Richtlinien zur Einreichung von Proben
Der kritische Bedarf an genomischer Validierung von Organoiden
Patient-abgeleitete Organoide (PDOs) haben das Krankheitsmodellieren, die personalisierte Medizin und die präzise Onkologie revolutioniert, indem sie die dreidimensionale Architektur, Zell-Zell-Interaktionen und funktionalen Eigenschaften von primären Geweben bewahren. Im Gegensatz zu traditionellen 2D-Zelllinien, die Jahrzehnte damit verbracht haben, sich an flache Kunststoffoberflächen anzupassen und oft Genome beherbergen, die völlig fremd zum ursprünglichen Patienten sind, werden PDOs als authentische "Avatare" des menschlichen Krankheitszustands gefeiert. Allerdings kann die visuelle Morphologie und der Ausdruck einiger Oberflächenmarker allein nicht garantieren, dass ein Organoid eine treue Darstellung der Krankheit des Patienten auf molekularer Ebene bleibt.
Die translationale Forschung stützt sich stark auf die Annahme, dass ein Organoid-Modell das des Patienten widerspiegelt. in vivo Tumor. Dennoch stellt die Etablierung von PDOs einen bedeutenden evolutionären Engpass dar. Während Organoide etabliert und weitervermehrt werden. in vitroSie sind kontinuierlich künstlichen Selektionsdrücken ausgesetzt. Die spezifischen Wachstumsfaktoren in den Medien (z. B. EGF, Noggin, R-spondin) könnten unbeabsichtigt das Wachstum von Wildtyp-Epithelzellen gegenüber Tumorzellen begünstigen, ein Phänomen, das als Überwucherung normaler Zellen bekannt ist. Alternativ könnten die Kulturbedingungen einen spezifischen, schnell wachsenden Subklon auswählen, der nicht den Großteil des heterogenen Primärtumors repräsentiert.
Im Laufe der Zeit können kleinere Subklone vollständig verschwinden, kulturinduzierte genetische Drift kann auftreten, und entscheidend ist, dass ansprechbare Treibermutationen aufgrund von replikativen Stress und dem Fehlen eines intakten Immunsystems, um abnormale Zellen zu beseitigen, verloren gehen könnten.
Das gesamte Exom-Sequenzieren fungiert als der ultimative Qualitätssicherungs-(QC)-Kontrollpunkt für Ihre Modelle. Durch die Profilerstellung der gesamten kodierenden Region, die die überwiegende Mehrheit der bekannten krankheitsverursachenden und medikamentenansprechenden Mutationen beherbergt, können Forscher abschließend beantworten:
- IdentitätsbestätigungBeherbergt das Organoid das Spezifische KRAS, TP53, PIK3CAoder EGFR Treiber-Mutationen, die im klinischen Bericht des Patienten identifiziert wurden?
- Klonale HeterogenitätSind die minoren subklonalen Populationen des Primärtumors in der 3D-Kultur erhalten geblieben, oder ist die Kultur monoklonal geworden?
- Genomische StabilitätDriftet das genomische Profil signifikant nach 10, 20 oder 30 Passagen?
- Abwesenheit von ArtefaktenSind neuartige, hyperproliferative Mutationen entstanden? in vitro das könnte die Ergebnisse verwirren?
Ohne WES-Validierung riskieren Forscher, Arzneimittelempfindlichkeiten oder Resistenzmechanismen zu identifizieren, die Artefakte des Kultursystems sind, anstatt wahre Spiegelungen der Krebsbiologie des Patienten. Millionen von Dollar an Screening-Bemühungen können verschwendet werden, wenn das zugrunde liegende Modell das Ziel von Interesse nicht aufweist.
Abgestimmtes Stichprobenstudien-Design: Der Triadenvergleich
Um tumor-spezifische Mutationen sicher zu identifizieren, ist die Analyse des Organoids in Isolation völlig unzureichend. Wir entwerfen Whole-Exom-Sequenzierung Projekte zu vergleichenden Beziehungen, die das ererbte Hintergrundrauschen genau subtrahieren.
Bei der Bewertung eines patientenabgeleiteten Organoids umfasst das Goldstandard-Studiendesign eine dreikomponentige "Triade":
- Abgestimmtes normales Gewebe (oder Blut)Stellt die genetischen Ausgangsvarianten des Patienten fest. Da menschliche Genome Millionen von harmlosen erblichen SNPs enthalten, ist eine passende normale Probe vom selben Patienten entscheidend.
- Primäres TumorgewebeDefiniert das ursprüngliche somatische Mutationsprofil (die "Grundwahrheit" des Krebses) vor jeglichem in vitro Manipulation.
- Organoid-Modell: Stellt das Etablierte dar in vitro Kultur wird bewertet.
Durch die gleichzeitige Sequenzierung aller drei Komponenten können unsere fortschrittlichen bioinformatischen Pipelines Keimbahnvarianten genau herausfiltern. Dies verhindert falsch-positive somatische Mutationsaufrufe. Ohne ein entsprechendes normales Sample könnte beispielsweise ein seltener erblicher SNP fälschlicherweise als neuartiger tumorspezifischer Treiber klassifiziert werden. Unsere Pipelines nutzen komplexe statistische Modelle (wie bayesianische somatische Genotypisierungsalgorithmen), um die Allelfrequenzen zwischen den normalen, Tumor- und Organoid-Proben zu vergleichen, und stellen sicher, dass nur echte erworbene Mutationen gemeldet werden.
Wenn passendes normales Gewebe absolut nicht verfügbar ist (was bei kommerziell bezogenen Biobank-Proben häufig der Fall ist), können wir Strategien zur Tumor-Only-Analyse anwenden. Diese Strategien nutzen umfangreiche Bevölkerungsdatenbanken (z. B. dbSNP, gnomAD, 1000 Genomes Project) zusammen mit Panels von Normalproben (PoN), um häufige und seltene Keimbahnvarianten herauszufiltern. Obwohl effektiv, schränkt dieser Ansatz von Natur aus die absolute Sicherheit der Bestätigung somatischer Varianten im Vergleich zum Triad-Design ein.
Schlüsselanwendungen in der translationale Forschung
Unsere Organoid-WES-Dienste unterstützen ein breites Spektrum an fortschrittlichen translationalen und präklinischen Forschungsanwendungen:
- Organoid-Biobank-Validierung und -ZertifizierungBevor PDOs für großangelegte Studien oder die Kommerzialisierung verteilt werden, müssen Biobanken ihre Modelle rigoros charakterisieren. WES bietet die standardmäßige genomische Zertifizierung, dass ein Modell das Spendergewebe genau widerspiegelt.
- Pharmakogenomik und Korrelationen bei der ArzneimittelprüfungWES ermöglicht es Forschern, spezifische genomische Veränderungen zu korrelieren (z. B. Mutationen der homologen Rekombinationsdefizienz [HRD] wie BRCA1/2) mit der Reaktion des Organoids auf gezielte Therapien (z. B. PARP-Inhibitoren), um sicherzustellen, dass der Wirkmechanismus des Medikaments mit dem Genotyp des Modells übereinstimmt.
- Modellierung der erworbenen therapeutischen ResistenzDurch die longitudinale Sequenzierung von Organoiden vor der Behandlung, während der Behandlung und nach dem Auftreten von Resistenzen. in vitroForscher können neu erworbene exone Mutationen identifizieren, die eine Arzneimittelresistenz verleihen und einen klinischen Rückfall nachahmen.
- Tumorevolution und Studien zur räumlichen HeterogenitätForscher können eine Multi-Region-Probenahme eines primären Tumors durchführen und aus diesen spezifischen Regionen unterschiedliche Organoidlinien etablieren. Die WES-Kartierung dieser Linien hilft, die räumliche Heterogenität und die klonale Evolution zu modellieren. in vitro.
- Präklinische "Avatar"-Modelle für ko-klinische StudienIn co-klinischen Studien werden Patienten-Avatare (PDOs) parallel zu den Patienten mit Medikamenten behandelt. WES bestätigt, dass der Avatar die spezifischen ansprechbaren Mutationen beibehält, die die klinische Reaktion des Patienten antreiben.
End-to-End WES-Workflow für Organoide
Die Handhabung von 3D-Organoidkulturen erfordert spezialisiertes Fachwissen, um einzigartige Herausforderungen wie Kontamination der extrazellulären Matrix (ECM), nekrotische Kerne und geringe Zellausbeuten zu überwinden. Unser Laborablauf ist stark optimiert, um die Datenqualität aus begrenzten und komplexen Eingaben zu maximieren.
Unser umfassender WES-Workflow umfasst wichtige QC-Prüfpunkte, um eine hochwertige somatische Variantenbestimmung aus Organoid-Modellen sicherzustellen.
Probenempfang & Matrix-freie DNA-Extraktion:
- Akzeptiert lebende Organoide, gefrorene Pellets oder vorextrahierte genomische DNA.
- Die vollständige Entfernung von Matrigel, BME oder synthetischen Hydrogelen ist absolut entscheidend. Restliche Matrixproteine hemmen enzymatische Reaktionen.
- QC-PrüfpunktDNA-Konzentration (Qubit), Reinheit (NanoDrop) und Integrität (DIN > 7 über TapeStation).
Erweiterte Bibliotheksvorbereitung & Exomfangerfassung:
- Hochwertige DNA wird durch akustisches Scheren (Covaris) oder Enzyme in Fragmente von 150-250 bp zerlegt.
- Adapter mit einzigartigen doppelten Indizes (UDIs) werden ligiert, um Index-Hopping zu minimieren.
- Hybridisierung an branchenführende Exom-Erfassungsproben (Agilent SureSelect XT HS2 oder Twist Bioscience), die auf kodierende Regionen, UTRs und flankierende intronische Sequenzen abzielen.
Ultra-Tiefensequenzierungsstrategie:
- Sequenziert auf modernen Illumina-Plattformen (NovaSeq X Plus, PE150).
- 100-fache Tiefe für normale Proben, ≥200-fache bis 500-fache Tiefe für primäre Tumoren und Organoide.
- Die Tiefensequenzierung gewährleistet eine robuste, statistisch signifikante Erkennung seltener Subklone (VAF < 10%).
Fortgeschrittene Triad-Bioinformatikanalyse:
- Qualitätsfilterung und Ausrichtung auf das menschliche Referenzgenom (hg38) mit BWA-MEM.
- Ensemble-Variantenerkennung unter Verwendung von erstklassigen Algorithmen (GATK Mutect2, Strelka2, VarScan2) für präzise Aufrufe.
- Umfassende funktionale Annotation von SNVs und InDels.
Wenn Sie gerade mit Ihrem Projekt beginnen, unser Organoid-Modellentwicklungsdienste kann helfen, die Sammlung und Bankierung von passenden normalen und Tumorgeweben zusammen mit Ihren Organoiden zu koordinieren.
Spezialisierte bioinformatische Analyse für PDOs
Wir bieten nicht nur eine rohe Liste von Mutationen an; wir liefern einen vergleichenden Analyse-Rahmen, der direkt beantwortet, ob Ihr Modell für Ihren spezifischen Forschungszweck geeignet ist. Unsere bioinformatischen Ergebnisse sind so gestaltet, dass sie publikationsbereit sind.
Standard-Pipeline-Funktionen
- VariantenannotationVerwendung von ClinVar, COSMIC, dbNSFP und SIFT/PolyPhen zur Vorhersage funktioneller Auswirkungen.
- Genomische ÜbereinstimmungsanalyseBerechnungen des Jaccard-Ähnlichkeitsindex und Venn-Diagramme zur Quantifizierung der genauen somatischen Überlappung zwischen dem Primärtumor und dem Organoid.
- VAF-KorrelationsbewertungStreudiagramme, die die Variantenallelfrequenzen vergleichen, um zu zeigen, ob bestimmte Subklone während der Kultur angereichert oder vermindert wurden.
Optionale erweiterte Module
- MutationssignaturanalyseExtraktion von COSMIC-Signaturen zur Bestimmung, ob grundlegende mutationale Prozesse aufrechterhalten werden. in vitro.
- Exom-basierte CNV-Inferenz: Verwendung von Werkzeugen wie CNVkit oder EXCAVATOR2 zur Ableitung gezielter Kopienzahlvariationen (z. B., HER2/ERBB2 Verstärkungen oder PTEN Löschungen) direkt aus der WES-Abdeckung.
- TMB- und MSI-BewertungGenau Schätzung der Tumormutationslast und des Mikrosatelliteninstabilitätsstatus direkt aus Exomdaten.
- Maus Lese Subtraktion (Xenograft Überprüfung)Nutzung in silico Werkzeuge wie Xenome, um Reads sowohl auf menschliche als auch auf Maus-Referenzgenome abzubilden und Maus-DNA-Kontaminationen aus PDX-abgeleiteten Modellen sauber zu subtrahieren.
Für phänotypische Integration ziehen Sie in Betracht, dies mit unserem zu koppeln. Organoid-Charakterisierungsdienste.
Musteranforderungen und Vorbereitungshinweise
Eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung bestimmt den letztendlichen Erfolg der Bibliotheksaufnahme und Sequenzierung. Organoide, die in Basalmembranextrakten eingebettet sind, erfordern eine sorgfältige Handhabung, um nachgelagerte analytische Fehler zu vermeiden. Darüber hinaus entwickeln große Organoide häufig nekrotische Kerne, die abgebautes DNA freisetzen können, was sich negativ auf die Komplexität der Bibliothek auswirkt.
| Probenart | Mindestinput | Vorbereitung & Versand | Wichtige Überlegung |
|---|---|---|---|
| Genomische DNA | ≥ 500 ng | Versand auf Trockeneis. EDTA-freie Pufferlösung (z.B. 10 mM Tris). | gDNA darf keine signifikante Degradation aufweisen (DIN > 7). Vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren und Auftauen. |
| Organoid-Pellet | 1×10^6 Zellen | Gründlich mit kaltem PBS oder Cell Recovery Solution waschen. Sofort einfrieren und auf Trockeneis versenden. | Die Entfernung unvollständiger Matrizen hemmt drastisch die Zelllyse und Extraktion. Bei großen Organoiden wird eine sanfte Dissoziation empfohlen, um nekrotisches Kernmaterial abzuwaschen. |
| Primärtumor | > 10 mg Gewebe | Sofort nach der Resektion oder Biopsie schockgefrieren. Auf Trockeneis versenden. | Die Tumorzellulärität sollte histologisch beurteilt werden; ein hoher nekrotischer oder stromaler Gehalt verringert die Sensitivität zur Erkennung von Varianten. |
| Abgestimmt Normal | > 10 mg Gewebe oder 2 mL Blut | Schnellgefrieren von normalem benachbartem Gewebe oder Blut in EDTA-Röhrchen versenden. | Wesentlich für die genaue somatische Variantenbestimmung. Das angrenzende Gewebe muss histologisch als tumorfrei bestätigt werden. Blut wird bevorzugt. |
Strategiewahl: WES vs. WGS vs. RNA-Seq vs. gezielte Panels
Die Auswahl der richtigen Sequenzierungsmodalität stellt sicher, dass Sie Ihre biologische Fragestellung beantworten, ohne Ihr Stipendium oder Budget zu überschreiten.
- Whole Exome Sequencing (WES): Am besten für Entdeckung und Validierung somatischer Mutationen im kodierenden Bereich (SNVs und InDels), Bestätigung von Treibermutationen, Identifizierung neuartiger kodierender Mutationen und Verfolgung der klonalen Evolution in hoher Tiefe. Sehr kosteneffektiv für große Biobanken. Nicht für Identifizierung großer struktureller Variationen in nicht-kodierenden Regionen.
- Whole Genome Sequencing (WGS) - Gesamtes Genom-Sequenzierung (WGS): Am besten für umfassende Kartierung des gesamten Genoms einschließlich tiefer intronischer und regulatorischer Elemente. Nicht für Routine Hochdurchsatzvalidierung mit einem Budget, aufgrund der hohen Kosten von 200X bis 500X Abdeckung über das gesamte Genom.
- Gezielte Gen-Panels: Am besten für ultra-tiefe Sequenzierung (1000X+) eines kleinen, vordefinierten Satzes bekannter Krebs-Gene, um spezifische bekannte Treiber zu verfolgen. Nicht für Entdeckung neuer Mutationen außerhalb des Panels oder umfassende Bewertung des gesamten genomischen Wandels.
- Transkriptom-Sequenzierung (RNA-Seq): Am besten für Messung der aktiven Genexpression und Identifizierung von Fusionen über unser Organoid-Forschungslösungen. Nicht für genaues Erkennen von DNA-Ebenen-Mutationen aufgrund von RNA-Bearbeitung, nonsense-vermitteltem Abbau und massivem Ausdrucks-Bias.
Referenzen:
- Luo Z, Wang B, Luo F, et al. Einrichtung einer großangelegten biobank für patientenabgeleitete hochriskante kolorektale Adenom-Organoide für Hochdurchsatz- und hochgradige Wirkstoffscreenings. BMC Medizin2023;21:336. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Dokumenten übersetzen. Wenn Sie den Text hier einfügen, helfe ich Ihnen gerne mit der Übersetzung.
- Ahn S-J, Lee S, Kwon D, et al. Wesentliche Richtlinien für die Herstellung und Anwendung von Organoiden. Internationale Zeitschrift für Stammzellen2024;17(2):102-112. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
Nur für Forschungszwecke. Nicht für die Verwendung in diagnostischen Verfahren, klinischen Entscheidungsfindungen, Patientenstratifizierung, therapeutischer Auswahl oder klinischen Studien.
Illustrative Ergebnisformate
Die folgenden geplanten Visualisierungen erklären gängige Lieferstrukturformen, die in unseren Berichten zur genomischen Integrität von Organoiden bereitgestellt werden. Es handelt sich um illustrative Beispiele, die Datenformate demonstrieren, nicht um tatsächliche Patientendaten.
Analyse der Überlappung somatischer Mutationen
Eine grundlegende Voraussetzung für die Validierung von Organoiden ist der Nachweis, wie viele somatische Mutationen geteilt werden. Ein dreiteiliger Venn-Diagramm veranschaulicht deutlich die Schnittmenge der Varianten, die im Primärtumor, im Organoidmodell und im passenden Normalgewebe identifiziert wurden. Ein hochpräzises Modell zeigt eine erhebliche Überlappung der tumorspezifischen somatischen Mutationen, mit sehr wenigen "organoid-einzigartigen" Varianten (was auf eine minimale kultivierungsbedingte Abweichung hinweist).
Korrelation der Allelfrequenzvarianten
Die Aufrechterhaltung des Anteils an Zellen mit einer Mutation ist entscheidend für die Erhaltung der Tumorheterogenität. Ein VAF-Streudiagramm kartiert die Häufigkeit jeder Mutation im Primärtumor gegen ihre Häufigkeit im Organoid. Mutationen, die entlang der Diagonalen liegen, deuten auf eine perfekte klonale Erhaltung hin. Varianten, die stark zur Y-Achse abweichen, repräsentieren kleinere Subklone, die sich währenddessen schnell ausbreiteten. in vitro Kultur.
Mutationssignatur-Profiling
Krebsgenome werden von zugrunde liegenden mutationalen Prozessen geprägt. Durch die Analyse der Häufigkeit von 96 möglichen Trinukleotid-Kontextänderungen extrahieren wir etablierte COSMIC-mutationale Signaturen aus den Exomdaten. Der Vergleich des Signaturprofils des Tumors mit dem Organoid bestätigt, ob grundlegende biologische Treiber der genomischen Instabilität (z. B. HRD, Mismatch-Reparaturdefekte) im 3D-Modell aktiv bleiben.
Organoid WES Häufig gestellte Fragen (FAQs)
1. Warum ist übereinstimmendes normales Gewebe so entscheidend? Kann man nicht einfach dbSNP verwenden?
Während Bevölkerungsdatenbanken wie dbSNP, gnomAD und das 1000-Genomes-Projekt Millionen von häufigen menschlichen Varianten enthalten, beinhalten sie nicht jede private, seltene oder familienspezifische erbliche Mutation. Ohne eine passende normale Probe (wie Blut oder gesundes angrenzendes Gewebe) vom spezifischen Patienten ist es nahezu unmöglich, eindeutig zu beweisen, dass eine neuartige Variante, die im Organoid gefunden wurde, eine echte erworbene somatische Tumormutation und nicht ein seltenes erbliches Keimbahnmerkmal ist.
2. Wie tief sollte ich meine Organoide sequenzieren?
Für die standardmäßige Analyse der Keimbahn ist eine Tiefe von 100X typischerweise ausreichend. Tumoren und ihre abgeleiteten Organoide sind jedoch hochgradig heterogen. Eine kritische Treibermutation oder ein seltener, medikamentenresistenter Subklon könnte nur in 5 % der Zellen vorhanden sein. Um diese niedrigfrequenten subklonalen Varianten (VAF < 10 %) mit statistischer Sicherheit zuverlässig nachzuweisen, empfehlen wir dringend, die Tumor- und Organoidproben mit einer Tiefe von 200X bis 500X zu sequenzieren.
3. Beeinträchtigt Matrigel die WES?
Ja. Matrigel und andere Basalmembranextrakte sind proteinreiche extrazelluläre Matrizen, die Zellen einfangen, Lysepuffer blockieren und die Enzyme hemmen können, die während der DNA-Extraktion und Bibliotheksvorbereitung verwendet werden. Organoide müssen sorgfältig aus der Matrix unter Verwendung von kalten PBS-Wäschen oder speziellen Zellrückgewinnungslösungen (wie Corning Cell Recovery Solution) zurückgewonnen werden, bevor sie zentrifugiert und eingefroren werden, um eine hohe DNA-Ausbeute und -Qualität sicherzustellen.
4. Kann WES Kopienzahlvariationen (CNVs) und Genamplifikationen erkennen?
WES ist hauptsächlich darauf ausgelegt, kleine Varianten (SNPs und InDels) in kodierenden Regionen zu erkennen. Durch spezialisierte bioinformatische Werkzeuge (wie CNVkit oder EXCAVATOR) können wir jedoch gezielte CNVs ableiten, indem wir die Lesetiefenabdeckung über gezielte Exons zwischen der Tumor-/Organoidprobe und der normalen Probe vergleichen. Dies ist äußerst effektiv zur Erkennung massiver Amplifikationen (z. B. HER2 Amplifikation in Brust-Organoiden). Beachten Sie, dass WES strukturelle Varianten-Breakpoints oder großflächige Umstellungen in nicht-kodierenden Regionen nicht zuverlässig abbilden kann; für diese Anwendungen ist eine Ganzgenomsequenzierung (WGS) erforderlich.
5. Wie viele Passagen sind zu viele? Wann sollte ich meine Organoide umsequenzieren?
Die genomische Stabilität variiert stark je nach Gewebeursprung, den spezifischen vorhandenen Mutationen (z. B. driftet bei Tumoren mit Defizit in der Mismatch-Reparatur die Stabilität viel schneller) und den selektiven Druckverhältnissen des Kulturmediums. Im Allgemeinen gelten Organoide als "frühe Passage" und sind zwischen den Passagen 1 bis 10 am stabilsten. Wir empfehlen, frühpassagierte Organoide zur ersten Validierung zu sequenzieren und regelmäßige Nachsequenzierungen (z. B. alle 10-15 Passagen) durchzuführen, wenn das Modell in einer langfristigen kontinuierlichen Kultur gehalten wird, um genetische Drift zu überwachen.
6. Unterstützen Sie Maus- oder andere nicht-menschliche Organoide?
Ja. Während menschliche PDOs die häufigsten sind, sind unsere WES-Dienste und Exomfangs-Kits vollständig kompatibel mit aus Mäusen abgeleiteten Organoiden (murinen Modellen), Hundemodellen und anderen weit verbreiteten Säugetierspezies. Bitte konsultieren Sie unser Team bezüglich der spezifischen Referenzgenome und Fang-Kits, die für Ihre Interessensspezies verfügbar sind.
7. Kann ich FFPE-Primärtumorproben einreichen, um sie mit meinen lebenden Organoiden zu vergleichen?
Ja, wir akzeptieren formalinfixiertes, paraffineingebettetes (FFPE) Gewebe. Allerdings führt die Formalinfixierung zu DNA-Crosslinking, schwerer Fragmentierung und führt zu Sequenzierungsartefakten (insbesondere C>T-Übergängen, die durch Cytosin-Deaminierung verursacht werden). Wir verwenden spezialisierte FFPE-DNA-Extraktions- und enzymatische Reparaturprotokolle (z. B. UDG-Behandlung), um dies zu mildern, aber frisches, gefrorenes Gewebe wird immer bevorzugt, wenn es verfügbar ist, um den höchsten Qualitätsvergleich zu gewährleisten.
8. In welchem Format werden die Daten geliefert und wie lange dauert es?
Die Durchlaufzeit ist projektabhängig und hängt von der Probenmenge, den Vorbereitungsanforderungen und der Sequenzierungstiefe ab. Die Daten werden sicher über einen Cloud-Download oder eine physische Festplatte bereitgestellt. Sie erhalten rohe FASTQ-Dateien, ausgerichtete BAM-Dateien, annotierte VCFs und einen umfassenden PDF-Bioinformatikbericht, der alle QC-Metriken, Tabellen und visuellen Diagramme enthält.
9. Können WES-Daten verwendet werden, um maßgeschneiderte gezielte Panels für nachgelagerte Screenings zu entwerfen?
Absolut. Viele Forscher nutzen unsere WES-Dienste für den Primärtumor und frühe Passage-Organoide, um die spezifischen patientenabgeleiteten somatischen Mutationen zu entdecken. Wir können diese Daten dann verwenden, um ein ultra-targetiertes, maßgeschneidertes Amplicon- oder Capture-Panel (z. B. 50 spezifische Mutationen) zu entwerfen. Sie können dann dieses viel günstigere maßgeschneiderte Panel verwenden, um schnell Hunderte von nachgelagerten Organoid-Klonen zu screenen oder Mutationen im Laufe der Zeit während der Medikamentenbehandlung zu verfolgen.
10. Wie gehen Sie mit der Kontamination von Mauszellen um, wenn mein Organoid aus einem PDX-Modell abgeleitet wurde?
Organoide, die aus patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) etabliert wurden, tragen oft Mausstromazellen mit sich. Wenn sie direkt sequenziert werden, wird die Maus-DNA mehrdeutig auf das menschliche Genom abgebildet, was zu massiven falsch-positiven Variantenaufrufen führt. Wir nutzen spezialisierte in silico Werkzeuge (wie Xenome), um alle Sequenzierungsreads gleichzeitig auf die Referenzgenome von Mensch und Maus abzubilden. Wir identifizieren und verwerfen eindeutig die Maus-Reads, um sicherzustellen, dass die Variantenbestimmung ausschließlich auf der DNA der menschlichen Organoide erfolgt.
Fallstudien: Validierung der genomischen Integrität für Hochdurchsatzanwendungen
Fallstudie 1: Validierung einer Biobank für kolorektale Adenom-Organoide
Hintergrund
Die Einrichtung von großangelegten Biobanken ist entscheidend für hochdurchsatzfähige pharmakologische Tests. Bevor eine Biobank jedoch als zuverlässig für die Arzneimittelprüfung angesehen werden kann, muss die in vitro Modelle müssen rigoros validiert werden, um sicherzustellen, dass sie die genetische Landschaft der ursprünglichen Patientengewebe widerspiegeln. In einer umfassenden Studie aus dem Jahr 2023 hatten Forscher das Ziel, eine lebende Biobank von hochriskanten kolorektalen Adenom-Organoiden aufzubauen, um die Krebsneigung und die Arzneimittelreaktion zu untersuchen.
Methodik
Um die Treue ihrer Modelle zu beweisen, isolierten die Forscher genomische DNA aus den primären Adenomgeweben, den entsprechenden Organen in frühen Passage und dem passenden normalen Patientengewebe (um als Keimbahnkontrolle zu dienen). Sie führten eine Whole Exome Sequencing (WES) unter Verwendung eines passenden Triad-Designs durch. Die Sequenzierung wurde mit hoher Tiefe durchgeführt, um sicherzustellen, dass selbst seltene subklonale Varianten erkannt wurden. Die bioinformatische Pipeline nutzte die GATK Best Practices für die Keimbahnfilterung, gefolgt von der somatischen Variantenbestimmung zur Identifizierung spezifischer SNPs und InDels.
Ergebnisse
Die vergleichenden WES-Daten zeigten eine auffällige genomische Übereinstimmung. Die Organoide behielten treu die überwiegende Mehrheit der somatischen Mutationen, die in den elterlichen Adenomen vorhanden waren. Entscheidenderweise waren spezifische krebsvorinduzierende Treibermutationen im Wnt/β-Catenin-Signalweg (z. B. APC Mutationen) und der PI3K/AKT-Weg waren perfekt erhalten in der in vitro Kulturen. Darüber hinaus zeigte das Team durch die Berechnung der mutationalen Belastung und den Vergleich der Variant Allele Frequenzen (VAFs), dass die klonale Architektur der Adenome während der anfänglichen Passage hochgradig stabil blieb, ohne signifikante Ansammlung von kultivierungsbedingten Artefakten.
Fazit
Durch die Verankerung ihrer Modellvalidierung mit hochauflösendem WES hat das Forschungsteam definitv bewiesen, dass ihre kolorektalen Adenom-Organoide genetisch genaue Darstellungen der primären Erkrankung waren. Diese genomische Zertifizierung ermöglichte es ihnen, zuversichtlich mit Hochdurchsatz- und hochgradigen Wirkstoffscreenings fortzufahren, in dem Wissen, dass ihre Ergebnisse biologisch relevant für die Pathologie der Patienten sein würden.
Unabhängige Forschung zur Charakterisierung patientenabgeleiteter Adenom-Organoide. Adaptierte von Luo Z, et al. (2023), BMC Medizin. Quelle: Einrichtung einer großangelegten biobank für patientenabgeleitete hochriskante kolorektale Adenom-Organoide... Die veröffentlichte Studie war unabhängig von CD Genomics.
Fallstudie 2: Verfolgung der klonalen Dynamik in Pankreatischen Duktalen Adenokarzinom (PDAC) Organoiden
HintergrundDas duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist bekannt für sein dichtes Stroma und die komplexe Mutationslandschaft. Forscher, die PDAC-Organoide entwickeln, haben häufig Schwierigkeiten zu bestätigen, ob ihre Kulturen tatsächlich die malignen Epithelzellen repräsentieren oder lediglich normale duktale Zellen sind, die die Tumorzellen übertroffen haben. in vitro.
MethodologieEine Forschungsgruppe reichte patientenangepasste Triad-Proben (Blut, primärer PDAC-Tumor und Passage 5 Organoide) bei CD Genomics für eine hochauflösende WES (300X Abdeckung) ein. Das Ziel war es, die maligne Identität zu bestätigen und zu beurteilen, ob die KRAS und SMAD4 Die im klinischen Biopsiebericht des Patienten identifizierten Mutationen wurden beibehalten.
ErgebnisseDie WES-Pipeline hat erfolgreich über 40.000 vererbte Keimbahnvarianten herausgefiltert. Die somatische Variantenbestimmung identifizierte die genaue KRAS G12D Treibermutation im Organoid-Modell. Interessanterweise zeigte die VAF-Korrelationsanalyse, dass ein kleiner Subklon, der eine SMAD4 Löschung (die nur 8% VAF im Primärtumor betrug) hatte sich auf 65% VAF in der Organoidkultur ausgeweitet, was auf eine starke hinweist. in vitro Selektion Vorteil für diese spezifische Subpopulation.
FazitWES bestätigte nicht nur die maligne Identität des PDAC-Organoids (was bewies, dass es sich nicht um ein normales Gewebewachstum handelte), sondern die tiefgreifende subklonale Analyse offenbarte eine dynamische klonale Expansion. Die Forscher konnten ihre Interpretation des Arzneimittel-Screenings anpassen, da sie wussten, dass ihr Modell stark angereichert war für die SMAD4defizienter Subklon.