Überblick über die DNA-Sequenzierung

Genomsequenzierungstechnologieauch bezeichnet als DNA-Sequenzierungstechnologie, umfasst die Erfassung der Nukleotid-Anordnung eines gezielten DNA-Segments. Im Bereich der wissenschaftlichen Forschung stellt die Ermittlung der Sequenz eines Ziel-DNA-Fragments den grundlegenden Schritt für nachfolgende molekularbiologische Untersuchungen und genetische Modifikationen dar. Da sich die Landschaft der Genomik, insbesondere angetrieben durch Fortschritte wie Genomweite Assoziationsstudien (GWAS), reift weiter, hat die Antizipation von Krankheitsrisiken und die frühzeitige Diagnose durch genomische Ansätze sich als eine entscheidende Richtung in der klinischen Medizin herauskristallisiert. Darüber hinaus betont die Präzisionsmedizin, die als ein Schlüsselweg in der Zukunft der klinischen Medizin angesehen wird, die unbestreitbare Bedeutung der Technologie der genomischen Sequenzierung innerhalb ihres Paradigmas. Jede Evolution in der Sequenzierungstechnologie stellt einen monumentalen Anstoß für verschiedene Bereiche dar, einschließlich der genomischen Forschung, der Krankheitsbehandlung und der pharmazeutischen Entwicklung. Diese transformativen Fortschritte tragen kontinuierlich zur Beschleunigung und Bereicherung unseres Verständnisses und unserer Fähigkeiten in der Genomik bei und gestalten letztendlich die Landschaft der medizinischen Forschung und Praxis.

Entwicklung der Sequenzierungstechnologie

Die Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologie war bemerkenswert seit ihrer Einführung mit der ersten Generation der Sanger-Methode. Basierend auf unterschiedlichen Prinzipien kann der Fortschritt der Sequenzierungstechnologie in drei Phasen unterteilt werden: erste Generation Sanger-Sequenzierungzweite Generation Hochdurchsatz-Sequenzierungund dritte Generation Einzelmolekül/Nanoporen-SequenzierungJede Generation hat ihre eigenen Stärken und Schwächen; daher variieren ihre Anwendungen entsprechend. Derzeit wird der Sequenzierungsmarkt dominiert von Next-Generation Sequenzierung (NGS), aber es ermöglicht auch das Zusammenleben von Langzeit-Sequenzierung. (Langzeit-Sequenzierung) Technologien.

Sanger-Sequenzierung

die erste Generation der Sequenzierungstechnologien umfasste die Sanger-Doppel-Deoxynukleotid-Terminalterminierungsmethode und die chemische Abbautechnik, die von Alan Maxam und Walter Gilbert entwickelt wurde. Diese bahnbrechende Technologie ermöglichte die automatisierte Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen. Ab 1977 konnte die Sequenzierung der ersten Generation eine Sequenzlänge von 1.000 Basenpaaren (bp) mit einer hohen Genauigkeitsrate von 99,99 % erreichen und stellte ein fortschrittliches Werkzeug für die molekularbiologische Forschung dar. Über einen längeren Zeitraum wurde diese Methode aufgrund ihrer langen Leselängen, hohen Empfindlichkeit und Genauigkeit hoch geschätzt und spielte eine entscheidende Rolle im frühen Human-Genome-Projekt. Allerdings, Sanger-Sequenzierung hat seine Einschränkungen; obwohl die Technik längere Reads im Vergleich zur nachfolgenden Sequenzierung der zweiten Generation liefert, kann jeder Sequenzierungslauf nur eine Sequenz von etwa 700-1000 Basenpaaren Länge erzeugen, da die Länge jedes Reads die Grenze seiner Einzel-Lauf-Sequenzierungskapazität darstellt. Angesichts der Tatsache, dass ein separates Primer-Design für jede Sequenzierung erforderlich ist, haben die relativ niedrigere Durchsatzrate, der zeitaufwändige Prozess und die höheren Kosten der Sanger-Sequenzierung, wenn man mit der weit verbreiteten Nachfrage nach genomweiten Sequenzierungen in der modernen Forschung und klinischen Anwendungen konfrontiert ist, ihre Perspektiven für großangelegte Anwendungen eingeschränkt.

Allmählich wurde die Dominanz der Sequenzierung der ersten Generation durch die aufkommende Sequenzierung der zweiten Generation (Next Generation Sequencing oder NGS) ersetzt. Dennoch weist die Technologie der ersten Generation nach wie vor bestimmte Vorteile auf, wie hohe Genauigkeit, längere Reads und die Eliminierung der Notwendigkeit zur Sequenzassemblierung. Daher behält sie in einigen Forschungsbereichen ihre Bedeutung. Beispielsweise spielt sie eine entscheidende Rolle in Bereichen wie Plasmidsequenzierung, Validierung von Mutationsstellen, Sequenzierung kleiner bakterieller Genome, Sequenzierung von Enden bakterieller künstlicher Chromosomen und Sequenzierung repetitiver Sequenzen.

Abbildung 1 Prinzip der Sanger-Sequenzierung (Michel G Gauthier 2007)

Next-Generation Sequencing

Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS), auch bekannt als Next-Generation Sequencing (NGS) oder die Sequenzierung der zweiten Generation umfasst hauptsächlich die 454-Technik von Roche, die HiSeq-Technik von Illumina, die SoLiD-Technik von ABI und die Ion Torrent-Technik von Thermo Fisher. Sowohl die 454- als auch die SoLiD-Techniken wurden aufgrund ihrer komplexen Natur, hohen Kosten und inkonsistenten Sequenzierungsstabilität eingestellt. Die in der aktuellen Marktlandschaft weit verbreiteten NGS-Technologien stammen hauptsächlich von Illumina und Thermo Fisher; Unternehmen wie BGI fördern ebenfalls NGS-Produkte.

Im Jahr 2008 fusionierten Applied Biosystems (ABI) und Invitrogen, um Life Technologies zu gründen, das 2010 und 2012 die Sequenzierer Ion Torrent und Ion Proton auf den Markt brachte. Bis 2014 wurde Life Technologies von Thermo Fisher Scientific für beträchtliche 13,6 Milliarden Dollar übernommen. Infolge dieser Transaktion hat Thermo Fisher die Kernprodukte von Life Technologies in großen Mengen hergestellt und energisch beworben, insbesondere deren klinische Sequenzierer.

In der Zwischenzeit wurde 2014 Life Technologies von der Thermo Fisher Corporation für eine beträchtliche Summe von 13,6 Milliarden Dollar übernommen. Diese bedeutende Akquisition führte zu einer Umstellung der Hauptprodukte von Life Technologies. Ursprünglich für Forschungszwecke verwendet, wurden diese Sequenzierungsgeräte in klinische Sequenzierer umgewandelt, massenhaft produziert und nahtlos in das Sortiment von Thermo Fisher integriert. Die Entscheidung von Thermo Fisher, diese Produkte zu fördern, war ein Beweis für ihr Potenzial, die Landschaft der klinischen Genomik zu verändern.

Das Aufkommen der 454-Sequenzierungstechnologie hat dazu beigetragen, die Mängel der Sequenzierungsmethoden der ersten Generation zu mildern. Sie weist charakteristische Merkmale wie hohe Durchsatzleistung (mit einer durchschnittlichen Ausbeute von bis zu 0,5 G), Kosten-Effizienz und zeitsparende Prozesse auf. Allerdings treten beim Sequenzieren von Sequenzen, die reich an repetitiven Nukleotidstrukturen oder Sequenzen sind, die Sanger-Sequenzierung Die Methodik erweist sich als geeigneter.

Die Solexa-Sequenzierungstechnologie gewann an Bedeutung während einer Phase, die durch schnelle Fortschritte im Bereich der Genchips gekennzeichnet war, und hat seitdem umfangreiche Anwendungen in der Sequenzierung von Tieren, Pflanzen und Mikroben gefunden. Ähnlich wie die 454-Sequenzierungstechnologie basiert Solexa auf dem Prinzip der "Sequenzierung durch Synthese" und bietet Vorteile wie die Beseitigung der Notwendigkeit zur Probesynthese und ein Verständnis der Genomsequenz des Modellorganismus, was die Abläufe vereinfacht.

Darüber hinaus verwendet diese Technologie integrierte Chips während der Vorbereitungsphase, um DNA-Moleküle mit spezifischen Primern zu verbinden, was deren spezifische Bindung an den Chip erleichtert. Dies führt zu "monoklonaler" DNA und verleiht der Technik Eigenschaften wie hohe Durchsatzraten (mit einem durchschnittlichen Output von bis zu 30G), ein hohes Maß an Sensitivität und verbesserte Genauigkeit.

Die SOLiD (Supported Oligo Ligation Detection) Sequenzierungsmethode stellt einen abweichenden technologischen Ansatz im Gegensatz zu den zuvor genannten Strategien dar. Ihr zugrunde liegendes Prinzip basiert auf Ligation anstelle von PCR-Amplifikation. Die gezielte DNA-Sequenz wird durch mehrere Runden der Sequenzierung gewonnen, nachdem die Ziel-DNA mit oktabasierten fluoreszierenden Sonden gebunden wurde. Durch die Eliminierung des "Synthese"-Schrittes minimiert diese Methode effektiv Fehlpaarungsphänomene während der Basenpaarung und legt somit die Grundlage für eine verbesserte Genauigkeit.

Im Vergleich zu Sanger-Sequenzierung, Next-Generation Sequencing (NGS) hat in Bezug auf den Durchsatz einen deutlichen Durchbruch erzielt und die Betriebsweise der vorherigen Generation überwunden, die das Sequenzieren auf jeweils ein DNA-Stück beschränkte. Ein einzelner Lauf von NGS kann gleichzeitig Hunderttausende bis Millionen von Nukleotidsequenzen enthüllen, wodurch die für die genomweite Sequenzierung benötigte Zeit erheblich verkürzt wird. Darüber hinaus ist die weitverbreitete Anwendung der NGS-Technologie maßgeblich auf die gesenkten Kosten zurückzuführen.

Langzeit-Sequenzierung

Der Langzeit-Sequenzierung Techniken, bekannt als PacBios Single Molecule Real-time (SMRT) Technologie und Oxford Nanopore Technologies' Nanopore-Technologie, beheben Mängel, die mit Next-Generation Sequencing (NGS). Trotz der Revolution in der Durchsatzleistung, die NGS bietet, stellen die inhärenten Einschränkungen hinsichtlich der kurzen Lese-längen Hindernisse bei der Sequenzierung und Assemblierung von hoch repetitiven Sequenzregionen dar. Darüber hinaus erfordert die Gewinnung genauer Gen-sequenzinformationen aus NGS nicht nur eine hohe Sequenzierungsabdeckung, sondern auch präzise Techniken zur Sequenzassemblierung.

Langzeit-Sequenzierung Technologien bieten eine Lösung für diese Einschränkungen, indem sie Sequenzierungsergebnisse für individuelle lange Sequenzen de novo bereitstellen. Diese Technologien, auch bekannt als Einzelmolekül-Sequenzierung Techniken, die dieses Kunststück erreichen, indem sie Sequenzierungen an einzelnen langen Sequenzen durchführen und damit die Notwendigkeit der PCR-Amplifikation des Zielmoleküls umgehen. Das Ergebnis ist, dass diese Methoden direkt Nukleinsäuresequenzinformationen liefern, die sich über Zehntausende von Basenpaaren erstrecken, während sie eine hohe Durchsatzrate gewährleisten.

Im Oktober 2015 stellte Pacific BioSciences (PacBio) das Sequel-System vor, einen Sequencer der dritten Generation, der auf ihrer Single Molecule Real-Time (SMRT) Technologie basiert. Das Sequel zeichnet sich durch einen Metallchip aus, der mit zahlreichen Zero-Mode-Wellenleitern (ZMWs) ausgestattet ist – tatsächlich kreisförmige Öffnungen mit einem Durchmesser von nur 100 nm – die DNA-Polymerase, die zu sequenzierende DNA-Probe und fluoreszenzmarkierte Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) enthalten. Die ZMW-Kanäle bündeln das relevante Licht intensiv in eine winzige Detektionszone am Boden, die dann in der Lage ist, die unterschiedliche Fluoreszenz jedes dNTP-Typs zu registrieren und somit die Basensequenz der Nukleinsäure zu bestimmen.

Die Wirksamkeit der SMRT-Technologie hängt von drei Schlüsselkomponenten ab: 1) DNA-Polymerase, wobei die Länge des sequenzierten Reads hauptsächlich von der enzymatischen Aktivität der Polymerase abhängt. Da diese anfällig für Schäden durch den zur Detektion verwendeten Laser ist, stellt dies eine wichtige Überlegung dar. 2) Die Markierung der dNTPs mit fluoreszierenden Entitäten am 3'-Phosphatende. Während die DNA-Synthese voranschreitet, führt das Brechen der 3'-Phosphodiesterbindung zur Freisetzung der markierten Entitäten, die zur Detektion verwendet werden, wodurch sterische Hinderung minimiert und eine ununterbrochene DNA-Synthese begünstigt wird. Dies gewährleistet die Verlängerung der Read-Länge. 3) Die unterscheidende Funktion der Öffnungen der ZMWs, die sich als nützlich erweist, um die Reaktionssignale im Rauschen starker umgebender Fluoreszenz zu erkennen. Ihre strukturelle Stärke wird durch den begrenzten Energiebereich aufgrund des Laserlichts betont, das nicht in der Lage ist, die winzigen Öffnungen zu durchdringen, um den oberen Lösungsbereich zu erreichen. Dies stellt sicher, dass fluoreszierende Signale ausschließlich aus der kleinen Reaktionszone stammen, während Monomere außerhalb der Pore im Dunkeln bleiben – wodurch die Hintergrundfluoreszenz effektiv minimiert wird.

Nanopore-Sequenzierungstechnologie (Bildquelle Nanopore)

Gleichzeitig brachte Oxford Nanopore Technologies ihren Sequencer der dritten Generation, den MinION, auf den Markt, der auf der Nanopore-Technologie basiert. Die Betriebsmodelle umfassen eine spezielle Lipid-Doppelschicht mit Elektroden auf einer Seite, die über einem Nanopore positioniert ist. Diese Doppelschicht enthält verschiedene Nanoporen, die aus Alpha-Hämolysin-Proteinen bestehen, wobei jeder eine Nukleinsäure-Exonuklease beherbergt. Die DNA-Vorlage, die in das Nanopore eindringt, bindet an die Exonuklease, die koordiniert, um die DNA-Basen, die durch das Nanopore wandern, nacheinander zu durchtrennen. Wenn jede Base hindurchgeht, erzeugt sie eine einzigartige Stromblockade. Zusammen ermöglichen die Erkennung und Interpretation dieser winzigen Stromvariationen die Bestimmung des entsprechenden Basistyps, was zur Aufklärung der gesamten Sequenz des DNA-Moleküls führt.

Tabelle 1 Vergleich der Vor- und Nachteile von Next-Generation-Sequenzierung und Langlesesequenzierung

In den letzten Jahren wurde eine starke Akzeptanz von Langzeit-Sequenzierung Technologien in der genomischen Analyse. Diese Methoden haben den Fortschritt der genomischen Erforschung und Entschlüsselung erheblich vorangetrieben und wesentliche Fortschritte erzielt. Long-Read-Sequenzierung, die direkte Sequenzierung einzelner DNA-Moleküle, ermöglicht längere Leseabschnitte und bietet eine hohe Sensitivität, templatefreie Assemblierung sowie die direkte Sequenzierung von DNA-Methylomen und RNA. Allerdings bestehen Einschränkungen. Präzise operationale Kontrollen sind erforderlich, die Kosten sind erheblich, ausgereifte bioinformatische Verarbeitungssoftware ist rar, und die Fehlerraten sind hoch. Besonders in kosten- und präzisionsintensiven Kontexten, wie der Präzisionsmedizin und der frühen Krebsfrüherkennung, bleibt die praktische Anwendung dieser Technologien eingeschränkt.

Im Gegensatz dazu, während Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat Nachteile, einschließlich der Abhängigkeit von vorhandenen Vorlagen, kurzer Leselängen und Sequenzverzerrungen. Dennoch machen sein ausgereiftes System, die hohe Durchsatzkapazität, hohe Sensitivität, hohe Auflösung und die niedrigen Kosten es zugänglicher und weit verbreitet in verschiedenen Laboren. Tatsächlich ist die Beziehung zwischen Langzeit-Sequenzierung und NGS ist nicht durch Wettbewerb oder Substitution gekennzeichnet, sondern vielmehr wirken diese Technologien als komplementäre Vermögenswerte.

Bei der Sequenzierung von mikrobiellen Resistenzgruppen sind die meisten Resistenzgene auf Plasmiden lokalisiert, von denen viele in vorläufigen Forschungen nicht erfolgreich sequenziert werden konnten. Eine ausschließliche Abhängigkeit von NGS kann die Plasmidsequenzen, die Resistenzgene enthalten, nicht genau erfassen. An dieser Stelle kann die Langzeit-Sequenzierung genutzt werden, um die Einzelmolekül-DNA des Plasmids direkt zu sequenzieren. Aufgrund der geringen Genauigkeit und Präzision der Langzeit-Sequenzierung ist es jedoch oft notwendig, nach Erhalt der Plasmidsequenz NGS zu verwenden, um eine große Anzahl hochpräziser Kurzlesungen zur Vergleichserstellung zu generieren, was zu einer genaueren Plasmidsequenz führt.

Da die Kosten für Long-Read-Sequenzierung weiterhin sinken, werden immer mehr Szenarien die Kombination von NGS- und Long-Read-Sequenzierungstechnologien erfordern, um in zukünftigen klinischen Anwendungen präzise unbekannte Sequenzen zu erhalten. Diese beiden Technologien können sich gegenseitig ergänzen und ihre jeweiligen Anwendungswerte gegenseitig steigern.

NGS-Technologie: Prinzipien und Prozesse

Im Jahr 2005 wurde das Genome Sequencer 20 (GS 20) System von der Firma 454 eingeführt und leitete die Ära des "Sequenzierens durch Synthese" (SBS) ein. Heute ist die SBS-Methodik grundlegend für die Ion Torrent-Plattform von Thermo Fisher und die Next-Generation-Sequencing (NGS) Plattformen von Illumina.

Die Essenz der SBS-Technologie ist plattformübergreifend und besteht hauptsächlich aus drei Schlüsselschritten: 1) Bibliotheksvorbereitung, bei der lange DNA-Proben in kurze Fragmente zerlegt werden, um eine DNA-Bibliothek zu erstellen. Während der Fragmentierung werden Adapter an beiden Enden der kurzen Fragmente angebracht, um die anschließende Fixierung der Fragmente zu erleichtern, wobei die Adapter als Primer-Bindungsstellen für Amplifikationsprozesse dienen; 2) Beladung, bei der die DNA-Bibliothek auf ein Sequenzierungsmittel verteilt und amplifiziert wird. Ziel dieses Schrittes ist es, die Anzahl dieser kurzen Fragmente zu vervielfältigen, um eine ausreichende Menge identischer kurzer Fragmente zu erzeugen, die die Signale in der anschließenden Sequenzierungsphase verstärken. Dies ermöglicht die Erfassung von Sequenzinformationen; 3) Sequenzierung, bei der die amplifizierte doppelsträngige DNA denaturiert wird, um einzelsträngige DNA zu bilden, die dann als Vorlage dient. Die Integration einzelner Nukleotide während jeder Syntheserunde wird überwacht und die Sequenzinformationen werden aus der Aufzeichnung von Signalen (z. B. Fluoreszenz, pH-Änderungen) abgeleitet.

Unterschiede zwischen den SBS-NGS-Produkten, die von verschiedenen Unternehmen angeboten werden, zeigen sich in Aspekten wie der Probenverarbeitung, der Signalerkennung und der Fragmentfixierung.

Die Standardverfahren für Next-Generation Sequencing Technologien umfassen Folgendes:

Für die Sequenzierungstechnologie 1.3.1454 beginnt der Prozess mit der Fragmentierung der Probe, gefolgt von der Auswahl von Fragmenten mit einer Länge zwischen 500 und 800 Basenpaaren (bp). Anschließend werden Adapter an beide Enden dieser Fragmente angefügt. Die adapter-ligierten DNA-Fragmente werden mit magnetischen Perlen kombiniert, in einem Wasser-in-Öl-System verkapselt und mit einer Reaktionsplatte verbunden. Das System wird dann in eine PTP-Platte integriert, wo die vier Basistypen nacheinander für die Sequenzierung hinzugefügt werden. Schließlich werden die Signale überwacht und Sequenzdaten gesammelt.

Die Solexa-Sequenzierungstechnologie beginnt ähnlich mit der Fragmentierung der Proben. Anschließend wird eine Bibliothek erstellt und auf einem Chip, der mit Primern versehen ist, amplifiziert, um einzelne Klone zu erzeugen. Das System führt dann vier unterschiedlich markierte dNTPs zusammen mit modifizierter DNA-Polymerase ein. Die gesammelten fluoreszierenden Signale werden aufgezeichnet, um Sequenzdaten zu extrahieren.

Die Solid-Sequenzierungstechnologie beginnt mit der Fragmentierung der Probe und dem Anbringen von Adaptern an beiden Enden dieser Fragmente. Darauf folgt die PCR-Amplifikation und die Anreicherung mit Mikropartikeln. Magnetperlen werden dann hinzugefügt, um die Hybridisierung zwischen den Adaptern und spezifischen Adaptersequenzen auf der Vorlage zu ermöglichen. Vier unterschiedlich gefärbte fluoreszenzgefärbte Dual-Base-Sonden werden mit der Probe verbunden. Der letzte Schritt besteht darin, fluoreszente Signale zu detektieren und Sequenzdaten zu sammeln.

Aufbauend auf den oben genannten Beschreibungen haben wir die Merkmale von drei Technologien der zweiten Generation der Sequenzierung gegenübergestellt. Sanger-Sequenzierung Technologie (Tabelle 1). Es wurde auch ein horizontaler Vergleich der Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation durchgeführt (Tabelle 2). Es kann geschlossen werden, dass im Vergleich zur Sequenzierung der ersten Generation (Sanger-Sequenzierung) alle Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation eine hohe Durchsatzrate, hohe Genauigkeit und Kosteneffizienz aufweisen.

Tabelle 2: Vergleich der Sequenzierungstechnologien

Tabelle 3: Vergleich von drei Next-Generation-Sequenzierungstechnologien

Datenqualitätskontrolle für NGS

Der Sequenzierungsprozess bei der Synthese durch Sequenzierung (SBS) beinhaltet ein bemerkenswertes Problem: Während die synthetisierte Kette sich verlängert, nimmt die Effizienz der DNA-Polymerase ab, was gleichzeitig ihre Spezifität verringert. Dies führt zu einem allmählichen Anstieg der Fehlerquote bei der Basensynthese, während die Sequenzierung voranschreitet, was die Bedeutung der Qualitätskontrolle (QC) hervorhebt in Next-Generation Sequencing (NGS)-Daten für nachfolgende Analysen. Dies wird auch zu einem entscheidenden Identifikator, wenn es darum geht, die Konsistenz und Qualität von Sequenzierungsinstrumenten zu bewerten.

Im Rahmen des QC-Frameworks für NGS-Ausgaben sind die folgenden Parameter von größter Bedeutung:

1) Q20, Q30 und Q40: Bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung von Genen wird jeder Base ein Qualitätswert (Q) zugewiesen; je höher der Q-Wert, desto geringer die Wahrscheinlichkeit einer fehlerhaften Basismessung, berechnet nach der Formel Q = -10logP. Q20 und Q30 repräsentieren den Anteil der Basen mit Qualitätswerten, die gleich oder größer als 20 bzw. 30 sind.

2) Sequenzierungstiefe: Bezieht sich auf das Verhältnis der Gesamtzahl der durch Sequenzierung erhaltenen Basen zu der Größe des Zielgenoms. Wenn die Gen-Größe 2M beträgt und die Sequenzierungstiefe 10X ist, beträgt die insgesamt erhaltene Datenmenge 20M. Daher wird die Sequenzierungstiefe als Gesamtdaten (20M) / Genomgröße (2M) = 10X berechnet.

3) Sequenzierungsabdeckung: Sie definiert den Anteil der aus der Sequenzierung erhaltenen Sequenzen im Verhältnis zum gesamten Genom. Angesichts der Anwesenheit komplexer Strukturen, wie Abschnitte mit hohem GC-Gehalt und sich wiederholenden Sequenzen im Genom, würden die nach der Sequenzierung zusammengefügten Sequenzen nicht alle Bereiche abdecken. Die bereiche ohne Sequenzen werden als "Lücken" bezeichnet. Wenn beispielsweise die Sequenzierungsabdeckung eines bakteriellen Genoms 98% beträgt, bleiben 2% des Sequenzbereichs unsequenziert.

Derivativen Technologien für NGS

Obwohl Next-Generation Sequencing (NGS) allein liefert nur DNA-Sequenzen, kann jedoch in Kombination mit verschiedenen Probenverarbeitungstechniken (wie in vitro Transkriptionsumkehr, Sequenzfang und Bisulfitbehandlung) eine Vielzahl von Informationen erzeugen, einschließlich gezielter Transkriptome, Methylome und Metagenome. Die Korrelation dieser Techniken wird durch nachfolgende bioinformatische Analysen weiter erleichtert. Mit der Hochdurchsatzgenauigkeit, die NGS bietet, sind eine Vielzahl klinischer Perspektiven absehbar. Es bietet potenzielle Anwendungen in verschiedenen klinischen Szenarien wie Krebsfrüherkennung, genetischer Testung, präziser Medizin und Pflanzenzüchtung und erweitert somit erheblich den Umfang seiner Nützlichkeit (siehe Tabelle 4).

Tabelle 4. Aus NGS-Sequenzierung abgeleitete Technologien und ihre klinischen Anwendungen

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