Nutzung eines Referenzgenoms von dessen Abwesenheit?

A: Bei der Identifizierung von Mutationsinformationen führt die Einbeziehung eines Referenzgenoms für die Sequenzanpassung und Variationsdetektion typischerweise zu höheren Effizienz- und Präzisionsniveaus. Darüber hinaus ermöglicht sie die präzise Lokalisierung spezifischer Gene und erleichtert Untersuchungen zum Populations-Linkage-Disequilibrium.

RAD-seq Fallstudien

Genomsequenz und Analyse der japanischen Morgenröte Ipomoea nil

Zeitschrift: Nature Communications

Impact-Faktor: 16,6

Veröffentlicht: 08. November 2016

Hintergrund

Ipomoea ist eine große Gattung mit vielfältigen Arten, einschließlich der kommerziell bedeutenden I. nil (Japanische Morgenröte). Forscher verwendeten Illumina und PacBio-Sequenzierung ein 750 Mb Genom von I. nil zusammenzustellen, Tpn1-Transposons zu identifizieren und das Zwergenwuchsgen CONTRACTED zu kartieren.

Materialien & Methoden

Ergebnisse

1. DNA-Sequenzierung und Genomassemblierung

Eine einzelne TKS-Pflanze wurde sequenziert, was ein Genom von 750 Mb ergab. PacBio-Sequenzierung lieferte lange Reads und eine hohe Abdeckung, die zusammen mit Illumina-Daten eine Assemblierung mit einem N50 von 3,72 Mb produzierten. Eine alternative Assemblierung nur mit Illumina war größer, aber von geringerer Qualität.

2. Fehlmontageerkennung und Pseudo-Molekülkonstruktion

RAD-seq-Daten halfen, Fehlassemblierungen zu korrigieren, was zu einer verbesserten Assemblierung führte. Pseudo-Chromosomen wurden erstellt, die 91,42 % des Genoms abdecken, mit einem N50 von 44,78 Mb.

Abbildung 1: Genomische Charakterisierungen von Ich. nil.

3. Montagevalidierung

Die Assemblierung wurde durch CEGMA- und BUSCO-Analysen validiert, die eine hohe Vollständigkeit zeigten, und wurde durch Ausrichtungen mit ESTs und BAC-Endsequenzen unterstützt, was ihre Qualität bestätigt.

4. Wiederholung der Analyse und Identifizierung von Tpn1 Transposons

Das Genom enthielt 63,29 % repetitive Elemente, einschließlich Tpn1-Transposons, von denen einige aktiv waren und mit Genstörungen bei Mutanten verbunden waren.

Abbildung 2: Das Tpn1 Familie der Transposons, die Transposasen kodieren.

5. Genvorhersage und funktionale Annotation

Es wurden 42.783 Genmodelle vorhergesagt, von denen 79,12 % annotiert sind, und RNA-seq-Daten lieferten funktionale Einblicke.

6. Analyse des Zwerggen GESCHLOSSEN (CT)

Das CT-Gen, das mit Zwergwuchs und der BR-Biosynthese assoziiert ist, wurde durch Transposon-Insertationen in Mutanten gestört, was die Genexpression beeinflusste.

7. Genom-Evolution

Die phylogenetische Analyse zeigte die engen Beziehungen von I. nil zu Tomaten und Kiwi, mit einzigartigen Genfamilien und WGD-Ereignissen, die sich von den Solanaceae unterscheiden.

Abbildung 3: Genom-Evolution.

Fazit

Die Studie nutzte fortschrittliche Sequenzierungstools, um eine hochwertige Genomassemblierung von Ipomoea nil zu erstellen, was die Scaffold-Längen und die Wiederholungsauflösung erheblich verbesserte. Sie identifizierte Schlüsselgene und Transposons, die mit Pflanzenmerkmalen und Mutationen in Zusammenhang stehen, und hob die Auswirkungen von Whole-Genome-Duplikationen auf die Pflanzenentwicklung hervor. Diese Arbeit unterstützt zukünftige Forschungen und vergleichende Genomik im Ordnung Solanales.

Referenz

1. Hoshino A, Jayakumar V, Nitasaka E, et al. Genomsequenz und Analyse der japanischen Morgenröte Ipomoea nil. Naturkommunikation2016, 8. Nov.; 7(1):13295.